Conservação de Alimentos: Nisina

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<p>CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS</p><p>A maioria dos alimentos, tanto de origem vegetal quanto animal, pode se deteriorar</p><p>facilmente e perder qualidade, o que resulta em uma menor vida útil. Vários fatores</p><p>influenciam essa perda, como o tipo, composição, formulação, embalagem e o modo como</p><p>os alimentos são armazenados.</p><p>Os alimentos se deterioram em virtude da presença de microorganismos, especialmente</p><p>contaminantes presentes na superfície dos alimentos. Esses microorganismos além de</p><p>reduzir a vida útil dos alimentos também podem causar intoxicação ou infecção quando</p><p>consumidos. Para garantir a segurança alimentar e prolongar a durabilidade dos alimentos,</p><p>são utilizados aditivos para sua conservação. No entanto, um número crescente de pessoas</p><p>têm buscado alimentos minimamente processados e mais próximos do natural. Para ajudar</p><p>a preservar esses alimentos de forma natural, são utilizados aditivos antimicrobianos</p><p>naturais, como as bacteriocinas que atuam como conservantes nos produtos alimentícios.</p><p>O termo bacteriocina foi empregado pela primeira vez para designar um peptídeo com</p><p>propriedades antimicrobianas obtido a partir de determinadas cepas de Escherichia coli,</p><p>conhecidas como colicinas. Todavia, estudos realizados por Louis Pasteur e Jules François</p><p>Joubert em 1877 já haviam identificado a atividade antimicrobiana de substâncias</p><p>produzidas por bactérias isoladas de urina contra o Bacillus anthracis. Em 1928, durante as</p><p>investigações do processo de produção de queijos, pesquisadores encontraram um</p><p>composto peptídico produzido por cepas de Lactococcus lactis que conferia proteção contra</p><p>a decomposição do alimento. Posteriormente, em 1947, foi descoberta outra substância</p><p>com essas mesmas propriedades, que foi nomeada como nisina.</p><p>NISINA - COMPOSIÇÃO E PROPRIEDADES</p><p>A descoberta da nisina foi um marco importante nas pesquisas sobre bacteriocinas, pois é</p><p>comercializada desde 1953 e é usada até hoje como conservante em alimentos. A nisina é</p><p>o único peptídeo natural antimicrobiano aprovado pela FDA para o uso como conservante</p><p>de alimentos, a nisina é produzida por bactérias do leite, 35 das 40 espécies de</p><p>Lactococcus lactis subsp sintetizam a nisina. Sua capacidade de produção está ligada à</p><p>capacidade de fermentar sacarose e pertence ao grupo de peptídeos produzidos</p><p>ribossômicamente, pertence à classe dos lantibióticos e subclasse Ia. Seu número de</p><p>identificação é o INS E234.</p><p>A nisina é capaz de atuar em diversas espécies bacterianas, tais como Lactococcus,</p><p>Streptococcus, Listeria e Micobacterium, em células vegetativas e esporos de Bacillus e</p><p>Clostridium. Essa substância é naturalmente encontrada em vários alimentos fermentados,</p><p>principalmente em produtos lácteos, sendo utilizada pela população há séculos. A nisina é</p><p>um agente bactericida amplo espectro, principalmente contra bactérias Gram positivas,</p><p>tendo seu uso específico na indústria de queijos para controlar o crescimento de Clostridium</p><p>spp. Seu efeito ocorre por meio da interação com fosfolipídios da membrana plasmática,</p><p>formando poros que levam à saída do material intracelular. Diversos estudos têm avaliado</p><p>sua eficácia na inibição de patógenos, sendo seu uso em diferentes alimentos como</p><p>queijos, sucos de fruta, carne moída, salsichas, produtos enlatados, derivados do leite e</p><p>cerveja.</p><p>A molécula de nisina começa como uma forma inativa que possui 57 aminoácidos comuns</p><p>compostos por 23 resíduos na região-líder e 34 resíduos na região estrutural. Através de</p><p>modificações enzimáticas, a região líder é cortada e a treonina e serina da região estrutural</p><p>sofrem desidratação. Isso resulta na formação de deidroalanina e dedrobutirina. Depois,</p><p>pontes tioéter são produzidas através da combinação de cisteína com deidroalanina e</p><p>dedrobutirina, o que produz os aminoácidos lantionina e β-metil-lantionina. É nessa forma</p><p>que a nisina se torna ativa.</p><p>A nisina é capaz de formar dímeros ou polímeros que variam entre 7.000 e 14.000 Da</p><p>através de seus aminoácidos deidroalanina e deidrobutirina. Existem 5 tipos de nisinas</p><p>diferentes (A, B, C, D e E) que podem ser produzidos dependendo das condições de</p><p>armazenamento e variações de aminoácidos ao longo do tempo. A nisina A e a nisina B são</p><p>mais ativas do que as nisinas C e D, que possuem apenas 20% de sua atividade biológica.</p><p>A nisina D é a mais resistente à nisinase de Bacillus cereus e as nisinas B e E são produtos</p><p>derivados da degradação da nisina A. Além disso, existe uma variante natural chamada</p><p>nisina Z, que é idêntica à nisina A, exceto pela presença de asparagina em substituição à</p><p>histidina na posição 27 da molécula ativa. Ambas possuem a mesma atividade biológica,</p><p>mas a nisina Z tem propriedades de difusão diferentes.</p><p>MECANISMO DE AÇÃO</p><p>O pH, temperatura e substrato têm grande influência na solubilidade, estabilidade e</p><p>atividade biológica da nisina. As bacteriocinas são facilmente degradadas por enzimas</p><p>proteolíticas, mas a nisina é estável em tratamentos térmicos e de alta pressão, além de</p><p>resistir a ambientes ácidos. A solubilidade aumenta com a concentração de fosfato e</p><p>proteína, mas é baixa em meios neutros ou moderadamente alcalinos. Devido à presença</p><p>de aminoácidos básicos, a carga liquida da nisina é positiva e seu ponto isoelétrico é 10,5.</p><p>Entretanto, aminoácidos como deidroalanina e deidrobutirina sofrem ataque de nucleófilos</p><p>em pH alto, o que explica sua instabilidade e baixa solubilidade em condições básicas. Além</p><p>disso, a nisina não é solúvel em solventes apolares.</p><p>A solubilidade da nisina em água é altamente influenciada pelo pH. Quando o pH aumenta,</p><p>sua solubilidade diminui drasticamente - de 57mg/mL em pH 2 para 0,25mg/mL em pH 5.</p><p>Em pH 2,5, a solubilidade é de 12%, mas cai para 4% em pH 5 e se torna praticamente</p><p>insolúvel em pH neutro ou alcalino.</p><p>A nisina é conhecida por sua capacidade de resistir ao calor, podendo ser autoclavada a</p><p>121°C por 15 minutos em pH 2,5 sem perda de atividade. Porém, em pH 5, sua atividade é</p><p>reduzida em 40% e em pH acima de 6,8, a perda é de 90%. Sua estabilidade em baixo pH é</p><p>devido às cinco pontes de enxofre que conferem uma estrutura rígida, embora não</p><p>apresente uma estrutura secundária. A maioria das bacteriocinas tem melhor estabilidade</p><p>em pH ácido a neutro, sendo inativadas em pH 8,0 - assim como a nisina. Sua inativação</p><p>em meio alcalino ocorre devido a desnaturação, modificação química ou uma combinação</p><p>de ambos.</p><p>Pesquisas que investigam o mecanismo de ação da nisina indicam que a sua principal ação</p><p>é sobre a membrana citoplasmática. A nisina é capaz de inibir a síntese de RNA, DNA,</p><p>proteínas, enzimas, polissacarídeos e outros pontos que levam à morte da célula. Esse</p><p>processo ocorre porque a nisina aumenta a permeabilidade da membrana celular,</p><p>permitindo a saída de material intracelular e consequente falta de energia para processos</p><p>biossintéticos. Como a nisina é constituída por partes hidrofóbicas e é carregada</p><p>positivamente, interações eletrostáticas acontecem com os grupos fosfato negativos da</p><p>membrana celular, iniciando a ligação da nisina com a célula-alvo. Em resumo, a nisina age</p><p>primariamente na membrana plasmática, que é a transdutora de energia da célula.</p><p>A nisina possui a habilidade de inibir o crescimento microbiano de bactérias Gram positivas</p><p>em alimentos, inclusive as patogênicas de alto risco, como Staphylococcus aureus,</p><p>Staphylococcus epidermidis e Streptococcus faecalis, Clostridium botulinum e Listeria</p><p>monocytogenes.</p><p>A atuação da substância nisina sobre as células de bactérias Gram positivas ocorre em</p><p>duas fases. Na primeira etapa, há uma absorção não específica da nisina sobre a parede</p><p>celular, que é um fenômeno reversível. Esse processo é influenciado pelo pH, cujo intervalo</p><p>ideal para sua ocorrência varia de 3,0 a 6,5, pela composição dos fosfolipídios presentes na</p><p>membrana citoplasmática dos micro-organismos suscetíveis, pela presença de cátions com</p><p>cargas divalentes e trivalentes e, por fim, pela concentração utilizada da substância.</p><p>A nisina é vulnerável a proteases, porém a aplicação de enzimas proteolíticas protege as</p><p>células que</p><p>são suscetíveis aos efeitos da nisina contra sua ação letal. Em uma etapa</p><p>posterior, a nisina deixa de ser afetada pelas proteases e as células passam por mudanças</p><p>irreversíveis. A nisina tem uma atração forte pelos fosfolipídios e lisossomos que estão na</p><p>membrana das bactérias, formando canais ou poros que possuem um diâmetro de 0,2 a 1,0</p><p>nm. A membrana fica despolarizada e como resultado, os componentes essenciais como</p><p>íons K+, aminoácidos e ATP são expelidos rapidamente, causando uma série de alterações</p><p>que termina com a lise celular.</p><p>A sensibilidade das culturas à ação das bacteriocinas é influenciada pelo estado fisiológico,</p><p>sendo mais suscetíveis as células metabolicamente ativas. A inibição continua enquanto a</p><p>bacteriocina estiver presente no meio de crescimento. A nisina possui um mecanismo</p><p>diferente de inibição de esporos em relação às células vegetativas. Os grupos reativos da</p><p>nisina interagem com grupos sulfidril na membrana dos esporos recém germinados, o que</p><p>resulta em um significativo efeito bacteriostático. A nisina torna possível a germinação dos</p><p>esporos, porém inibe as próximas etapas do processo de formação de novas células.</p><p>Além de apresentar ação contra as bactérias Gram positivas, sobretudo em sua forma de</p><p>esporos, a nisina também se revela eficaz no combate de bactérias Gram negativas e</p><p>fungos, mediante a utilização de um composto adicional, como o agente quelante. No que</p><p>tange às bactérias Gram negativas, a camada de lipopolissacarídeo presente confere uma</p><p>proteção maior à célula, impedindo que agentes externos tenham acesso à membrana</p><p>citoplasmática.</p><p>A camada de lipopolissacarídeo é composta por substâncias com carga negativa, criando</p><p>uma superfície que interage facilmente com água. Assim, a membrana externa evita a</p><p>entrada de substâncias hidrofóbicas e moléculas grandes, incluindo a nisina.</p><p>Apesar do caráter aniônico da camada de lipopolissacarídeo, a nisina - de caráter catiônico</p><p>- pode se unir por interações eletrostáticas, gerando uma estrutura estável, mas ainda</p><p>assim não conseguiria alcançar a membrana citoplasmática da célula. Caso a nisina seja</p><p>combinada com ácido lático, torna-se efetiva contra bactérias Gram negativas. Adicionar</p><p>EDTA em conjunto com a nisina é a forma mais efetiva de inibir o crescimento de bactérias</p><p>do grupo Gram negativas.</p><p>O aditivo terapêutico nisina é altamente valorizado por sua aplicação direta em alimentos</p><p>para o controle microbiano de bactérias e esporos. É um excelente método efetivo para</p><p>inibir o crescimento de L. monocytogenes, S. aureus e G. sporogenes em queijos</p><p>processados com diferentes níveis de umidade. Estudos comprovam a resistência da nisina</p><p>à degradação por tratamento térmico, o que a torna ainda mais eficaz em métodos de</p><p>conservação de alimentos.</p><p>A NISINA EM ALIMENTOS</p><p>O avanço das tecnologias e a crescente demanda por alimentos naturais têm levado à</p><p>valorização das bacteriocinas e seus microrganismos produtores como uma alternativa</p><p>promissora de conservadores biológicos para alimentos. As propriedades de uma</p><p>determinada bacteriocina, tais como estabilidade em diferentes condições de temperatura e</p><p>pH, e a amplitude de seu espectro de ação, são fatores determinantes na previsão de seu</p><p>potencial aplicativo.</p><p>Diversos fatores podem influenciar a eficácia das bacteriocinas em alimentos, como a</p><p>alteração da solubilidade e carga elétrica dessas substâncias, a sua ligação a componentes</p><p>alimentares, inativação por meio de proteases e mudanças na parede ou membrana celular</p><p>dos micro-organismos alvo em resposta a fatores ambientais.</p><p>Diversas pesquisas apontaram os elementos que podem impactar na disseminação das</p><p>bacteriocinas no alimento, incluindo a dosagem de sal, pH, nitrito e nitrato, presença de</p><p>fases aquosas para a difusão, quantidade de gordura e superfícies lipídicas solúveis. As</p><p>análises ainda evidenciaram que é crucial levar em conta a distância a ser percorrida pela</p><p>molécula de bacteriocina para chegar à célula-alvo e a quantidade de células em relação à</p><p>quantidade do antimicrobiano, para predizer a sua eficácia.</p><p>Foi comprovado em um estudo que a Listeria monocytogenes, quando adaptada a</p><p>ambientes ácidos, apresenta maior resistência às bactérias chamadas bacteriocinas,</p><p>ocasionada possivelmente por certas alterações que ocorrem em sua membrana celular. Tal</p><p>pesquisa destaca a importância de se levar em conta os sistemas de resistência ao utilizar a</p><p>nisina em alimentos minimamente processados.</p><p>Vários testes já foram realizados para verificar a eficácia de diversas bacteriocinas em</p><p>diferentes alimentos, como produtos cárneos e laticínios, obtendo bons resultados.</p><p>Entretanto, a permissão para a utilização regulamentada de uma determinada bacteriocina</p><p>em alimentos depende do tipo de alimento e da finalidade de seu uso.</p><p>Até agora, os estudos mais relevantes acerca da toxicologia das bacteriocinas estão</p><p>relacionados aos testes realizados para permitir o uso da nisina como conservante natural</p><p>em alimentos. Os estudos analisaram a toxicidade aguda, subcrônica, crônica,</p><p>alergenicidade e resistência cruzada, e concluíram que a nisina é segura para o consumo</p><p>humano, sendo permitida uma dose diária aceitável (IDA) de 2,9mg/pessoa/dia.</p><p>Foram realizados estudos sobre os efeitos da nisina na microbiota oral considerando o seu</p><p>consumo via oral. Constatou-se que, um minuto após a ingestão de leite achocolatado</p><p>contendo nisina, apenas 40% da sua atividade foi detectada em comparação com um</p><p>controle de saliva. Além disso, outro estudo mostrou que as enzimas gástricas inativam a</p><p>nisina, concluindo-se que a ingestão da substância não tem efeito na microbiota</p><p>gastrintestinal.</p><p>A nisina foi reconhecida como aditivo alimentar pela Or-</p><p>ganização de Alimentos e Agricultura/Organização Mundial</p><p>de Saúde (FAO/OMS) em 1969, com o limite máximo de</p><p>ingestão de 33.000 Unidades Internacionais/kg de peso</p><p>corpóreo. Em 1988, a FDA concedeu-lhe o status de GRAS</p><p>(Generally Recognized as Safe).</p><p>Nisina é permitida em diversos países para uso em produtos como leite, queijo, produtos</p><p>lácteos, tomates e vegetais enlatados, sopas enlatadas, maionese e alimentos infantis. No</p><p>Brasil, sua utilização é aprovada no limite máximo de 12,5 mg/kg em todos os tipos de</p><p>queijo e em produtos cárneos, podendo ser aplicada na superfície externa de salsichas. A</p><p>solução de ácido fosfórico grau alimentício é uma forma de aplicação. Atualmente, mais de</p><p>50 países permitem o uso de nisina em alimentos.</p>