Apostila biomol

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Prática: Extração de DNA
· Etapas
1.Lise: quebra-se as membranas com solução salina que criam diferenciais osmóticos entre o líquido extra e intracelular. Usa-se detergente para quebrar lipídeos das membranas e proteinase K para desfazer proteínas.
2.Separar o DNA do restante do material da célula: Há vários métodos
· Salino: baixo custo; mais simples; precipita proteínas e DNA fica no fundo;
· Fenol/Cloroformio: desnaturam proteínas; centrifugação; é caro e tóxico;
· Kit com Colunas: DNA liga-se a sílica; DNA eluído; rápido e caro;
· Sephadex: resina de filtação; separa o DNA de moléculas menores; menor rendimento
· Beads Magnéticos: DNA liga-se às partículas magnéticas; maior pureza e maior caro.
3.Isolamento de DNA: nos processos salinos e com fenol, usa-se o álcool concentrado 100% e o de 70% para lavagem, assim o DNA se condensa; faz-se centrifugação e o DNA desce para o fundo; tira o álcool que fica por cima e deixa o DNA no tubo; faz 2x o processo: 1x com álcool forte e 1x com álcool mais fraco; deixa o tubo secar (álcool evapora) e resuspende em água ou tampão.
SANGUE TOTAL- LISE: LISADO; 
CENTRIFUGAÇÃO (ELIMINA PROTEÍNAS): SOBRENADANTE;
ENTANOL (PRECIPITA DNA);
ETANOL 70% ELIMINA IMPUREZAS;
ELUIÇÃO: DNA
1. Lise (Quebrando a "casa")
Para acessar o DNA, que está guardado lá no fundo do núcleo, você precisa romper as barreiras da célula. É uma etapa de destruição controlada:
· Solução salina (choque osmótico): Altera o equilíbrio de água entre o dentro e o fora da célula, fazendo com que ela inche e estoure.
· Detergente: As membranas das células e do núcleo são feitas de lipídeos (gordura). Assim como o detergente de cozinha dissolve a gordura da panela, ele desfaz essas membranas celulares.
· Proteinase K: Lembra das histonas (as proteínas que formam os nucleossomos que discutimos na mensagem anterior)? A proteinase K é uma enzima "tesoura" que destrói essas histonas para soltar o fio de DNA. Ela também destrói enzimas chamadas nucleases, que caso ficassem soltas, picotariam o seu DNA.
2. Separação (Limpando a "sopa")
Após a lise, o seu tubo virou uma "sopa" misturada com restos de membrana, proteínas destruídas e o DNA solto. O objetivo aqui é separar o DNA desse lixo celular. O seu texto cita as opções disponíveis no laboratório, que variam em custo e eficiência:
· Salino: O sal faz as proteínas se aglomerarem e irem para o fundo, deixando o DNA nadando no líquido em cima. É barato e prático.
· Fenol/Clorofórmio: Um método clássico e muito eficiente, mas perigoso. Esses compostos químicos separam a mistura em duas fases (como água e óleo): as proteínas ficam embaixo e o DNA fica na fase aquosa de cima.
· Kits (Colunas/Beads): São os métodos modernos. Você joga a "sopa" em um filtro de sílica ou esferas magnéticas. O DNA "gruda" nelas, você lava todo o resto (o lixo desce pelo ralo) e depois solta (elui) o DNA limpo. É caro, mas rápido e puríssimo.
3. Isolamento / Precipitação (Resgatando o DNA)
Aqui, você já tem um líquido (sobrenadante) apenas com o DNA, mas ele está dissolvido (invisível na água). Você precisa forçá-lo a aparecer e virar uma massa sólida.
· Álcool 100% (Etanol ou Isopropanol): O DNA é solúvel em água, mas não é solúvel em álcool. Quando você joga o álcool 100% gelado, o DNA perde a hidratação, se aglomera e "precipita" (vira um emaranhado branco visível a olho nu).
· Centrifugação: Ao girar o tubo em altíssima velocidade, essa massa de DNA é arremessada para o fundo, formando um "pellet" (um botãozinho sólido). Você joga o líquido fora.
· Álcool 70%: Usado para "lavar" o DNA. Ele tira os restos de sais da etapa anterior, mas como ainda tem 70% de álcool, não deixa o DNA se dissolver e se perder de novo.
· Secagem e Ressuspensão: O álcool evapora (pois é tóxico para os próximos passos) e você pinga água pura ou um tampão protetor para dissolver o seu DNA limpo e guardá-lo.
O Resumo do Processo no Sangue Total
O esquema final do seu texto mostra exatamente essa linha de montagem aplicada ao sangue:
1. Lise: Quebra os leucócitos (glóbulos brancos, que têm núcleo). O resultado é o Lisado (a sopa).
2. Centrifugação: Joga o lixo proteico para o fundo. Você coleta apenas o líquido de cima, chamado de Sobrenadante (onde está o DNA).
3. Etanol: Jogado no sobrenadante para fazer o DNA precipitar e virar massa.
4. Etanol 70%: Lava o botãozinho de DNA tirando o sal.
5. Eluição: O passo final onde o DNA puro e seco é reidratado em água para ser usado.
1. A Química da Cópia (Fitas e Ligações)
A síntese de RNA usa o DNA como base, mas com regras estritas:
· A Fita Molde vs. Fita Codificadora: A RNA polimerase lê apenas uma das fitas do DNA (a fita molde, no sentido 3' para 5'). Como resultado, o RNA gerado é uma cópia exata da fita complementar do DNA (a fita codificadora, no sentido 5' para 3'), trocando apenas a Timina (T) pela Uracila (U).
· A Reação Química: A fita de RNA cresce pela adição de um ribonucleotídeo trifosfatado. A ligação química ocorre entre o grupo fosfato ligado ao carbono 5' do novo nucleotídeo e o nucleotídeo que já está na fita. Diferente da replicação do DNA, a RNA polimerase não precisa de um primer (iniciador) para começar o trabalho.
2. Os Atores e as Ferramentas (Polimerases)
Enquanto as bactérias usam uma única RNA polimerase para tudo, os eucariotos (nossas células) dividem o trabalho:
· RNA Polimerase I: Fica no nucléolo e fabrica o RNA ribossômico (rRNA).
· RNA Polimerase II: Fica no nucleoplasma e fabrica o RNA mensageiro (mRNA).
· RNA Polimerase III: Fica no nucleoplasma e fabrica o RNA transportador (tRNA).
3. O Passo a Passo da Transcrição (Foco em Procariotos)
Os slides detalham fortemente como as bactérias transcrevem seus genes:
A. Início (O papel do Fator $\sigma$ e do Promotor)
· A enzima precisa achar o "promotor", que tem duas sequências chave muito conservadas: a região -10 (TATAbox ou TATAAT) e a região -35 (TTGACA).
· A holoenzima (a RNA polimerase ligada ao fator $\sigma$) se liga a essas regiões.
· O freio de mão: Enquanto o fator $\sigma$ (sigma) está ligado à enzima, ela fica ancorada ao promotor e não consegue se deslocar pelo DNA. Apenas quando o fator $\sigma$ se solta é que a enzima fica livre para iniciar a fase de alongamento. O primeiro nucleotídeo transcrito (+1) geralmente é uma purina (Adenina ou Guanina).
B. Alongamento (A Bolha de Transcrição)
· A enzima avança estendendo a cadeia no sentido 5' para 3'.
· Ela cria uma bolha onde cerca de 18 pares de bases (pb) do DNA ficam abertos (desnaturados). Dentro dessa bolha, o RNA recém-sintetizado fica temporariamente pareado com o DNA, formando um híbrido DNA:RNA de 12 pb.
· Esse avanço gera um emaranhado no DNA (superenrolamento positivo na frente e negativo atrás), exigindo enzimas chamadas topoisomerases para aliviar a tensão e não quebrar o DNA.
C. Término O processo para quando a enzima encontra uma sequência de parada, o que desestabiliza o complexo. Em bactérias, há dois caminhos detalhados:
· Independente de Rho (Grampo): O DNA molde tem uma longa sequência de "A". Isso gera um pareamento longo de Adenina-Uracila (A-U) entre o DNA e o RNA, que é uma ligação muito mais fraca. Além disso, a fita de RNA dobra sobre si mesma formando um "grampo" (lariat). Essa junção de grampo + ligação fraca ejeta a enzima.
· Dependente de Rho: Uma proteína chamada Rho (um hexâmero) viaja pela fita de RNA atrás da polimerase. O término ocorre em uma sequência rica em Citosina (C) que faz a polimerase pausar. A proteína Rho a alcança e age como um "saca-rolhas", desenrolando o híbrido DNA-RNA à força.
4. Processamento em Eucariotos (Lapidando o RNA)
Como as bactérias não têm núcleo, a transcrição e a tradução (fazer a proteína) ocorrem ao mesmo tempo no citoplasma. Já nos eucariotos, o RNA "nasce" no núcleo como pré-mRNA e precisa ser modificado antes de ir para o citoplasma.
Modificação 1: Adição do Cap 5'
· Logo no início da fita, uma molécula protetora chamada 7-metilguanosina é adicionada.
· Essa adição ocorre através de uma ponte química especialchamada ligação 5',5'-trifosfato.
Modificação 2: Splicing (Corte e Costura)
· O RNA tem partes inúteis (Íntrons) e partes que codificam a proteína (Éxons). O Splicing remove os íntrons.
· O maquinário: Esse trabalho é feito pelo spliceossomo, um complexo gigante (de $3\times10^{3}$ kDa) formado por pequenas ribonucleoproteínas (as snRNPs, como U1, U2, U4, U5 e U6).
· A mecânica: As snRNPs dobram o íntron em um formato de laço (lariat), cortam as pontas e colam os éxons adjacentes. Curiosidade dos slides: alguns íntrons específicos (Grupo I) conseguem fazer o próprio corte (auto-splicing) sem ajuda do spliceossomo, usando a hidroxila 3' de uma guanosina.
Modificação 3: Splicing Alternativo
· O spliceossomo pode escolher cortar não só os íntrons, mas também ignorar alguns éxons. Isso permite que um único gene original produza dezenas de combinações diferentes de éxons finais, gerando diferentes proteínas.
Aqui está como a base -1, o início do gene, o promotor e o TATA box se conectam:
1. O Marco de Início (+1 e -1)
O local exato onde a enzima (RNA Polimerase II) coloca o primeiro nucleotídeo para começar a fabricar o RNA mensageiro é chamado de Sítio de Início da Transcrição. Esse ponto recebe a coordenada +1.
· A Regra de Ouro: Não existe a posição zero nesse mapa.
· Portanto, a base -1 é simplesmente o último nucleotídeo que fica imediatamente antes de onde a transcrição começa.
· Tudo o que tem número positivo (+1, +2, +3...) faz parte do gene que será copiado. Tudo o que tem número negativo (-1, -2, -30...) fica "para trás" (a montante) e não faz parte da fita de RNA final.
2. O Promotor (A Pista de Pouso)
Essa região de números negativos que fica antes do gene é o promotor.
Ele não contém a receita para fazer a proteína, então ele não é transcrito. A função do promotor é ser a "pista de pouso" e o "painel de controle". É nele que a RNA Polimerase e outras proteínas de ajuda (fatores de transcrição) precisam pousar e se fixar para iniciar o trabalho.
3. O TATA Box (O Sinalizador)
O TATA box é a luz de sinalização mais importante dessa pista de pouso (nas células eucariontes). É uma sequência específica de DNA rica em Timina e Adenina (geralmente T-A-T-A-A-A) que fica dentro do promotor.
· A Localização: O TATA box não fica no -1. Ele fica posicionado um pouco mais para trás, geralmente na região -25 a -30.
Como tudo se conecta na prática?
1. Os Fatores de Transcrição "enxergam" o TATA box na posição -25 e grudam nele fortemente.
2. Eles chamam a RNA Polimerase II e a encaixam no lugar.
3. Como o TATA box está a uma distância fixa (cerca de 25 a 30 bases de distância do início), ele funciona como uma régua molecular. Ele posiciona a "boca" da RNA Polimerase exatamente em cima da coordenada +1.
4. A enzima ignora a base -1, o TATA box e todo o resto do promotor que ficou para trás, e começa a sintetizar o RNA a partir do +1 em diante.
1. A Construção Contínua (Sentido $5' \rightarrow 3'$)
"A polimerase desliza ao longo da fita molde estendendo uma cadeia de RNA crescente no sentido $5' \rightarrow 3'$ através da adição de ribonucleotídeos"
Lembra daquela nossa conversa sobre a energia dos três fosfatos e o gancho do 3'-OH? É exatamente isso que está acontecendo aqui. A enzima se livrou do fator $\sigma$ (o freio de mão) e agora viaja pela fita molde do DNA. Ela vai lendo a receita e costurando os nucleotídeos de RNA, um por um, formando uma fita cada vez mais longa, sempre obedecendo à regra universal de crescer na direção $5' \rightarrow 3'$.
2. A Bolha de Transcrição e o Híbrido
"Durante o alongamento, 18pb estão desnaturados e 12pb formam um híbrido DNA:RNA"
A RNA Polimerase é uma máquina grande e precisa de espaço para trabalhar. Ela cria uma "bolha de transcrição":
· 18 pb (pares de bases) desnaturados: Significa que, a qualquer momento, a enzima mantém um trecho de cerca de 18 degraus da escada do DNA abertos (com as pontes de hidrogênio rompidas).
· 12 pb formando o híbrido: Dentro dessa bolha, a ponta da fita de RNA que acabou de ser fabricada não se solta do DNA imediatamente. Ela fica grudada (pareada) com o DNA molde por um trecho de cerca de 12 bases. Isso ajuda a estabilizar o processo. À medida que a enzima avança, o RNA mais "velho" vai descolando e saindo por um canal na enzima como uma cauda solta, enquanto o DNA volta a se fechar lá atrás.
3. O Problema do Novelo Emaranhado (Topoisomerases)
"O deslocamento... gera superenrolamento positivo à frente... e negativo atrás... sendo necessárias topoisomerases"
Imagine pegar um fio de telefone antigo (aqueles enrolados em espiral) ou uma corda grossa formada por dois fios torcidos. Se você enfiar o dedo no meio dos dois fios e empurrar para a frente (como a RNA Polimerase faz), a corda lá na frente vai ficar super apertada e cheia de nós (superenrolamento positivo). A parte de trás vai ficar frouxa e distorcida (superenrolamento negativo).
· Se essa tensão não for aliviada, o "nó" na frente fica tão duro que trava o motor da enzima.
· As topoisomerases são os mecânicos salvadores: elas são enzimas que vão na frente e atrás da bolha cortando o DNA, girando o fio para aliviar a tensão, e colando de novo.
4. O Fim da Linha (Término)
"Este processo ocorre até a RNA polimerase encontrar uma sequência específica no DNA que determina o término..."
A enzima não adivinha a hora de parar. O próprio DNA tem uma "placa de PARE" escrita em seu código (uma sequência de término). Quando a RNA Polimerase transcreve essa sequência específica, isso desestabiliza toda a máquina. A bolha se desfaz, o híbrido DNA:RNA se rompe, o RNA recém-fabricado é liberado e a enzima se solta do DNA, finalizando o trabalho.
1. O Gatilho da Desestabilização (A Fraqueza do A-U)
Como o seu texto aponta brilhantemente, em bactérias (procariotos), a região final do gene no DNA molde tem uma longa fileira de Adeninas (A). Quando a RNA Polimerase copia isso, ela coloca uma longa fileira de Uracilas (U) no RNA.
· Por que isso faz a máquina parar? Lembre-se da nossa conversa sobre as ligações químicas! O par A-U é unido por apenas duas pontes de hidrogênio. Uma sequência longa de pares A-U é como um "velcro" muito fraco.
2. O Detalhe de Ouro: O "Grampo" (Término Intrinseco)
O seu texto foca no pareamento A-U fraco, mas existe um passo que acontece milissegundos antes disso para garantir que a enzima realmente caia do DNA.
· Logo antes daquela fileira de "A"s, o DNA possui uma sequência que faz o RNA recém-fabricado se dobrar sobre si mesmo e colar suas próprias bases (geralmente ricas em C e G), formando uma estrutura chamada grampo (ou alça em gancho).
· A Mecânica: Esse grampo físico se forma dentro do canal de saída da RNA Polimerase e dá um "tranco" na enzima, fazendo-a pausar. Como ela está pausada exatamente em cima daquela região de pares A-U super fracos, o "velcro" não aguenta o tranco, se rompe, e o RNA é ejetado.
3. Uma Pequena Correção sobre os Eucariotos
O seu slide traz uma simplificação no último ponto: "Em eucariotos, as 3 RNAs polimerases terminam a síntese em regiões de DNA ricas em T".
Na verdade, isso só é estritamente verdadeiro para a RNA Polimerase III. As outras têm mecanismos diferentes e mais complexos:
· A RNA Polimerase II (A mais importante, que faz o mRNA): Ela é bem mais caótica. Ela não tem um sinal de parada claro e continua transcrevendo dezenas ou centenas de bases além do fim oficial do gene. O que a faz parar é que outras enzimas vêm como uma "tesoura", cortam a fita de RNA útil para liberá-la, e depois um mecanismo (frequentemente chamado de modelo do "torpedo") degrada o RNA restante que ainda está preso à enzima, até alcançá-la e forçá-la a largar o DNA.
A beleza desse processo é que, ao final de tudo, a dupla hélice de DNA se fecha (renatura) intacta, exatamente como estava antes, pronta para ser lida novamente!
· Para visualizar o que está acontecendo aqui, a melhor analogia é pensar na produção de um filme. O RNA mensageiro recém-fabricado (o pré-mRNA) é como a filmagem bruta de um diretor de cinema: tem cenas essenciais para a história,mas também tem um monte de erros de gravação, pausas e cenas inúteis que precisam ser cortadas antes do filme ir para o cinema (o ribossomo).
Vamos desmembrar esses conceitos:
1. Íntrons e Éxons (O material bruto)
· Éxons: São as partes do RNA que "expressam" alguma coisa, ou seja, as cenas úteis que contêm a receita real para fazer a proteína.
· Íntrons: São as partes "intrusa", trechos de RNA que não codificam nada para aquela proteína e precisam ser removidos.
2. O Spliceossomo e as snRNPs (A Equipe de Edição)
O spliceossomo é a ilha de edição do filme. Como a sua anotação diz, é um complexo molecular gigantesco (3x10³ kDa é muito grande para os padrões da célula!).
· Ele é formado pela união de várias snRNPs (pequenas ribonucleoproteínas nucleares, que os cientistas apelidaram carinhosamente de "snurps").
· Como funciona: As snRNPs reconhecem o começo e o fim exato de um íntron. Elas dobram esse íntron em formato de laço, cortam as pontas, jogam o íntron no lixo e "colam" os dois éxons perfeitamente um no outro.
3. Splicing Alternativo (O Pulo do Gato da Evolução)
Essa é, sem dúvida, uma das descobertas mais fantásticas da biologia molecular.
Durante muito tempo, os cientistas achavam que 1 gene fazia apenas 1 proteína. Mas, quando mapearam o genoma humano, descobriram que temos apenas cerca de 20.000 genes... mas o nosso corpo produz mais de 100.000 proteínas diferentes! Como a conta fecha? Através do Splicing Alternativo.
· A Mágica: O spliceossomo pode escolher quais éxons ele vai colar juntos.
· Pegando a analogia do filme: você pode pegar a mesma gravação bruta e editar um filme de ação, ou cortar as cenas de explosão e fazer um drama romântico.
· Um único gene pode gerar o pré-mRNA Éxon 1 - Íntron - Éxon 2 - Íntron - Éxon 3.
· Na célula do fígado, o spliceossomo corta os íntrons e junta: 1 + 2 + 3 (Proteína A).
· Na célula do cérebro, o spliceossomo resolve tratar o Éxon 2 como se fosse um íntron e o joga fora, juntando: 1 + 3 (Proteína B, totalmente diferente).
É graças a esse "corta e cola" alternativo que organismos complexos como nós conseguem criar uma diversidade gigantesca de tecidos usando um número relativamente pequeno de genes!