Atividade Enzimática: pH e Temperatura

Prévia do material em texto

<p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>UNIVERDIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE</p><p>CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE</p><p>FACULDADE DE FARMÁCIA</p><p>DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA</p><p>APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS</p><p>ENZIMOLOGIA</p><p>Profª Cristiane Assis</p><p>Prof. Matheus Pedrosa</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>AULA PRÁTICA 1</p><p>INFLUÊNCIA DO pH E DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA</p><p>A enzima α-amilase salivar catalisa a hidrólise das ligações osídicas α-1-4 da</p><p>cadeia glicosídica do polissacarídeo amido. A hidrólise do amido, catalisada pela α-</p><p>amilase, é considerada parcial e os produtos resultantes são uma mistura de moléculas de</p><p>glicose, maltose e dextrina.</p><p>A hidrólise do amido pode ser evidenciada na presença de iodo. Devido à</p><p>hidrólise, o tamanho da cadeia glicosídica do amido diminui e a reação com o iodo não</p><p>ocorre, deixando de ser evidente a coloração azul arroxeada característica.</p><p>A atividade enzimática de hidrólise do polissacarídeo amido, pela enzima α-</p><p>amilase salivar, pode ser evidenciada em condições ideais de temperatura (37°C) e pH</p><p>6,8.</p><p>O efeito da temperatura sobre a velocidade das reações enzimáticas é duplo. A</p><p>velocidade da reação aumenta com o aumento da temperatura até que um máximo seja</p><p>atingido, num mecanismo denominado de ativação térmica. Acima da temperatura de</p><p>atividade enzimática máxima, ocorre diminuição da velocidade da reação devido ao</p><p>processo de desnaturação proteica.</p><p>As enzimas apresentam atividade máxima em um determinado valor ou faixa de pH,</p><p>denominado de pH ótimo. A variação do pH afeta o caráter iônico dos grupos carboxila</p><p>e amina dos aminoácidos, o que pode acarretar alteração da conformação da molécula e</p><p>impedir a ligação do substrato no sítio ativo da enzima, alterando a atividade.</p><p>1. AMOSTRA E REAGENTES:</p><p>§ Solução de saliva 1:4 (coletar 1 mL de saliva e diluir com 3 mL de tampão fosfato</p><p>pH 6,8);</p><p>§ Solução de amido 0,5%;</p><p>§ Solução de glicose 1%;</p><p>§ Solução de lugol;</p><p>§ HCl P.A.;</p><p>§ Solução de NaOH 0,1M;</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>2. MATERIAL:</p><p>§ Banho-maria a 37°C;</p><p>§ Banho de gelo;</p><p>§ Banho de água fervente;</p><p>§ Tubos de ensaio;</p><p>§ Pipeta de Pasteur;</p><p>§ Pipeta automática;</p><p>§ Tubos de fundo cônico;</p><p>§ Estante para tubos de ensaio.</p><p>3. CARACTERIZAÇÃO DOS PADRÕES:</p><p>§ Identificar 2 tubos de ensaio e proceder conforme esquema abaixo:</p><p>§ Homogeneizar e observar:</p><p>§ Coloração azul-arroxeada evidencia a formação de complexo de iodo com o</p><p>polissacarídeo amido, caracterizando um padrão indicativo de que não</p><p>ocorreu hidrólise;</p><p>§ Coloração amarela caracteriza padrão de hidrólise total do amido;</p><p>§ Reservar os tubos para comparação com a análise das amostras a seguir.</p><p>4. AVALIAÇÃO DO EFEITO DO pH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA:</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>§ Identificar 3 tubos de ensaio e proceder conforme esquema abaixo:</p><p>§ Agitar e observar a coloração.</p><p>§ Comparar com a coloração das soluções padrões e verificar a hidrólise de cada</p><p>amostra.</p><p>5. AVALIAÇÃO DO EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE</p><p>ENZIMÁTICA:</p><p>§ Identificar 3 tubos de ensaio e proceder conforme esquema abaixo:</p><p>§</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>§ Agitar e observar a coloração.</p><p>§ Comparar com a coloração das soluções padrões e verificar a hidrólise de cada</p><p>amostra.</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>AULA PRÁTICA 2</p><p>DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E ESPECÍFICA</p><p>A enzima α-amilase salivar catalisa a hidrólise das ligações osídicas α-1-4 da</p><p>cadeia glicosídica do polissacarídeo amido.</p><p>A hidrólise do amido pode ser evidenciada na presença de iodo. A medida que a</p><p>reação acontece a intensidade da coloração azul escuro diminui até que se observe uma</p><p>solução amarela característica da hidrólise do amido.</p><p>A atividade enzimática (U/mL) da α-amilase pode ser determinada pelo método</p><p>dextrinizante. Este método se baseia na variação da intensidade da cor do complexo iodo-</p><p>amido formado no decorrer da reação (FUWA, 1954).</p><p>A determinação da concentração proteica pode ser realizada pelo método de</p><p>Bradford. Este método se baseia na interação entre o corante Coomassie brilliant blue e</p><p>macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou</p><p>aromáticas.</p><p>A atividade específica (U/mg) da enzima de interesse pode ser determinada pelo</p><p>quociente entre a atividade enzimática (U/mL) e a concentração proteica (mg/mL).</p><p>1 MATERIAL:</p><p>§ Espectrofotômetro UV/Vis;</p><p>§ Agitador do tipo vórtex;</p><p>§ Banho-maria 37°C;</p><p>§ Pipeta automática de 100 µL;</p><p>§ Pipeta automática de 1000 µL;</p><p>§ Pipeta graduada de 4 mL;</p><p>§ Pipetador manual (pêra ou lápis);</p><p>§ Tubos de ensaio.</p><p>2 AMOSTRAS E REAGENTES:</p><p>§ Solução de saliva (1 volume de saliva + 4 volumes de tampão fosfato 7,4);</p><p>§ Reagente de Bradford;</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>§ Solução de Iodo (0,3% de KI + 0,03% de I2);</p><p>§ Tampão Fosfato 7,4;</p><p>§ Solução de HCl 0,5 M;</p><p>§ Solução de amido 0,5%.</p><p>3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE AMILOLÍTICA DEXTRINIZANTE</p><p>§ Em 3 (três) tubos de ensaio, adicionar 1 mL de tampão fosfato e 2 mL solução de</p><p>amido 0,5%. Homogeneizar.</p><p>§ Identificar cada tubo com os tempos de 0, 1 e 3 minutos;</p><p>§ Levar os tubos para o banho-maria a 37°C;</p><p>§ Deixar os tubos em banho-maria por 1 minuto;</p><p>§ Adicionar 100 µL da amostra previamente diluída em todos os tubos. Cronometrar</p><p>o tempo de incubação a partir da primeira amostra;</p><p>§ Homogeneizar todos os tubos.</p><p>§ Parar a reação de cada tubo em seu referido tempo de incubação com o auxílio de</p><p>4 mL de HCl 0,5 M;</p><p>§ Adicionar 0,5 mL de solução de iodo em cada tubo. Observar!</p><p>§ Diluir a amostra com auxílio de 10 mL de água.</p><p>§ Realizar a leitura dos tubos em espectrofotômetro a 700 nm.</p><p>4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTEICA PELO MÉTODO</p><p>DE BRADFORD</p><p>§ Em 2 (dois) tubos de ensaio, pipetar 3 mL do reagente de Bradford;</p><p>§ Identificar os tubos como branco (Br) e amostra (Am);</p><p>§ No tubo do branco, pipetar 100 µL de água;</p><p>§ No tubo da amostra, pipetar 100 µL de saliva previamente diluída;</p><p>§ Agitar os tubos em vórtex por 30 segundos;</p><p>§ Deixar em repouso por 15 minutos na bancada;</p><p>§ Realizar a leitura em espectrofotômetro a 595 nm;</p><p>§ O cálculo para determinação de proteínas deverá ser feito através da curva padrão</p><p>de albumina abaixo.</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>5 CÁLCULO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA (U/mL)</p><p>Considere cada unidade de atividade como sendo a quantidade de enzima necessária</p><p>para reduzir em 10% a intensidade da cor azul do complexo iodo-amido por minuto.</p><p>6 CÁLCULO DA ATIVIDADE ESPECÍFICA (U/mg)</p><p>A determinação da atividade específica de uma enzima se baseia no quociente entre</p><p>a atividade enzimática (U/mL) pela concentração proteica</p><p>7 QUESTÕES PARA RESPONDER:</p><p>a) Calcule a atividade enzimática (U/mL) da α-amilase.</p><p>b) Calcule a atividade específica (U/mg) da enzima α-amilase.</p><p>c) Correlacione o gradiente de cores observados na determinação da atividade</p><p>amilolítica com a atividade da enzima em estudo.</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>AULA PRÁTICA 3</p><p>EXTRAÇÃO DE ENZIMAS DAS FOLHAS DE MANGUEIRA</p><p>(Mangifera indica L) E DA BATATA INGLESA (Solanum tuberosum)</p><p>1 AMOSTRAS E REAGENTES:</p><p>§ Batata inglesa (Solanum tuberosum);</p><p>§ Folha da Mangueira (Mangifera indica L);</p><p>§ Tampão Fosfato de Potássio 50 mM, pH 7,0.</p><p>2 MATERIAL:</p><p>§ Agitador do tipo vórtex;</p><p>§ Balança semi-analítica;</p><p>§ Banho de gelo;</p><p>§ Béquer;</p><p>§ Blender;</p><p>§ Centrífuga;</p><p>§ Funil;</p><p>§ Placa de petri;</p><p>§ Gral e pistilo;</p><p>§ Pipeta de Pasteur;</p><p>§ Pipeta graduada;</p><p>§ Pipetador manual;</p><p>§ Pisseta com água destilada;</p><p>§ Sonicador;</p><p>§ Tubo de fundo cônico;</p><p>Laboratório de Enzimologia</p><p>Bioprocessos</p><p>3 PREPARO DOS EXTRATOS BRUTOS PROTEICOS:</p><p>a. FOLHA DA MANGUEIRA (Mangifera indica L)</p><p>§ Realizar a coleta do material (folhas de mangueira). Lavar com água destilada e</p><p>armazenar à -20°C;</p><p>§ Triturar o material em um blender até a obtenção de um pó grosseiro com tamanho</p><p>de partícula reduzido;</p><p>§ Pesar 2 g desse pó e macerar por 5 minutos em gral e pistilo com 12 mL do tampão</p><p>de extração gelado;</p><p>§ Transferir todo o conteúdo do gral, com auxílio de uma espátula, para um tubo de</p><p>centrífuga de 15 mL;</p><p>§ Sonicar o material, em banho de gelo, por 5 minutos;</p><p>§ Agitar no agitador do tipo vórtex por 1 minuto;</p><p>§ Centrifugar a 3.500 rpm por 20 minutos;</p><p>§ Após a centrifugação, recolher o sobrenadante (extrato bruto proteico) e descartar</p><p>o precipitado;</p><p>• Ao final, armazenar o extrato obtido a -20ºC para utilizar na aula de precipitação.</p><p>Os tubos devem ser identificados com o nome do extrato (extrato bruto proteico</p><p>da mangueira); número do grupo; turma; turno e o volume em mililitros.</p><p>b. BATATA INGLESA (Solanum tuberosum)</p><p>§ Pesar 4 g de batata inglesa descascada em uma placa de petri;</p><p>§ Cortar o material em pedaços menores;</p><p>§ Processar a batata inglesa picada em um blender juntamente com 12 mL de</p><p>tampão de extração gelado, até formar um líquido homogêneo;</p><p>§ Filtrar o material com algodão, com auxílio de um funil;</p><p>§ Coletar o filtrado e centrifugar a 3.500 rpm por 5 minutos;</p><p>§ Após a centrifugação, recolher o sobrenadante (extrato bruto proteico) e descartar</p><p>o precipitado;</p><p>§ Ao final, armazenar o extrato obtido a -20ºC, conforme o que foi realizada para</p><p>os extratos da folha da mangueira (Mangifera indica L).</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>QUESTÕES PARA PENSAR:</p><p>a) Qual a importância de se trabalhar a 4ºC (amostras e reagentes gelados)?</p><p>b) Quais foram os métodos de rompimento celular empregados? Qual o fundamento de</p><p>cada um deles?</p><p>c) Qual a importância de se guardar o extrato bruto em alíquotas?</p><p>OBSERVAÇÃO: Ao se trabalhar com enzimas, é de fundamental importância a</p><p>utilização do banho de gelo durante todos os procedimentos.</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>AULA PRÁTICA 4</p><p>MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS BASEADOS NA</p><p>SOLUBLIDADE</p><p>Com a utilização dos métodos de purificação baseados na solubilidade, espera-se</p><p>obter um material rico em proteínas através da remoção dos demais componentes do meio</p><p>(componentes não proteicos), consistindo assim em uma etapa inicial de purificação e</p><p>obtenção do produto final (proteína/enzima de interesse).</p><p>O método de precipitação com solventes orgânicos se baseia na diminuição da</p><p>constante dielétrica o que acarreta na diminuição da solubilidade das proteínas e aumento</p><p>da agregação por interações eletrostáticas.</p><p>Por outro lado, o método de precipitação por sais (salting out) se baseia na</p><p>diminuição da solubilidade das proteínas com adição de grandes quantidades de sal. O sal</p><p>compete com as proteínas por moléculas de água que, por sua vez, tem maior capacidade</p><p>de solvatação para partículas menores (os íons). Com isso, há tantos íons solvatados que</p><p>resta pouca água para dissolver as proteínas, que acabam por se agregarem.</p><p>1. MATERIAL:</p><p>§ Agitador do tipo vórtex;</p><p>§ Banho de gelo;</p><p>§ Centrífuga;</p><p>§ Pipeta de Pasteur;</p><p>§ Pipeta graduada de 2 mL;</p><p>§ Pipeta graduada de 5 mL;</p><p>§ Pipeta graduada de 10 mL;</p><p>§ Pipetador manual (pêra ou lápis);</p><p>§ Tubos de centrífuga de fundo cônico de 15 mL;</p><p>§ Tubos de ensaio.</p><p>2. AMOSTRAS E REAGENTES:</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>§ Extrato proteico das folhas da mangueira e da batata inglesa;</p><p>§ Solução de clara de ovo (1 volume de clara + 4 volumes de NaCl 1%);</p><p>§ Acetona gelada;</p><p>§ Tampão fosfato-salino (PBS);</p><p>§ Solução saturada de sulfato de amônio [(NH4)2SO4] (7,7g do sal em 10 mL de</p><p>água destilada);</p><p>§ Solução de NaCl 1%.</p><p>3. MÉTODO DE PURIFICAÇÃO: PRECIPITAÇÃO COM SOLVENTES</p><p>ORGÂNICOS</p><p>§ Em tubos falcon de 15 mL, adicionar 3 mL de cada extrato proteico da aula</p><p>anterior e 6 mL de acetona GELADA, homogeneizando bem o conteúdo com o</p><p>uso de agitador do tipo vórtex (aproximadamente 1 minuto);</p><p>§ Deixar em repouso no banho de gelo por 30 minutos;</p><p>§ Centrifugar a 3.500 rpm por 5 minutos;</p><p>§ Retirar todo o sobrenadante com o auxílio de uma pipeta de pasteur e descartá-lo;</p><p>§ Ao pellet (o precipitado, que contém as proteínas), adicionar 1 mL de PBS gelado</p><p>e ressuspender a amostra por agitação com o agitador vórtex (até perfeita</p><p>homogeneização do pellet);</p><p>§ Congelar os concentrados protéicos obtidos (folha da mangueira e batata inglesa)</p><p>devidamente identificados pelo grupo.</p><p>4. MÉTODO DE PURIFICAÇÃO: PRECIPITAÇÃO POR SAIS (SALTING</p><p>OUT)</p><p>§ Em um tubo de ensaio, pipetar 2 mL da solução de proteínas;</p><p>§ Adicionar, deixando escorrer pelas paredes do tubo, 2 mL da solução de sulfato</p><p>de amônio. Observe!</p><p>§ Misture o conteúdo do tubo (por inversão) e anote os resultados.</p><p>§ Repita as etapas anteriores usando NaCl (cloreto de sódio) ao invés de (NH4)2SO4.</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>5. QUESTÕES PARA PENSAR:</p><p>a) Qual o princípio do processo de precipitação de proteínas em acetona e suas</p><p>vantagens?</p><p>b) Explique o fundamento do método de precipitação utilizando o sal (NH4)2SO4.</p><p>c) Diferencie salting in e salting out.</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>BIOPROCESSOS</p><p>PRODUÇÃO DE ENZIMAS</p><p>(2ª Unidade)</p><p>Enzimologia</p><p>Profa. Cristiane</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>AULA PRÁTICA 1</p><p>PRODUÇÃO DE ETANOL</p><p>A fermentação alcoólica é tão antiga quanto à agricultura. Teve início há 10.000</p><p>anos, sendo o vinho, a cerveja e o pão os primeiros produtos obtidos por esse processo</p><p>fermentativo. Atualmente, esses produtos continuam apresentando importância</p><p>econômica e social em todo o mundo. No Brasil, o mercado de produtos obtidos por</p><p>fermentação alcoólica movimenta bilhões de dólares e emprega diretamente mais de um</p><p>milhão de pessoas. Na indústria de alimentos são gerados materiais de origem não</p><p>intencionais denominados resíduos. Para não prejudicar o meio ambiente os resíduos</p><p>gerados podem ser reaproveitados na produção de outros compostos. Nos dias atuais a</p><p>busca por novas fontes para produção de etanol tem colocado os resíduos das indústrias</p><p>de alimentos com grandes potenciais para a utilização de novos substratos para produção</p><p>do etanol.</p><p>1. PREPARO DO MEIO DE CULTIVO</p><p>a) Material:</p><p>• Autoclave;</p><p>• Balança semi-analítica</p><p>• Erlenmeyer de 500 mL</p><p>• Substrato.</p><p>b) Procedimento</p><p>O meio de cultivo utilizado na prática será o suco de abacaxi que deve ser enriquecido</p><p>com os seguintes sais:</p><p>Extrato de levedura – 1%</p><p>Na2HPO4–0,5%</p><p>NaCl– 0,5%</p><p>(NH4)SO4–0,5%</p><p>CaCl2.H2O–0,5%</p><p>MgSO4.7H2O–0,5%</p><p>• Suco da casca do abacaxi –</p><p>300mL</p><p>• Extrato de levedura- 1 g</p><p>• Na2HPO4 – 0,5g</p><p>• NaCl – 0,5g</p><p>• (NH4)SO4 – 0,5g</p><p>• CaCl2.H2O – 0,5g</p><p>• MgSO4.7H2O – 0,5g</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>2. CORREÇÃO DO pH:</p><p>a) Material:</p><p>• pHmêtro</p><p>• NaOH e/ou HCl para ajuste do pH do meio</p><p>b) Procedimento:</p><p>Medir o pH do meio de cultivo e ajustar para 5,0 se</p><p>necessário.</p><p>3. DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS UTILIZANDO</p><p>REFRATOMETRO - ºBRIX</p><p>Transferir de 3 a 4 gotas da amostra homogeneizada para o prisma do</p><p>refratômetro. Ler diretamente na escala ºBrix.</p><p>RELAÇÃO ºBRIX E SACAROSE:</p><p>3. DETERMINAÇÃO DOS AÇÚCARES REDUTORES</p><p>a)Material</p><p>• Espectrofotômetro</p><p>• Tubos de ensaio</p><p>• Ácido dinitrosalicílico (DNS)</p><p>• Água destilada</p><p>Concentração de sacarose (g/L) = ºBrix x 10,13+1,445</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>• Pipeta automática</p><p>• Pipeta de vidro</p><p>• Pipetador (pêra)</p><p>OBS.:</p><p>Amostra = Sobrenadante da etapa de determinação de biomassa</p><p>b) Procedimento</p><p>Em dois tubos de ensaio, nomear um como Branco (B) e o outro tubo como</p><p>Amostra (A). Pipetar 0,5 mL do meio de cultivo (se necessário fazer a diluição) e</p><p>adicionar ao tubo Amostra. Pipetar 0,5 mL de água destilada no tubo Branco. Adicionar</p><p>2,5 mL do reagente DNS em cada tubo. Levar para banho-maria a 100ºC durante 10</p><p>minutos. Retirar do banho fervente e colocar em um banho de água fria até que atinja a</p><p>temperatura ambiente; adicionar 3 mL de água destilada. A cor é estável durante 30</p><p>minutos. Homogeneizar e ler absorbância a 600 nm, zerando o aparelho com o branco da</p><p>amostra.</p><p>5.1 . PARA CÁLCULO DOS AÇÚCARES REDUTORES</p><p>A concentração dos açúcares redutores deverá ser feita com base na curva padrão.</p><p>Utilizar como curva padrão:</p><p>Obs.: Lembre-se de multiplicar o valor obtido pela diluição realizada</p><p>0,5mLcaldo fermentado + 2,5 mL DNS 100ºC/10 min 3 mL H2O</p><p>600 nm</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>AULA PRÁTICA 2</p><p>4. INOCULAÇÃO DO MICRORGANISMO</p><p>Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo eucariota unicelular que pertence</p><p>ao Reino dos Fungos. É a levedura utilizada na produção do pão e também da cerveja e</p><p>também usada para a produção de enzimas.</p><p>a) Material</p><p>• Fermento biológico</p><p>• Becker</p><p>• Espátula</p><p>b) Procedimento</p><p>Pesar em um Becker com auxílio de uma espátula 15 g do fermento biológico e</p><p>transferir para o meio de cultivo.</p><p>5. DETERMINAÇÃO DA BIOMASSA</p><p>a)Material</p><p>• Tubos falcon</p><p>• Centrífuga</p><p>• Estufa</p><p>• Pipeta (2 mL)</p><p>b) Procedimento</p><p>Pesar 1 tubo falcon que se encontra no dessecador. Após pesagem transferir 2 mL</p><p>do meio juntamente com as células e centrifugar (15 minutos por 4.500 rpm). Retirar o</p><p>sobrenadante e colocar em outro tubo falcon. Em seguida levar a estufa para secar a 80ºC</p><p>por aproximadamente 24hs.</p><p>15g</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>CÁLCULO DA BIOMASSA EM (g/L)</p><p>3. DETERMINAÇÃO DOS AÇÚCARES TOTAIS</p><p>a)Material:</p><p>• Balão volumétrico de 100mL</p><p>• Proveta de 50mL</p><p>• Pipeta de 2mL</p><p>• Pipeta de 1 mL</p><p>• Pipetador (pêra)</p><p>• HCl P.A.</p><p>• Solução de NaOH 40%</p><p>• Água destilada</p><p>• Ácido dinitrosalicílico (DNS)</p><p>• Fenolftaleína</p><p>HIDRÓLISE ÁCIDA DO MEIO DE CULTIVO PARA DETERMINAÇÃO DE</p><p>AÇÚCARES TOTAIS:</p><p>b) Procedimento:</p><p>Para determinação de açúcares totais, transferir 1 mL da amostra para um</p><p>balão volumétrico de 100 mL com o auxílio de 50 mL de água destilada e adicionar</p><p>2 mL de HCl concentrado na capela. Homogeneizar o conteúdo do balão por</p><p>Peso do tubo falcon (g) Peso do Tubo falcon + células (após secagem)</p><p>Ppt – Estufa (80ºC)</p><p>Sbn- açúcares redutores</p><p>Equação: g (células)/2mL*1000</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>inversão. Levar para banho-maria a 100ºC durante 10 minutos. Deixar esfriar, no</p><p>banho de gelo. Adicionar 1 gota de fenolftaleína. Acrescentar solução de NaOH</p><p>40% até neutralidade (até o ponto de viragem, que apresenta coloração rosa),</p><p>homogeneizando o balão volumétrico. Em seguida completar com água destilada o</p><p>volume do balão (completar para 100mL). Homogeneizar o conteúdo do balão por</p><p>inversão.</p><p>MÉTODO DNS</p><p>b) Procedimento</p><p>Em dois tubos de ensaio, nomear um como Branco (B) e o outro tubo como</p><p>Amostra (A). Pipetar 0,5 mL do meio de cultivo (se necessário fazer a diluição*) e</p><p>adicionar ao tubo Amostra. Pipetar 0,5 mL de água destilada no tubo Branco. Adicionar</p><p>2,5 mL do reagente DNS em ambos os tubos. Levar para banho-maria a 100ºC durante</p><p>10 minutos. Retirar do banho fervente e colocar em um banho com água equilibrada à</p><p>temperatura ambiente e deixar esfriar durante 3 – 5 minutos; adicionar 3 mL de água</p><p>destilada. A cor é estável durante 30 minutos. Agitar e ler absorbância a 600 nm, zerando</p><p>o aparelho com o branco da amostra.</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>AULA PRÁTICA 3</p><p>6. DETERMINAÇÃO DA BIOMASSA APÓS A FERMENTAÇÃO</p><p>a)Material</p><p>• Tubos falcon</p><p>• Pipeta de vidro de 2 mL</p><p>• Pipeta de vidro de 10 mL</p><p>• Pipetador</p><p>b) Procedimento</p><p>Pesar 1 tubo falcon que está no dessecador. Após pesagem transferir 2 mL do</p><p>caldo fermentado juntamente com as células e centrifugar (15 minutos á 4.500 rpm).</p><p>Retirar o sobrenadante e colocar em outro tubo falcon. Em seguida levar a estufa para</p><p>secar a 80ºC.</p><p>Centrifugar em um tubo falcon 10mL do caldo fermentado. Utilizar o</p><p>sobrenadante para determinação da atividade enzimática, açúcares redutores e ºBrix.</p><p>7. pH APÓS A FERMENTAÇÃO</p><p>a) Material:</p><p>• pHmêtro.</p><p>b) Procedimento</p><p>Medir o pH do meio de cultivo</p><p>8. DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS APÓS A FERMENTAÇÃO</p><p>b) Procedimento</p><p>Transfira de 3 a 4 gotas da amostra homogeneizada para o prisma do refratômetro.</p><p>Ler diretamente na escala ºBrix a 20ºC. Converter ºBrix para concentração de sacarose.</p><p>RELAÇÃO ºBRIX E SACAROSE:</p><p>Concentração de sacarose (g/L) = ºBrix x 10,13+1,445</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>8.1. DETERMINAÇÃO DOS AÇÚCARES REDUTORES APÓS A</p><p>FERMENTAÇÃO</p><p>a)Material</p><p>• Tubos de ensaio</p><p>• Ácido dinitrosalicílico (DNS)</p><p>• Água destilada</p><p>• Pipeta automática</p><p>• Pipeta de vidro</p><p>• Pipetador</p><p>b) Procedimento</p><p>Em dois tubos de ensaio, nomear um como Branco (B) e o outro tubo como</p><p>Amostra (A). Pipetar 0,5 mL do meio de cultivo (se necessário fazer a diluição) e</p><p>adicionar ao tubo Amostra. Pipetar 0,5 mL de água destilada no tubo Branco. Adicionar</p><p>2,5 mL do reagente DNS em cada tubo. Levar para banho-maria a 100ºC durante 10</p><p>minutos. Retirar do banho fervente e colocar em um banho com água equilibrada à</p><p>temperatura ambiente e deixar esfriar durante 3 – 5 minutos; adicionar 3 mL de água</p><p>destilada. A cor é estável durante 30 minutos. Agitar e ler absorbância a 600 nm, zerando</p><p>o aparelho com o branco da amostra.</p><p>0,5mL caldo fermentado</p><p>2,5 mLDNS</p><p>100ºC/10 min 3 mL H2O</p><p>600 nm</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>3. DETERMINAÇÃO DOS AÇÚCARES TOTAIS APÓS A</p><p>FERMENTAÇÃO</p><p>a)Material</p><p>• Balão volumétrico de 100 mL</p><p>• Proveta de 50mL</p><p>• Pipeta de 2 mL</p><p>• Pipeta de 1 mL</p><p>• Pipetador</p><p>• HCl P.A.</p><p>• Solução de NaOH 40%</p><p>• Água destilada</p><p>• Ácido dinitrosalicílico (DNS)</p><p>HIDRÓLISE ÁCIDA DO MEIO DE CULTIVO PARA DETERMINAÇÃO DE</p><p>AÇÚCARES TOTAIS:</p><p>b) Procedimento</p><p>Para determinação de açúcares totais, transferir 1 mL da amostra para um</p><p>balão volumétrico de 100 mL com o auxílio de 50 mL de água destilada e adicionar</p><p>2 mL de HCl concentrado na capela. Homogeneizar o conteúdo do balão por</p><p>inversão. Levar para banho–maria a 100ºC durante 10 minutos. Deixar esfriar.</p><p>Acrescentar solução de NaOH 40% até neutralidade e completar com água destilada</p><p>o volume do balão. Homogeneizar o conteúdo do balão por inversão.</p><p>MÉTODO DNS</p><p>b) Procedimento</p><p>Em dois tubos de ensaio, nomear um como Branco (B) e o outro tubo como</p><p>Amostra (A). Pipetar0,5 mL do meio de cultivo (se necessário fazer a diluição) e</p><p>adicionar ao tubo Amostra. Pipetar 0,5 mL de água destilada no tubo Branco. Adicionar</p><p>2,5 mL do reagente DNS. Levar para banho-maria a 100ºC durante 10 minutos. Retirar</p><p>do banho fervente e colocar em um banho com água equilibrada à temperatura ambiente</p><p>e deixar esfriar durante 3 – 5 minutos; adicionar 3 mL de água destilada. A cor é estável</p><p>durante 30 minutos. Agitar e ler absorbância a 600 nm, zerando o aparelho com o branco</p><p>da amostra.</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>AULA PRÁTICA 4</p><p>9. Destilação do Caldo Fermentado</p><p>a)Material</p><p>• Condensador de Liebig</p><p>• Balão de destilação de 500 mL</p><p>• Proveta de 250 mL</p><p>• Água destilada</p><p>b) Procedimento</p><p>Transferir, para um balão de destilação (500mL) 250 mL da amostra. Ligar</p><p>o balão de destilação</p><p>a um condensador de Liebig, e destilar. Receber</p><p>aproximadamente 160 mL do destilado em uma proveta 250 mL (preparar um</p><p>banho com gelo, no frasco receptor, para evitar aquecimento do destilado).</p><p>Completar o volume para 250 mL (volume inicial) com água destilada.</p><p>10. Quantificação do Etanol pelo método do dicromato de potássio</p><p>Análise quantitativa da produção do etanol na presença do dicromato de potássio</p><p>K2Cr2O7 em solução ácida. O produto destilado que contém o álcool etílico na presença</p><p>de uma solução ácida contendo dicromato de potássio se tornará verde.</p><p>CH3CH2OH + K2Cr2O7 + 4H2SO4 → CH3COOH + K2SO4 + Cr2(SO4)3 + 5H2O</p><p>a)Material</p><p>• Destilado diluído</p><p>• Solução de dicromato 10%</p><p>• Ácido sulfúrico concentrado</p><p>b) Procedimento</p><p>Em um tubo pipetar 2,5 mL do destilado diluído + 2,5 mL de ácido sulfúrico,</p><p>em seguida adicionar 0,5 mL solução de dicromato 10%. Fazer leitura em 600 nm</p><p>no espectrofotômetro. FAZER O BRANCO!!! Calcular de acordo com a equação</p><p>da reta: Y = 16,61x + 0,588</p><p>REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS</p><p>Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem.</p><p>31, 426-428.</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE</p><p>CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE - DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA</p><p>DISCIPLINA DE ENZIMOLOGIA</p><p>GRUPO:_________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>RESULTADOS OBTIDOS</p><p>Antes Fermentação Após a Fermentação</p><p>pH</p><p>ºBrix</p><p>Sacarose (g/L)</p><p>Massa seca (g/L)</p><p>Açúcares redutores (g/L)</p><p>Açúcares totais (g/L)</p><p>Etanol (mg/mL)</p><p>Substrato:</p><p>Etanol (mg/mL)</p><p>Substrato:</p><p>Etanol (mg/mL)</p><p>Substrato:</p><p>Etanol (mg/mL)</p><p>Substrato:</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>CONCLUSÕES</p><p>________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>______________________________________________________________________</p><p>Laboratório de Enzimologia Bioprocessos</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>ABRAHÃO NETO, J. Purificação de Enzimas. In: SCHIMIDELL, W. et al. (Org.).</p><p>Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. São Paulo: Edgard Blücher Ltda, 2001.</p><p>v. 3. cap. 17.</p><p>NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: Princípios de Bioquímica. 3ª Ed. São Paulo,</p><p>2002.</p><p>NOVAKI, L.; HASAN, S. D. M.; KADOWAKI, M. K.; ANDRADE, D. Produção de</p><p>invertase por fermentação em estado sólido a partir de farelo de soja. Engevista, v. 12, n.</p><p>2, -. 131-140, 2010.</p><p>VOET, D.; VOET, J. G.; PRATT, C. W. Fundamentos de Bioquímica: A vida em nível</p><p>molecular. 2ª Ed. Porto Alegre: Artmed, 2008.</p><p>FUWA, H. A. New method for microdetermination of amylase activity by the use of</p><p>amylose as the substrate. Journal of Biochemistry. v. 41, p. 583-603, 1954.</p><p>ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via</p><p>espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, v.</p><p>21, n. 6, 1998.</p>