Prodecimento para fibra enzimatica

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Aparelho
1. banhos de água. Um para água a ferver ou vapor e o outro colocado a 60 ° e equipado com agitador magnético multi-estágios ou agitador magnético multi-estágio para proporcionar agitação constante de béqueres de digestão durante a hidrólise enzimática.
2. Cadinhos fritos. Dois por amostra ensaiada. Porosidade No. 2 (Pyrex N ° 32940, ASTM 40-60 grosseira 1..tm; ou Corning N ° 36060 Biichner, disco fritado, Pyrex 60 ml, ASTM 40-60 ilm). Limpe bem. Aquecer 8 horas a 525 °, arrefecer e mergulhar e depois enxaguar em água destilada. Adicionar cerca de 0,5 g de Celite aos cadinhos secos ao ar e secar a 130 ° até peso constante (normalmente 1 h). Arrefecer e armazenar em dessecador até ser usado.
3. fonte de vácuo. Bomba de vácuo ou aspirador de água equipado com balão de vácuo duplo em linha para evitar a contaminação de resíduos em caso de reserva de água.
4. Forno a vácuo, regulado para 70 °. Alternativamente, o forno de ar a 105 ° pode ser usado.
5. Dessecador.
6. Forno de mufla.
7. Copos de formato alto, 400 m1.
8. Balança analítica, capaz de pesar até 0,1 mg.
9. Medidor de pH, calibrado para precisão de 0,1 unidade de pH, usando tampões pH 4.0 e 7.0.
Reagentes
1. Etanol, 95% v / v, grau técnico.
2. Etanol, 78%. Coloque 207 ml de água em um balão volumétrico de 1 litro. Dilua em volume com 95% de etanol. Misture bem. Prepare mais, se necessário.
3. Acetona, grau reagente.
4. Tampão fosfato, 0,08 M, pH 6,0. Dissolver 1,400 g de Na fosfato anidro (Na2HPO4) ou 1,753 g di-hidratado e 9,68 g de Na-fosfato monobásico monohidratado (NaH2PO4 · H20) ou 10,94 g de di-hidrato em cerca de 700 ml de água destilada. Dilua a 1 litro com água. Verifique o pH com o medidor de pH.
5. Solução de amilase termoestável.
6. Protease. Mantenha refrigerado.
7. Amiloglucosidase. Mantenha refrigerado.
8. Solução de hidróxido de sódio, 0,275N. Dissolva 11,00 g de NaOH grau ACS em cerca de 700 ml de água destilada, usando as precauções de manuseamento apropriadas, em um balão volumétrico de 1 litro. Arrefecer e diluir em volume com água.
9. Solução de ácido clorídrico, 0,325N. Dilua a solução stock de título conhecido (isto é, 325 ml de HC1 1,0 N) para 1 litro com água em balão volumétrico.
10. Celite, lavada com ácido.
Procedimento
Pureza enzimática
Para assegurar a presença de atividade enzimática apropriada e ausência de atividade enzimática indesejável quando este procedimento é usado para grãos e produtos de cereais, utilize os materiais listados abaixo durante todo o procedimento. Cada novo lote de enzimas deve ser testado, assim como enzimas que não foram testadas nos 6 meses anteriores.
Preparação da amostra
 A fibra dietética total deve ser determinada na base da amostra seca com pouca gordura ou sem gordura. Homogeneizar amostra, pesar e secar durante a noite em forno de vácuo de 70 °. Deixe esfriar no dessecador, reponha e registre a perda de peso devido à secagem. Porção de moinho seco da amostra seca para 0,3-0,5 mm de malha. Se a amostra não puder ser aquecida, liofilize antes de moer. Se alto teor de gordura (> 10%) impedir a moagem adequada, desidratar com éter de petróleo (três vezes com porções de 25 m1 por grama de amostra) antes de moer. Ao analisar dietas mistas, sempre extraia gordura antes de determinar o TDF. Registre a perda de peso devido à gordura. Corrigir a determinação final da fibra dietética percentual para umidade e gordura removidas. Armazene a amostra moída a seco em frasco tampado no dessecador até a análise ser executada. 
Método 
Executar em branco através de todo o processo junto com amostras para medir qualquer contribuição de reagentes para resíduos.
Fibra Dietética Total (continuação)
1. Pesar amostras duplicadas de 1 g, com precisão de 0,1 mg, em béqueres de 400 ml de altura. Os pesos das amostras devem diferir <20 mg um do outro. Adicione 50 ml de tampão fosfato pH 6,0 a cada copo e verifique o pH com o medidor de pH. Ajuste se o pH não for igual a 6,0 ± 0,1.
2. Adicione 0,2 ml de solução de amilase termoestável.
3. Cubra o copo com papel de alumínio e coloque em banho-maria a ferver durante 15 min. Agite suavemente em intervalos de 5 minutos. Nota: Aumente o tempo de incubação quando o número de béqueres no banho dificulta que o conteúdo do béquer atinja a temperatura interna de 100 °. Use o termômetro para indicar que 15 min a 100 ° é atingido. O total de 30 min no banho de água a ferver deve ser suficiente.
4. Soluções frias para a temperatura ambiente.
5. Ajustar para pH 7,5 ± 0,1 adicionando 10 ml de solução 0,275N NaOH. Verifique o pH com o medidor de pH.
6. Adicione 5 mg de protease. Protease adere à espátula, por isso, pode ser preferível preparar a solução de enzima (5 mg em 0,1 ml de tampão de fosfato) imediatamente antes da utilização e quantidade de pipeta necessária.
7. Cubra o copo com folha de alumínio e incube a 60 ° com agitação contínua durante 30 min.
8. Resfrie e adicione 10 ml de solução HCl 0,325N para ajustar o pH a 4,5 ± 0,2. Verifique o pH com o medidor de pH.
9. Adicione 0,3 ml de amiloglucosidase, cubra com papel alumínio e incube durante 20 min a 60 ° com agitação contínua.
10. Adicione 280 ml de EtOH a 95% pré-aquecido a 60 ° (medir o volume antes de aquecer). Deixe precipitar forma à temperatura ambiente por 60 min.
11. Pesar o cadinho contendo Celite para 0,1 mg mais próximo, depois molhar e distribuir o leito de Celite no cadinho, utilizando uma corrente de EtOH a 78% do frasco de lavagem.
12. Aplique sucção para desenhar Celite em vidro frito como tapete plano. Manter a sucção e transferir quantitativamente o precipitado da enzima digerida para o cadinho.
13. Lavar o resuo sucessivamente com tr pores de 20 m1 de EtOH a 78%, duas pores de 10 m1 de EtOH a 95% e duas pores de 10 ml de acetona. Em alguns casos, as gomas podem se formar durante a filtração, prendendo o líquido no resíduo. Em caso afirmativo, quebrar a película da superfície com espátula para melhorar a filtragem. Longos tempos de filtração podem ser evitados com uma sucção intermitente cuidadosa durante toda a filtração.
14. Secar o cadinho contendo resuos durante a noite em forno de vuo a 70 ou forno a 105 de ar.
15. Resfrie em dessecador e pese até 0,1 mg. Subtraia os pesos de cadinho e celite para determinar o peso do resíduo.
16. Analise o resíduo de uma amostra de um conjunto de duplicados para proteína pelo Método 46-13.01, usando N x 6,25 como fator de conversão.
17. Incinerar a segunda amostra de resíduo de duplicado durante 5 horas a 525 °. Arrefecer em dessecador e pesar até 0,1 mg. Subtraia os pesos de cadinho e celite para determinar as cinzas. 
Cálculos
Resíduo branco médio não corrigido (UABR) = resíduo branco médio de duplicado em branco (a partir do passo 15) em mg Resíduo de proteína em branco (BPR) = UABR x% de proteína em branco (etapa 16) / 100 Resíduo de cinza em branco (BAR) = UABR x% de cinza em branco (etapa 17) / 100 Resíduo em branco (CB) = UABR - BPR - BAR Resíduo de amostra médio não corrigido (UASR) = Resíduo de amostra médio de amostras duplicadas (a partir do passo 15) em mg Exemplo de resíduo proteico (SPR) = UASR x% proteína na amostra (etapa 16) / 100 Amostra de resíduo de cinza (SAR) = UASR x% de cinza na amostra (etapa 17) / 100 Resíduo de amostra corrigido (CSR) = UASR - SPR - SAR - CB TDF percentual = 100 x CSR / mg de amostra Corrigir o percentual final de TDF para gordura e / ou água se o desengorduramento e / ou secagem da amostra foi feito durante a etapa de preparação da amostra.