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26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 1/12 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos Microbiologia e Segurança de Alimentos 1. Benefícios E Malefícios Da Presença De Fungos E Leveduras Em Alimentos Os fungos e as leveduras são agrupados no reino Fungi. Este grupo inclui desde fungos microscópicos, aqueles que possuem uma única célula (unicelulares), como é o caso das leveduras, até formas pluricelulares, como os fungos filamentosos e os cogumelos. Eles estão presentes em todos os ambientes terrestres e apresentam uma grande variação de formas e tamanhos. Os fungos são formados por uma estrutura básica denominada hifa que, em conjunto, forma um arranjo mais complexo denominado micélio. As hifas podem ser septadas (divididas em células intercomunicadas através de poros) e não septadas com os núcleos dispersos ao longo de toda hifa. O micélio formado a partir das hifas apresenta duas funções básicas e distintas: a fixação do fungo filamentoso ao substrato e promoção da reprodução. Portanto, o micélio dos fungos filamentosos se torna uma ferramenta prática para a diferenciação entre espécies diferentes, pois ele é responsável pelo aspecto das colônias que se formam, podendo ter aspecto cotonoso, aveludada, gelatinosa, úmidas, ser secas e compactas, todas com variadas colorações. Geralmente, uma análise macroscópica da colônia formada é suficiente para identificar, pelo menos, o gênero ao qual fungos filamentosos pertencem. Fungos Penicillium que causam deterioração dos alimentos e são utilizados para a produção do primeiro antibiótico penicilina. Ilustração 3D mostrando esporos conídios e conidióforos. https://cead.uvv.br/conteudo/wp-content/uploads/2020/02/aula_micali_top04_img01-768x512.jpg 26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 2/12 Fungos filamentosos são menos exigentes do que leveduras e bactérias em relação à umidade, pH, temperatura e nutrientes. Normalmente, crescem em alimentos ricos em carboidratos e ácidos. Como são, em grande maioria, aeróbios, eles crescem apenas na superfície do alimento em contato com o ar e a assimilação de nutrientes é bastante acelerada. Os fungos não produzem seu próprio alimento, portanto, são organismos heterótrofos. Para sobreviver, eles se alimentam de matéria orgânica, viva ou morta. As espécies saprófagas possuem um papel importante na decomposição de animais e vegetais, pois se alimentam de matéria orgânica morta. Eles podem se reproduzir de maneira assexuada ou sexuada. A reprodução assexuada ocorre por brotamento, fragmentação ou esporulação (produção de esporos), e a sexuada, através do encontro de indivíduos de sexos diferentes. O corpo das espécies pluricelulares é formado pelo o micélio, corresponde a um emaranhado de filamentos longos e microscópicos chamados de hifas. A segunda parte, conhecida como corpo de frutificação, é a estrutura reprodutiva destes fungos. Alguns fungos filamentosos crescem em pães velhos, ou frutas; eles são conhecidos como mofo. A parte que fica na área externa corresponde ao corpo de frutificação e o componente que fica no interior é o micélio. Você sabia que a maioria dos antibióticos utilizados são produzidos por bactérias do gênero Streptomyces e alguns por fungos do gênero Penicilliume Cephalosporium? Esses compostos podem ter ação antibacteriana, antifúngica, antiviral e antiblástica. Mandarim com mofo. A preseça de fungos microscópicos Penicillium, que causam deterioração dos alimentos e produzem antibióticos penicilina. https://cead.uvv.br/conteudo/wp-content/uploads/2020/02/aula_micali_top04_img02-768x512.jpg 26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 3/12 Leveduras são seres unicelulares, podem ter formato esférico, ovoide, cilíndrico ou triangular. De modo geral, as leveduras necessitam, para o seu crescimento e metabolismo, de umidade superior à da exigida pelos bolores e inferior à exigida pelas bactérias, com faixa de temperatura ideal para o crescimento em torno de 25 ºC e 30ºC. O crescimento é favorecido em meio ácido (pH ácido). As leveduras fermentadoras se multiplicam melhor em anaerobiose, tendo açúcar como fonte de energia, entretanto, existem leveduras que se multiplicam em aerobiose. Muitos dos organismos do reino Fungi são comestíveis e utilizados na alimentação humana. É o caso dos cogumelos, como o champignon e o shitake. Outros são utilizados na produção de alimentos, como o pão, e em bebidas alcoólicas, como o vinho e a cerveja. Alguns representantes dos gêneros são produtores de toxinas, como, por exemplo, o fungo toxigênico Claviceps purpurea. Outros são empregados em processos industriais, na produção de queijos e até mesmo na produção de antibióticos. Na fabricação do pão, são utilizadas as leveduras (Saccharomyces cerevisiae), também chamadas de fermento. A fermentação é um dos processos de produção mais antigos que existem. A produção de bebidas e pães ocorre por fermentação alcoólica a partir do açúcar. Nos pães, ocorre produção de gás carbônico junto com o álcool. O gás carbônico, liberado neste processo, cria pequenas bolhas de gás, que fica retido no interior da massa, fazendo com que o pão cresça e fique fofinho. Fungos e leveduras também têm sido utilizados na produção de ingredientes alimentícios, como acidulantes, enzimas, sabores, vitaminas, corantes e ácidos graxos poli-insaturados, em substituição à síntese química ou outras formas de obtenção. Você seleciona uma cepa que produz aquele ingrediente de interesse e coloca para multiplicar; depois, coleta o ingrediente. Avanços em técnicas laboratoriais para a seleção cepas não toxigênicos, bem como o conhecimento crescente sobre a regulação da biossíntese e as possibilidades da engenharia genética permitiram a obtenção de maiores rendimentos de produtos de qualidade alimentar seguros. Esses bioprocessos são incentivados pela conscientização dos consumidores quanto a ingredientes de rótulos limpos, bem como interesses em relação à sustentabilidade. No artigo abaixo, foi feito um estudo pra verificar a ocorrência de fungos na dieta de bovinos leiteiros em São Paulo. Acesse o link para ter acesso. Saccharomyces cerevisiae https://cead.uvv.br/conteudo/wp-content/uploads/2020/02/aula_micali_top04_img03-768x512.jpg 26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 4/12 Artigo: Clicando aqui você lê o estudo sobre a ocorrência de fungos e aflatoxina B1 na dieta de bovinos leiteiros em São Paulo. 2. Principais Fungos E Leveduras Em Alimentos Dentre os gêneros de fungos, podemos destacar: Aspergillus oryzae, A. flavus, A.sojae, Cladosporiu herbarum, C. cladosporoides, Mucor pussilus, M. racemosus, M. rouxii, Penicillium expansum, P. italicum, P. camembertii, P. roquefortii, Rhiizopus stolonifer, Claviceps purpurea e Fusarium. Os fungos podem ser benéficos ou maléficos para a produção de alimentos. Claviceps purpurea é toxigênico, ou seja, um exemplo de um fungo produtor de toxina. Os benefícos são empregados em processos industriais na produção de queijos roquefort, camembert, brie e gorgonzola, como os fungos Penicillium italicum, Penicillium camembertii, Penicillium roquefortii e até mesmo na produção de antibióticos. As cepas de mofo pertencentes às espécies Aspergillus oryzae e Aspergillus sojae são altamente valorizadas como moldes de koji na preparação tradicional de alimentos fermentados, como misô, saquê e shoyu, e como hospedeiros de produção de proteínas nos modernos processos industriais. A. oryzae eA. sojae são parentes dos fungos selvagens Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus. Todas as quatros espécies são classificadas no grupo A. flavus. As cepas do grupo A. flavus são caracterizadas por um alto grau de similaridade morfológica. As espécies de mofo de Koji são, geralmente, percebidas como não-tóxicas, enquanto que os mofos selvagens estão associados às aflatoxinas cancerígenas. Queijo azul Gorgonzola. http://www.scielo.br/pdf/pvb/v35n1/0100-736X-pvb-35-01-00023.pdf https://cead.uvv.br/conteudo/wp-content/uploads/2020/02/aula_micali_top04_img04-768x580.jpg 26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 5/12 Leveduras transformam o açúcar em álcool através do processo de fermentação. Alguns gêneros de leveduras importantes para a microbiologia de alimentos são: Cândida tropicalis, Cryptococcus, Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces, Zigosaccharomyces, dentre outras. 3. Micotoxinas Os fungos filamentosos, principalmente das espécies que pertencem aos géneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium, possuem como produto do seu metabolismo secundário as micotoxinas. Portanto, as micotoxinas produzidas por fungos filamentosos surgem de forma natural em diversos produtos agroalimentares em todo o mundo. Estes metabólitos são substâncias tóxicas para humanos e animais, mesmo quando ingeridas em pequenas quantidades. Atualmente, são conhecidas mais de 400 micotoxinas, mas apenas algumas destas são encontradas nos alimentos em quantidade suficiente para constituir um risco para quem consome alimentos contaminado. Entre as mais importantes em alimentos estão aflatoxinas, a ocratoxina A, a patulina, as fumonisinas, a zearalenona e o desoxinivalenol, estando a sua presença em alimentos regulamentada. Essas micotoxinas podem ser carcinogênicas, mutagênicas, teratogênicas, citotóxicas, neurotoxinas, nefrotóxicas, estrogênicas e imunossupressoras. Como a produção de micotoxinas é consequência do metabolismo dos fungos, elas são consideradas contaminante naturais em alimentos. Os alimentos comercializados no Brasil, segundo a Resolução RDC 07/2011, publicada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), deverão respeitar um limite máximo para a presença de micotoxinas, substâncias tóxicas produzidas por fungos e encontradas, principalmente, em grãos. No artigo abaixo, você terá mais informações sobre micotoxinas em alimentos. Clique aqui e acesse. Crescimento em placas de Aspergillus. http://www.journals.ufrpe.br/index.php/apca/article/download/128/117 https://cead.uvv.br/conteudo/wp-content/uploads/2020/02/aula_micali_top04_img05-768x512.jpg 26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 6/12 Alguns efeitos toxicológicos das micotoxinas estão descritos na Tabela 1. Entretanto, a intensidade desses efeitos pode variar e está relacionada à quantidade ingerida, ao tempo de exposição e sinergia que ocorre com a ingestão de mais de uma micotoxina simultaneamente. Além disso, o sexo, a idade e o estado fisiológico influenciam nos efeitos tóxicos. A ingestão de grandes quantidades pode levar o indivíduo a óbito. Tabela 1: Efeitos tóxicos associados às micotoxinas Micotoxina Efeitos tóxicos Efeitos patológicos A�atoxinas Citóxico, mutagênico, hepatóxico, carcinogênico, teratogênico, imunossupressor Hiperplasia das vias biliares, hemorragias intestinais e renais, tumores no fígado, hepatite aguda, cirrose hepática. Ocratoxina A Citotóxico, nefrotóxico, teratogênico, hepatotóxico Nefropatia endêmica dos Balcãs, nefropatia intersticial crônica, enterite, nefropatia suína, tumores renais. Patulina Neurotóxico, genotóxico, teratogênico, imunossupressor Edema cerebral e pulmonar, hemorragias pulmonares, danos nos capilares, paralisia dos nervos motores, convulsões. Fumonisinas Citotóxico, carcinogênico, teratogênico, imunossupressor Leucoencefalomalácia, edema pulmonar, cancro esofágico. Zeralinona Genotóxico, efeito estrogênico Puberdade precoce, edema da vulva, prolapso vaginal, atro�a testicular e dos ovários, aumentos das glândulas mamárias, abortos. Desoxinivalenol Imunossupressor, neurotóxico, genotóxico, teratogênico Náuseas temporárias, vômitos, diarreia, dor abdominal, dor de cabeça, tonturas, febre, anorexia. Vamos pensar? Quais as medidas deverão ser adotadas para evitar a produção de micotoxinas em alimentos? Segundo a Anvisa, o consumo dessas substâncias dentro dos limites estabelecidos pela regulamentação é considerado seguro. Para verificar os limites instituídos, acesse o link aqui. http://portal.anvisa.gov.br/resultado-de-busca?p_p_id=101&p_p_lifecycle=0&p_p_state=maximized&p_p_mode=view&p_p_col_id=column-1&p_p_col_count=1&_101_struts_action=%2Fasset_publisher%2Fview_content&_101_assetEntryId=2663554&_101_type=content&_101_groupId=219201&_101_urlTitle=anvisa-estabelece-limites-para-presenca-de-micotoxinas-em-alimentos&inheritRedirect=true 26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 7/12 Fonte: adaptado de Pitt and Hocking (2009) e CAST (2003) Os fungos produtores de micotoxinas podem colonizar os alimentos durante os períodos de pré- colheita, na colheita e, ou no armazenamento. A colonização e a contaminação com micotoxinas podem ocorrer simultaneamente ou a produção de micotoxinas pode ocorrer numa fase posterior. Normalmente, os requisitos fisiológicos para a produção de micotoxinas são mais restritos do que aqueles necessários ao crescimento fúngico. Tipicamente, os fungos de campo, dos géneros Alternaria, Cladosporium e Fusarium, são aqueles que colonizam os alimentos durante a fase de pré-colheita. Estes crescem, habitualmente, a umidades relativas entre 70 a 90 % e a temperaturas de 20 ºC e 25 ºC. Esses fungos conseguem crescer com atividade da água (Aa) superior a 0,85; entretanto, Aa ótima para crescimento é próxima de 0,99. Os fungos que surgem durante a fase de armazenamento das culturas agrícolas estão geralmente melhor adaptados à baixa atividade de água e a temperaturas mais elevadas. Neste caso, os géneros Aspergillus e Penicillium são os seus maiores representantes. São capazes de crescer com Aa de 0,75-0,85 e o crescimento ótimo ocorre com atividade de água entre 0,93 e 0,98. As aflatoxinas são as micotoxinas mais estudadas. Quimicamente, as aflatoxinas são compostos denomindados furanocumarinas. Todas possuem um núcleo, cumarina, associado ao furano e à lactona. As aflatoxinas do grupo B possuem um anel ciclopentona e as do grupo G, lactona insaturada. As aflatozinas do grupo M são derivados hidroxilados de B1 e B2. A Aflatoxina B1 (AFB1) é produzida por todas as linhagens produtoras de aflatoxinas, sendo a micotoxina mais potente desse grupo, ou seja, precisa de uma menor dose para causar o mesmo efeito. A aflatoxina M1 (AFM1) é um produto hidrolisado da AFB1 e aparece em leite, urina e fezes de animais como produto do metabolismo. O processamento do leite não afeta as concentrações de AFM1. Outros derivados da AFB1 são a AFL, AFLH1 AFQ1 e AFP1. A AFB2 é a forma 2,3-dihidro da AFB1. A toxidade das seis aflatoxinas mais potentes decresce na seguinte ordem: B1 > M1 > G1 > B2 > M2 = G2. As micotoxinas são estáveis aos processos usuais utilizados na indústria de alimentos, portanto, o controle deverá ser exercido antes da sua produção, pois podem ser eliminados por determinados tratamentos, como o calor, ácido, etc. A exposição da aflatoxina à luz ultravioleta, no entanto, provoca a sua degradação parcial em alguns casos. Para eliminação pelo calor, é necessária a temperatura superior de 237 a 289 ºC, aquecimento não utilizado em alimentos. Agentes oxidantes, como água oxigenadae hipoclorito de sódios, são capazes de reduzir o teor de aflatoxinas. 4. Virus Os vírus são parasitas intracelulares obrigatórios, isto é, para sobreviver e multiplicar, é necessário que estar parasitando uma célula hospedeira viva. Devido à característica de serem inativos nos alimentos, os vírus importantes são aqueles que causam doenças no homem e nos animais. 26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 8/12 Enquanto as bactérias têm importância em doenças transmitidas por alimentos em países em desenvolvimento, os agentes virais são mais relevantes em países industrializados. Os vírus entéricos podem ser de origem fecal, aquática ou transmitida aos alimentos por contato humano ou animal. Diferente das bactérias, os vírus não podem se multiplicar fora das células vivas (hospedeiras), ou seja, nos alimentos. Vírus patogênicos, como da hepatite A, da poliomelite e aqueles causadores de gastroenterites (rotavírus e vírus Norwalk), podem ser veiculados por água e alimentos. Constituem, particularmente, um risco nos moluscos bivalves, que são organismos filtradores sujeitos à contaminação. Entre as doenças virais humanas causadas por ingestão de água e alimentos contaminados estão as gastroenterites causadas pelo vírus Norwalk e por rotavírus, poliomielite e hepatite. As gastroenterites que acontecem em crianças estão associadas às seguintes famílias: no caso de rotavíurs, Reoviridae, em norovírus e sapovírus, Calicivirida, nos astrovírus, Astroviridae e nos casos de adenovírus, Adenoviridae. O norovírus humano é a principal causa de doenças transmitidas por alimentos em todo o mundo, impondo considerável gasto em saúde pública por parte dos governos dos países envolvidos nos casos. A ocorrência dos casos acontece durante todo o ano, com um pico de infecções durante os meses de clima frio. O norovírus possui uma das doses infecciosas mais baixas de patógenos que causam diarreia. Este vírus tem alta capacidade de transmitir infecção com uma baixa quantidade de vírus. A apresentação clínica do norovírus é início súbito de vômito e diarreia aquosa. A duração da infecção é, geralmente, autolimitante. No entanto, pacientes imunocomprometidos podem sofrer um curso mais longo e mais grave de infecção. A principal via de transmissão do norovírus é boca- fecal. O contato com itens ou ambiente contaminado também pode transmitir infecção e propagar surtos. Pacientes imunocomprometidos, crianças, adultos debilitados, idosos e pessoas que estão em ambientes semifechados, como casas de repouso, hospitais ou navios de cruzeiro, onde há maior Príon é um agente infeccioso composto por proteínas com forma aberrante. Tais agentes não possuem ácidos nucleicos (DNA e/ou RNA), ao contrário dos demais agentes infecciosos conhecidos (vírus, bactérias, fungos e parasitas). Ilustração de alguns Vírus. https://cead.uvv.br/conteudo/wp-content/uploads/2020/02/aula_micali_top04_img06-768x620.jpg 26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 9/12 risco de infecção por norovírus. O diagnóstico clínico de norovírus é, geralmente, suficiente; no entanto, em uma situação de surto ou ambiente semifechado, devem ser considerados testes de diagnóstico por reação em cadeia da polimerase (PCR). Os rotavírus são de fita dupla não envelopada Vírus RNA (dsRNA). Possuem uma arquitetura complexa de três capsídeos concêntricos que envolvem um genoma de 11 segmentos de dsRNA. Os segmentos de RNA codificam seis proteínas virais estruturais (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 e VP7) e seis proteínas não estruturais (NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 e NSP6). As proteínas na partícula do vírus maduro determinam o hospedeiro especificidade, entrada de células e funções enzimáticas necessárias para a produção de transcritos virais, e contêm epítopos que geram respostas imunes. Os primeiros casos de infecção pelo vírus da influenza A pandêmica A (H1N1), em 2009, foram documentados em março de 2009 e, subsequentemente, causaram um surto mundial. A Organização Mundial da Saúde declarou a primeira pandemia global de gripe da fase 6 do século em 11 de junho de 2009. Em novembro de 2009, mais de 47 milhões de pessoas nos Estados Unidos Para maiores informações sobre o norovírus, acesse o artigo de revisão abaixo: Artigo: Norovírus: uma visão geral Modelo molecular de um rotavírus que causa infecção diarreica em crianças. Acesse aqui para ler sobre rotavirus como agente em um surto de origem alimentar no Rio de Janeiro (RJ): Artigo: Indícios de Rotavirus na etiologia de um surto de infecção de origem alimentar http://www.scielo.br/pdf/ramb/v57n4/v57n4a23.pdf https://cead.uvv.br/conteudo/wp-content/uploads/2020/02/aula_micali_top04_img07-768x512.jpg http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20612004000100017 26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 10/12 estavam infectadas e houve mais de 213.000 hospitalizações relacionadas ao H1N1 e, aproximadamente, 10.000 mortes relacionadas ao H1N1. A maioria das doenças é relatada na faixa etária de 18 a 64 anos. O risco de doença, hospitalização e morte relacionados ao H1N1 2009 é muito específico para a idade e muito diferente da influenza sazonal. O vírus vive por duas a oito horas em superfícies e o hábito de lavar as mãos com frequência ajuda a reduzir as chances de contaminação, portanto, é essencial que todos os estabelecimentos que produzem alimentos apliquem as boas práticas de fabricação. Nesses estabelecimentos, os manipuladores de alimentos são treinados para a devida higienização das mãos. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) e o Center for Deseases Control (CDC), o centro de controle de doenças nos Estados Unidos, não há risco de esse vírus ser transmitido através da ingestão de carne de porco, porque ele será eliminado durante o cozimento em temperatura elevada (71º C). Acesse o link aqui para conhecer um pouco mais sobre a gripe suína, seus sintomas e algumas formas de transmissão: Gripe suína: sintamas e transmissão . 5. Conclusão Após estudar sobre fungos e leveduras em alimentos, você pôde perceber que estes podem estar associados a benefícios e malefícios, a depender, principalmente, do tipo de microrganismo envolvido. Os microrganismos têm sido usados há muito tempo para produção de alimentos de elevado valor nutricional, como pães, queijos, bebidas. Os fungos produtores de micotoxinas devem ter seu desenvolvimento controlado, pois estão envolvidos em mecanismos de toxidade para quem os consome e os principais alimentos associados a estes metabólitos são os grãos. Em relação aos vírus, sua presença em alimentos é derivada das falhas nas condições higiênico-sanitárias durante o processamento ou manipulação. http://www.iff.fiocruz.br/index.php/8-noticias/239-h1n1sintomas 26/10/2022 08:54 Fungos, Leveduras E Vírus Em Alimentos https://ceadgraduacao.uvv.br/conteudo.php?aula=fungos-leveduras-e-virus-em-alimentos&dcp=microbiologia-e-seguranca-de-alimentos&topico=4 11/12 6. Referências AMARANTE, S. 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