Roteiro Contagem de Coliformes Totais e Termo

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ROTEIRO CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E
TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS – TÉCNICA NMP
Coliformes totais: compõem os grupos de bactérias gram-negativas que podem ser aeróbicas ou anaeróbicas (isto dependerá do ambiente e da bactéria), não originam esporos e fermentam a lactose, produzindo ácido e gás em temperaturas entre 35 e 37°C.
Coliformes fecais ou termotolerantes: são também conhecidos como “termotolerantes” por suportarem uma temperatura superior à 40°C, convivem em simbiose com humanos, bois, gatos, porcos e outros animais de sangue quente. São excretados em grande quantidade nas fezes e normalmente não causam doenças (quando estão no trato digestivo). Neste grupo está presente a bactéria gram-negativa Escherichia coli, e ao se ingerir alimentos por ela contaminados podem causar de gastroenterites a infeções generalizadas.
FUNDAMENTOS 
Prova presuntiva: 
Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras em caldo LST (Caldo Lauril Sulfato Triptose) e incubação a 36± 0,2 ºC de 24 a 48 horas. Os tubos com formação de gás são separados e submetidos as provas confirmativas de coliformes totais e fecais.
Prova confirmativa para coliformes totais: 
A confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo VB (verde brilhante bile) com 2% lactose e posterior incubação a 36 ± 2ºC. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composição bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante) responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos. 
Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: 
A confirmação da presença de coliformes termotolerantes é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo EC e posterior incubação em temperatura seletiva de 45 ± 0,2ºC, em banho-maria com agitação ou circulação de água. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificação. 
PREPARO DA AMOSTRA 
· Pesar assepticamente 25 ± 0,2g da amostra ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra. 
· Adicionar 225 mL de água peptonada 0,1% e homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”. Esta é a diluição 10-1. 
· Semear cada uma das diluições preparadas em cada uma das baterias de 3 tubos de caldo LST.
· Incubar os tubos a 36 ± 2°C por 24 a 48 horas. 
· A presença de coliformes totais é confirmada pela formação de gás 
· Anotar o resultado obtido para cada diluição utilizada. 
Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas. 
Coliformes totais
Semear uma alçada de cada tudo positivo de LST para o caldo lactosado VB e incubar a 36 ± 2°C por 24 a 48 horas 
Coliformes termotolerantes 
Semear uma alçada de cada tudo positivo de LST para o caldo EC e incubar a 45 ± 0,2°C, por 24 a 48 horas em banho maria com agitação. A presença de coliformes termotolerantes é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada. 
Os resultados de coliformes totais e termotolerantes são expressos em número mais provável por g ou ml conforme tabela de NMP.
Tabela – Número mais provável (NMP) por grama ou ml.