ROTEIRO_WESTERN_BLOT

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
ESPECIALIZAÇÃO LATU SENSU EM BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A SAÚDE HUMANA 
DOCENTE: DR. MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA 
 
 
 
 
WESTERN BLOT 
 
Introdução 
 
A técnica de Western Blotting desde a sua introdução em 1979 (Towbin et al. 1979) tornou-
se uma ferramenta de rotina importante utilizada em laboratórios de pesquisa. Também conhecida 
como immunoblot, protein blotting esta técnica é tradicionalmente utilizada para detectar pequenas 
quantidades de proteínas a partir de uma mistura complexa de proteínas. A técnica fundamenta-se 
em três elementos básicos (1) separação das proteínas por tamanho em eletroforese em gel de 
poliacrilamida (2) eletrotransferência para um suporte sólido (por exemplo, PVDF) e (3) marcação de 
proteínas alvo utilizando um anticorpo primário e secundário específicos para a imunodetecção. Este 
método fornece informação sobre a massa molecular de proteínas individuais e é capaz de distinguir 
isoformas, produtos de processamento alternativo e outras formas de modificações pós- 
traducionais. 
 Em laboratórios clínicos e de biologia molecular, o Western blot é útil em diversos campos 
de atuação principalmente por se tratar de uma técnica de alta sensibilidade e especificidade (Bauer, 
2001; Mylonakis et al., 2000; Heermann et al., 1988), além de ser um método de fácil execução e 
acessível aos laboratórios de pesquisa e de serviço de rotina diagnóstica. Exemplos de aplicações 
da técnica de Western Blot incluem o diagnóstico de doenças infecciosas e parasitárias 
(Encefalopatias espongiformes transmissíveis, leishmaniose visceral americana, salmonelose, 
Mycoplasma hyopneumoniae (suínos). No campo da pesquisa: neoplasias, doenças hereditárias e 
na descoberta de proteínas para a produção de vacinas. 
 
 
 
 
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ROTEIRO AULA PRÁTICA 
 
WESTERN BLOT 
 
 
I - Preparo do gel de poliacrilamida –SDS PAGE 
 
 Para preparar o gel de separação, deve-se pipetar: 
 
Gel de separação 12 % 1 gel 
Água destilada 2513 µL 
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 1875 µL 
SDS 10 % 75 µL 
Acrilamida/bis-acrilamida 30 % 3000 µL 
Persulfato de amônio (APS) 30 % 37,5 µL 
N,N,N',N'- Tetrametiletilenodiamina (TEMED) 3,75 µL 
 
 Em seguida, deve-se imediatamente com uma pipeta colocar o gel na placa até a marca 
limite. Logo em seguida, deve-se cobrir o gel com água, para que o gel fique perfeitamente 
alinhado. Aguardar a polimerização e em seguida preparar o gel de empacatomento. 
 
 
Gel de empacotamento (4 %) 1 gel 
Água destilada 1803 µL 
Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 752 µL 
SDS 10 % 30 µL 
Acrilamida/bis-acrilamida 30 % 397 µL 
Persulfato de amônio (APS) 30 % 15 µL 
N,N,N',N'- Tetrametiletilenodiamina (TEMED) 3 µL 
 
 
 Em seguida, com uma pipeta de 1 mL, colocar o gel na placa até o máximo de seu volume. 
A seguir, colocar o pente para a formação dos poços onde serão aplicadas as amostras. 
 Após polimerização do gel (cerca de 30 minutos), encher a câmara interna (a que fica em 
contato com o gel e amostra) com tampão de corrida. Com a câmara interna cheia, retirar os 
pentes cuidadosamente. 
 Lavar cada um dos poços com auxílio de uma pipeta automática, sugando e liberando 
repetidas vezes o próprio tampão de corrida presente nos poços para evitar obstrução dos 
mesmos por quaisquer resquícios de poliacrilamida não polimerizada. 
 Preparar as amostras na diluição de interesse (200ng/µL). 
 Desnaturar as proteínas a 95°C por 5 minutos. 
 Aplicar as amostras e o marcador de massa molecular. P.S: Anotar o mapa da sequência de 
aplicação das amostras no gel. 
 Preencher com aproximadamente 1L de tampão de corrida 1X e correr o gel nas seguintes 
condições: 
 100 V por aproximadamente 1h 30 min. Acompanhar a corrida constantemente e 
parar a corrida quando todo o tampão de amostra tiver corrido. O gel deve estar limpo. 
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Ao final da corrida, desprezar o tampão de corrida e preparar o aparato para a 
transferência das proteínas do gel para a membrana de PVDF. 
 
 
II – Transferência das proteínas do gel para a membrana de PVDF e imunodetecção 
 
 
 Em uma bandeja limpa adicionar o tampão de transferência e retirar o gel imerso do aparato 
de eletroforese. 
 Submergir os 4 filtros grossos, a membrana e os dois filtros finos na solução do tampão de 
eletroforese e aguardar cerca de 5 minutos. Após esse período preparar o sanduíche de 
transferência. 
 
Preparar o “sanduíche” conforme o esquema a seguir: 
 
o Filtro grosso 
o Filtro fino 
o Gel 
o Membrana 
o Filtro fino 
o Filtro grosso 
 
 
 
 
 
Figura 1: Sistema de transferência de tanque (molhado) 
 
Fonte: Protein Blotting Handbook – Disponível em www.merckmillipore.com 
 
 
 Colocar no ‘aparato’: membrana voltada para o lado transparente 
 Colocar os dois ‘aparatos’ na cuba: lado transparente voltado para o lado vermelho e 
preto com preto 
 
 
Esponja 
Filtro de papel 
Cassete 
Gel 
Membrana 
Filtro de papel 
Esponja 
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Figura 2: Esquema representantivo do sanduíche para transferência. 
 
 
 Colocar o tampão de transferência na cuba 
 Ligar o sistema de eletroforese na fonte com a amperagem em 200 mili A, 100V 
 Deixar transferindo por 1 hora 
Desligar a fonte e retirar o sanduíche da cuba eletroforética 
 Descartar o tampão de transferência 
 Retirar a membrana 
 Incubar a membrana no corante Vermelho de Ponceau sob agitação por 5 minutos 
para a visualização das bandas e confirmação do processo de transferência 
 Descorar a membrana com água destilada até ficar branca 
 Bloquear a membrana com leite desnatado (5%) + PBS-Tweeen 20 
 Adicionar BACT (1:1.000) ou NFKB (1:500) [anticorpos primários] dissolvido em leite 
(5%) + PBS- Tween 20 
 Incubar a membrana com o anticorpo overnight a 4° C sob leve agitação 
 Lavar a membrana 3x (10minutos cada lavagem), por com PBS- Tween 20. Manter 
sob agitação. 
 Adicionar anticorpo secundário dissolvido em leite (5%) + PBS- Tween 20 
na concentração de 1:10.000 
 Incubar por 1 hora a temperatura ambiente 
 Lavar a membrana 3x, (10minutos cada lavagem), com PBS- Tweeen 20 
 Revelar em solução de quimioluminescência (proporção 1:1) – 5 ml de solução A + 5 
ml de solução B (Kit ECL TM Prime Western Blotting Detection Reagent - GE 
Healthcare. 
 
 
 
 
 
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SOLUÇÕES PARA WESTERN BLOT 
 
 Solução de Bisacrilamida/Acrilamida 30%. 
Acrilamida (29%) 290 g 
Bisacrilamida (1%) 10 g 
Água destilada aquecida 1000 mL 
 
1. Verificar se o pH está a 7,0 ou menos. 
2. Estocar a solução em frasco âmbar na geladeira, por um período de 30 dias. 
 
 SDS 10%. 
SDS (PM 288,38) - 10% (m/v) 50 g 
Água destilada 500 mL 
 
1. Estocar a temperatura ambiente. 
 
 Persulfato de Amônio 10%. 
Persulfato de Amônio (PM 228,20) - 10% (m/v) 0,1 g 
Água destilada 1 mL 
 
1. Armazenar em freezer. 
 
 
 
 
 
 
 
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 Solução de TRIS-HCL (1,5M) pH 8,8. 
Tris Base (PM 121,1) - 1,5M 60,6 g 
Água destilada 400 mL 
HCl aq (concentrado) Gotas para ajustar pH 8,8 
Água destilada q.s.p 500 mL 
 
1. Dissolver o Tris Base em 400 mL de água destilada. 
2. Ajustar o pH para 8,8, adicionado gota a gota de HCl concentrado. 
3. Completar o volume para 500 mL. 
4. Armazenar em Geladeira. 
 
 Solução de TRIS-HCL (1M) pH 6,8. 
Tris Base (PM 121,1) - 1,0M 60,6 g 
Água destilada 400 mL 
HCl aq (concentrado) Gotas para ajustar pH 6,8 
Água destilada q.s.p 500 mL 
 
1. Dissolver o Tris Base em 400 mL de água destilada. 
2. Ajustar o pH para 6,8, adicionado gota a gota de HCl concentrado. 
3. Completar o volume para 500 mL. 
4. Armazenar em Geladeira. 
 
 Tampão de amostra. 
Água deionixada 3,8 mL 
1,0 M Tris-HCl, pH 6.8 1,0 mL 
Glycerol 0,8 mL 
10% (w/v) SDS 1,6 mL 
2-mercaptoetanol 0,4 mL 
1% (w/v) azul de bromofenol 0,4 mL 
 
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1. Armazenar em temperatura ambiente.Tampão do gel de corrida 10X, pH 8,3. 
Tris base 30,3 g 
Glicina 144,1 g 
SDS 10 g 
Água destilada q.s.p 1000 mL 
 
1. Armazenar em Geladeira. 
 
 Solução de coloração de gel com Coomassie Blue. 
Coomassie Blue 2,5 g 
Metanol 450 mL 
Ácido Acético 100 mL 
Água destilada q.s.p 1000 mL 
 
1. Dissolver o Coomassie Blue em 450 mL de metanol. 
2. Adicionar, em seguida, 100 mL de ácido acético. 
3. Completar o volume para 1000 mL com água destilada. 
4. Filtrar em papel de filtro. 
5. Armazenar em Geladeira. 
 
 Solução de descoloração com Coomassie Blue. 
Metanol 300 mL 
Ácido Acético glacial 100 mL 
Água destilada q.s.p 1000 mL 
 
1. Armazenar em Geladeira. 
 
 
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 Vermelho de Ponceau. 
Vermelho de Ponceau 0,5g 
Ácido acético 1ml 
Água destilada 99ml 
 
1. Dissolver em 99 ml de água destilada. 
2. Adicionar 1 mL de acético. 
3. Filtrar a solução em papel de filtro. 
4. Armazenar em Geladeira. 
 
 Solução de ácido acético 10%. 
Ácido acético 50 mL 
Água destilada 500 mL 
 
1. Armazenar em Geladeira. 
 
 Solução de ácido acético 5%. 
Ácido acético 25 mL 
Água destilada 500 mL 
 
1. Armazenar em Geladeira. 
 
 
 Tampão de transferência – Para o preparo do sanduíche. 
Tris (PM 121,1) - 25 mM 3.0 g 
Glicina (PM 75,07) - 192 Mm 14,4 g 
*SDS (PM 288,4) - 0,1% (3,5 mM) 1,0 g 
Água destilada 750 mL 
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Metanol 200 mL 
Água destilada (completar Volume) qsp 1000mL 
 
* Opcional: Adicionando SDS pode melhorar a eficiência de transferência. 
1. Dissolver em 750 ml de água destilada. 
2. Adicionar metanol. Adicionar metanol apenas antes da transferência. 
3. Completar com água destilada para 1 litro. Não ajustar o pH, que deve ser entre 8,2 e 8,4. 
4. Armazenar em Geladeira. 
 
 Solução de PBS, pH 7,4. 
NaCl (137mM) 8 g 
KCl (2,7mM) 0,2 g 
Na2HPO4 (10 mM) 1,44 g 
KH2PO4 (2 mM) 0,24 g 
Água destilada 800 mL 
HCl aq (concentrado) Gotas para ajustar pH 7,4 
Água destilada (completar Volume) qsp 1000mL 
 
1. Dissolver: NaCl, KCl, Na2HPO4, e KH2PO4 em 800 mL de água destilada. 
2. Ajustar o pH para 7,4, adicionado gota a gota de HCl concentrado. 
3. Completar o volume para 1000 mL com água destilada. 
4. Armazenar em Geladeira. 
 
 Solução de PBS-Tween 20, pH 7,5. 
NaCl 8 g 
KCl 0,2 g 
Na2HPO4 1,44 g 
KH2PO4 0,24 g 
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Tween-20 2 mL 
HCl aq (concentrado) Gotas para ajustar pH 7,5 
Água destilada (completar Volume) qsp 1000mL 
 
5. Dissolver: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 e Tween-20 em 800 mL de água destilada. 
6. Ajustar o pH para 7,5, adicionado gota a gota de HCl concentrado. 
7. Completar o volume para 1000 mL com água destilada. 
8. Armazenar em Geladeira. 
 
 Solução de Bloqueio – Leite desnatado Molico 5%. 
Leite 25g 
PBS-T 500 mL 
 
1. Preparar a solução no momento do uso. 
2. Não armazenar. 
 
 
1. Armazenar em temperatura ambiente. 
 
 Solução Azul de bromofenol 1%. 
Bromophenol blue 1% 0,1 g 
Tris-base 50 mM 0,06 g 
Água destilada 10 mL 
 
2. Armazenar em geladeira. 
 
 
 
 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 
 
FARMACOPEIA BRASILEIRA, 5ª Ed. Volume I. Brasília: Anvisa, 2010a. 546p. 
 
HEERMANN KH, GULTEKIN H, GERLICH WH. Protein blotting: techniques and application in virus 
hepatitis research. Ric Clin Lab 1988;18(2–3):193–221. 
MYLONAKIS E, PALIOU M, LALLY M, FLANIGAN TP, RICH JD. Laboratory testing for infection with the 
human immunodeficiency virus: established and novel approaches. Am J Med 2000; 109(7):568–76. 
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: Princípios de Bioquímica. 3ª Ed. São Paulo, 2002. 
 
TOWBIN H, STAEHELIN T, GORDON J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to 
nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76(9):4350–4. 
VOET, D.; VOET, J. G.; PRATT, C. W. Fundamentos de Bioquímica: A vida em nível molecular. 2ª Ed. 
Porto Alegre: Artmed, 2008.