ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS - EAS, UGG, GLOBAL E DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS, ERITROGRAMA, ABO, Rh, COOMBS DIRETO E INDIRETO, COAGULOGRAMA

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Práticas Interdisciplinares: Patologia Clínica I 
Professor: Thales de Almeida Pinheiro 
 
AULA PRÁTICA: EXAME DE URINA ROTINA – EAS 
 
Homogeneizar a amostra e colocar 10 mL em um tubo cônico de centrifugação; 
Fazer a análise física (cor, aspecto, odor, presença de espuma e densidade); 
Fazer a leitura química com a fita reagente. 
Fazer a leitura microscópica seguindo a padronização abaixo: 
 Volume urinário: 10 mL 
 Tempo de centrifugação: 5 minutos 
 Velocidade de centrifugação: 1.500-1.800 rpm 
 Volume de sedimento: 1,0 mL 
 Volume de sedimento observado: 0,02 mL 
 Lamínula : 22  22 mm 
 Ocular: 10 - Objetivas : 10 e 40 
 Número de campos observados: 10 
 
AULA PRÁTICA: MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM 
 
A. Cobrir a área com a solução de cristal-violeta por cerca de um minuto. 
B. Decantar o cristal-violeta e lavar suavemente com a própria solução de iodo ou 
água da torneira. 
(Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das 
células Gram-positivas). 
C. Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de um minuto. 
D. Descorar a lâmina com o álcool, até que o solvente escorra incolor. 
E. Alternar com água corrente (jato fraco). O tempo usualmente utilizado nesta etapa 
é de cerca de 10 segundos. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a 
retirada do cristal violeta das células Gram-positivas, assim como, a pouca 
descoloração pode resultar em pouca retirada do cristal violeta, ocasionando uma 
tonalidade azulada nas bactérias Gram negativas). 
F. Cobrir o esfregaço com a solução de Fucsina básica a 0.2%, por cerca de 30 
segundos. 
G. Lavar com água corrente. 
H. Deixar secar ao ar. 
 
As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração 
violeta enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo solvente, sendo, portanto, 
coradas com o corante de fundo (fucsina) e se apresentam róseas. 
 
Leitura do Gram 
Utilizando a objetiva de menor aumento (10X), fazer uma análise do esfregaço 
como um todo, avaliando a qualidade da coloração e a espessura do esfregaço; se o 
material clínico coletado é apropriado para cultura, observando a quantidade relativa de 
leucócitos, hemácias, células epiteliais; a presença de bactérias pertencentes a microbiota 
normal, indicando uma coleta inadequada da amostra clínica; localização e agrupamento 
bacteriano; filamentos, pseudo-hifas e leveduras. Passar para a objetiva de imersão 
(100X) e examinar várias áreas para melhor avaliação da coloração e dos diferentes tipos 
de microrganismos presentes, principalmente perto de células inflamatórias. 
Como reportar o resultado 
Ausência de formas características de bactérias ou ausência de bactérias coráveis pelo 
Gram, caso não sejam observados microrganismos na amostra examinada. 
 
Quando forem observados microrganismos na amostra examinada relatar : Presença de... 
ou Flora bacteriana constituída por .... (quantificar e descrever os microrganismos 
observados). Quantificar os leucócitos e células epiteliais observadas na amostra 
examinada. 
Descrição da morfologia e agrupamento dos microrganismos observados: 
• Cocos gram-positivos aos pares. 
• Cocos gram-positivos em cadeias. 
• Cocos gram-positivos agrupados. 
• Bacilos gram-positivos. 
• Bacilos gram-positivos ramificados. 
• Bacilos gram-positivos corineiformes ou difteroides. 
• Bacilos gram-positivos tipo Doderlein. 
• Diplococos gram-negativos. 
• Bacilos gram-negativos. 
• Cocobacilos gram-negativos. 
• Cocobacilos gram-variaveis. 
• Leveduras e/ou leveduras em filamentação. 
 
 
AULA PRÁTICA: Contagem Global de Leucócitos em Camara de 
Newbauer 
 
PROCEDIMENTO 
 Coleta de material (sangue total) usando anticoagulante EDTA. A coleta de 
sangue deve seguir as Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia 
Clínica para coleta de sangue venoso. 
 Diluição da amostra de sangue com o reagente de Turck, preenchimento da 
Camara de Newbauer e contagem ao microscópio: 
 
A. Em um tubo ou frasco pequeno pipetar 0,4 mL de líquido diluidor. 
B. Pipetar 0,02 mL de sangue total colhido em EDTA e transferir para o tubo contendo 
líquido diluidor, lavando com este a pipeta. Homogeneizar. 
C. Homogeneizar e aguardar 20 minutos para que haja destruição das hemácias. 
D.Com o auxílio de uma pipeta de aproximadamente 20 microlitros, encher os 
retículos da câmara de Newbauer, tendo o cuidado de homogeneizar antes da 
pipetagem, evitando o excesso de líquido e formação de bolhas. 
E. Levar a câmara de Newbauer ao microscópio para efetuar a contagem com o 
aumento de 100X ou 400X (caso haja necessidade) usando para contagem os quatro 
retículos laterais da câmara. 
F. Cálculos: substituir na fórmula abaixo o valor da variável y pelo valor encontrado 
no item anterior. 
 X = 2,5 x 21 x Y 
2,5: conversão de 0,4 mm3 para 1 mm3; 
 Área de contagem do retículo lateral= 1 mm2 
Área usada para contagem = 4 x 1 mm2 = 4 mm2 (pois são usados quatro 
retículos) 
 Altura entre câmara e lamínula = 0,1 mm 
21: Fator da diluição 
 0,02/0,42 = 1/21 
 
Figura 01: Foto ilustrativa da Camara de Newbauer 
 
 
 
 
AULA PRÁTICA: CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS 
 
PROCEDIMENTO 
 
A. Focalizar as lâminas usando óleo de imersão no aumento de 40x e passar para a 
objetiva de 100x na sequência; 
B. Analisar o corpo da lâmina onde as células encontram-se justapostas. Não se deve 
analisar a hematoscopia na cabeça e cauda da lâmina (Figura 01). 
C. As células nem sempre se distribuem de maneira uniforme no esfregaço. Por isso, 
usamos normalmente o método ziguezague para a contagem diferencial de 
leucócitos (Figura 02). 
 
Figura 01: Diferenças entre cabeça, corpo e cauda de um esfregaço sanguíneo 
 
Figura 02: Representação do Método de Ziguezague. 
 
D. De acordo com o exposto acima, focalizar o corpo do esfregaço para iniciar a 
contagem. 
E. Fazer a contagem no aumento de 1000x (ocular 10x; objetiva 100x) fazendo a 
diferenciação entre os diferentes tipos de leucócitos; 
F. Anotar os diferentes tipos de leucócitos e os valores encontrados na contagem em 
%. 
G. Baseando-se na contagem global de leucócitos e nos valores percentuais 
encontrados, calcular os valores absolutos para cada tipo de leucócito. 
 
 
H. O resultado é expresso em número relativo e absoluto, conforme já citado 
anteriormente no exemplo. 
 
 
 
 
 
 
AULA PRÁTICA: CONFECÇÃO E COLORAÇÃO DE FILMES OU 
ESFREGAÇOS SANGUÍNEOS 
 
PROCEDIMENTO 
 
 Coleta de material (sangue total e plasma) usando anticoagulante EDTA; 
A coleta de sangue deve seguir as Recomendações da Sociedade Brasileira de 
Patologia Clínica para coleta de sangue venoso. 
 
 Confecção do filme (esfregaço) sanguíneo; 
A extensão sanguínea, também denominada de esfregaço sanguinolenta, deve 
ser confeccionada a partir sangue recém-coletado, sem anticoagulante, em lâminas 
perfeitamente limpas, isentas de gordura e polidas. 
 
Preparar a extensão conforme descrito abaixo: 
A. Colocar aproximadamente duas gotas de sangue em um dos lados da lâmina, a 
quantidade de sangue não deve ser muito grande para que a extensão não fique 
muito espessa; 
B. Com auxílio da lâmina extensora realizar a extensão sanguínea; 
C. Os fatores que influenciam na qualidade da extensão sanguínea são a quantidade 
de sangue, a velocidade empregada no movimento com a lâmina extensora, o 
ângulo entre a lâmina extensora e a lâmina de microscopia e a limpeza e qualidade 
das lâminas de microscopia e extensora. 
D. A extensão satisfatória deve ser fina e homogênea, de margens livres,pois só as 
que reúnem estas condições apresentam os leucócitos e eritrócitos sem 
deformações e convenientemente distribuídos. 
E. As extensões devem ter boa qualidade e serem feitas no dia da coloração e leitura. 
Extensões velhas coradas um ou mais dias após sua confecção não apresentam 
boa coloração. 
F. A extensão sanguínea deve ser feita rapidamente, antes que comece a coagulação. 
G. Deixar secar ao ar. 
 
 Coloração do filme sanguíneo 
 
A coloração do filme deve seguir o procedimento de cada kit, já que existem 
variações de acordo com a marca e fabricante. 
 
Técnica de coloração de acordo com a marca/fabricante Instant-prov/New-prov: 
 
A. Após a extensão sanguínea estar devidamente seca, submergí–la no Instant 
Prov I. Cronometrar o tempo de dez segundos. É fundamental que este tempo 
seja rigorosamente marcado e seguido a risca. Durante estes dez segundos não 
há necessidade de se executar qualquer movimento. Após o tempo de dez 
segundos, retirar a lâmina do Instant Prov I e deixar escorrer durante cinco 
segundos (também devidamente cronometrado). O corante pode escorrer para 
dentro da própria cuba que contém o corante. 
B. Após o escorrimento de cinco segundos, submergir a lâmina no Instant Prov 
II. Seguir exatamente o procedimento descrito para o Instant Prov I. 
C. Colocar a lâmina no Instant Prov III e deixar por 20 segundos (também 
devidamente cronometrado). Após o tempo de coloração, retirar a lâmina do 
corante e deixar escorrer durante cinco segundos. Este tempo também deve 
ser devidamente cronometrado. Após este tempo, lavar a lâmina em água 
corrente abundante. 
D. Recomenda – se, durante a lavagem, limpar a lâmina na parte de trás para que 
o corante impregnado não interfira na microscopia. 
E. Deixar secar bem e levar ao microscópio na objetiva de imersão e efetuar a 
leitura 
 
 Avaliação da hematoscopia do filme sanguíneo (Objetiva Imersão - 100X). 
 
 
 
 
AULA PRÁTICA: CONTAGEM GLOBAL DE ERITRÓCITOS EM 
CÂMARA DE NEWBAUER 
 
PROCEDIMENTO 
 
 Coleta de material (sangue total e plasma) usando anticoagulante EDTA; 
 
A coleta de sangue deve seguir as Recomendações da Sociedade Brasileira de 
Patologia Clínica para coleta de sangue venoso. 
 
 Diluição com reagente em tubo de hemólise, preenchimento da câmara de 
newbauer e contagem dos eritrócitos ao microscópio (Objetiva 40X) e cálculos: 
 
A. Em um tubo ou frasco pequeno pipetar 4 mL de líquido diluidor. 
B. Pipetar 0,02 mL de sangue total colhido em EDTA e transferir para o tubo 
contendo líquido diluidor, lavando com este a pipeta. Homogeneizar. 
C. Esperar cinco minutos. Homogeneizar. 
D. Com o auxílio de uma pipeta de aproximadamente 20 microlitros, encher os 
retículos da câmara de Newbauer, tendo o cuidado de homogeneizar antes da 
pipetagem, evitando o excesso de líquido e formação de bolhas. 
E. Levar a câmara de Newbauer ao microscópio para efetuar a contagem com o 
aumento de 400X usando o retículo central da câmara. 
F. Ler os quatro quadrículos laterais e o central do retículo central da câmara e 
somar as cinco parcelas. 
G. Cálculos: substituir na fórmula abaixo o valor da variável y pelo valor 
encontrado no item anterior. 
 X = 10 x 5 x 201 x Y 
 
10: conversão de 0,1 mm3 para 1 mm3; 
5: para se chegar no volume total do retículo central, já que levou em consideração 
apenas 1/5 do mesmo; 
201: Fator da diluição 
 
Figura 01: Foto ilustrativa da Camara de Newbauer 
 
AULA PRÁTICA: DOSAGEM DE HEMOGLOBINA 
 
 
PROCEDIMENTO 
 
 Coleta de material (sangue total) usando anticoagulante EDTA. A coleta de 
sangue deve seguir as Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia 
Clínica para coleta de sangue venoso. 
 
 Diluição com reagente de trabalho e leitura no espectrofotômetro: 
 
 
A. Identificar 03 (três) tubos de hemólise como: branco, padrão e teste (paciente); 
B. Pipetar em cada um dos três tubos de hemólise anteriormente identificados 2,5 
mL do reagente de trabalho (preparado de acordo com a bula do kit); 
C. No tubo de hemólise identificado como padrão, pipetar 10 uL (microlitros) do 
padrão do kit “Padrão de Hemoglobina”. Lavar a ponteira usada para pipetar 
o padrão no próprio líquido diluidor. Homogeneizar; 
D. No tubo de hemólise identificado como teste (paciente), pipetar 10 uL 
(microlitros) da amostra do paciente (sangue total colhido em EDTA). Lavar 
a ponteira usada para pipetar o sangue total no próprio líquido diluidor. 
Homogeneizar; 
E. Aguardar 5 minutos à temperatura ambiente, fazer a leitura a 540 nm (520 - 
550 nm) acertando o zero com o Reagente de Trabalho. A reação de cor é 
estável por 60 minutos. 
 
 Cálculos 
 
A. Deve se usar a concentração do padrão de hemoglobina e fazer a regra de três 
de acordo com leitura no espectrofotômetro. 
 
 
AULA PRÁTICA: DETERMINAÇÃO DO HEMATÓCRITO 
 
PROCEDIMENTO 
 
 Coleta de material (sangue total) usando anticoagulante EDTA. A coleta de 
sangue deve seguir as Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia 
Clínica para coleta de sangue venoso. 
 
 Preenchimento dos tubos capilares, centrifugação e leitura: 
 
A. Encher o tubo capilar com o sangue do paciente por capilaridade, até cerca de 2/3 
do seu comprimento; 
B. Limpar as paredes do tubo com Algodão; 
C. Vedar a extremidade vazia do tubo com a massa apropriada; 
D. Colocar o tubo capilar na centrífuga de microhematócrito com a parte vedada 
voltada para fora, equilibrando-o com outro tubo; 
E. Tampar convenientemente a centrífuga de microhematócrito, colocando-a para 
funcionar por 5 minutos; 
F. Após este tempo, retirar o tubo e fazer a leitura empregando tabela específica. 
G. O tubo capilar, após centrifugação, deve ser colocado sobre a tabela própria para 
leitura; 
H. O menisco inferior (hemácias) deve coincidir com a linha zero e o menisco 
superior (plasma) deve coincidir com a linha 100. A leitura é feita onde ocorre a 
separação entre o plasma e as hemácias sedimentadas, desprezando-se a fina 
camada de leucócitos e plaquetas que se forma nesta região; 
I. Expressão dos resultados em percentual (Ex: 40%) 
 
Figura 01: Régua de Leitura para Microhematócrito. Disponível em: 
 
Disponível em: 
<http://www.casalab.com.br/images/stories/virtuemart/product/3825.jpg.>. 
Acesso: 28 de julho de 2015. 
 
 
 
 
 
 
AULA PRÁTICA: GRUPO SANGUINEO E FATOR RH 
 
PROCEDIMENTO 
 
Metodologia: Reação de Aglutinação 
Amostra: Sangue colhido em EDTA 
 
1) Método Direto (Prova direta) 
1- Centrifugar as amostras 5 minutos a 3.000 rpm. 
2- Identificar 5 tubos para cada amostra a ser testada 
(Suspensão 5%, A, B, Rh e C-/Controle negativo) 
3- Preparar uma suspensão de hemácias a 5% do paciente a ser testado. 
4- Colocar uma gota de soro Anti-A, Anti-B e Anti-Rh nos respectivos tubos identificados. 
No tubo identificado como C-(controle negativo), colocar uma gota de albumina bovina. 
5- Colocar uma gota de suspensão de hemácias a 5% em cada um dos tubos. 
6- Homogeneizar suavemente e centrifugar 15 segundos a 3000 rpm ou 1 minuto a 1500 
rpm. 
7- Fazer a leitura dos tubos observando a presença de aglutinação, agitando levemente. 
8- No tubo C-(controle negativo) não deverá haver aglutinação, caso haja, repetir o teste. 
Se persistir a aglutinação, invalidar o resultado e fazer a solicitação da pesquisa de 
anticorpos irregulares. 
 
2) Método Indireto (Prova Indireta) 
1- Identificar 3 tubos (A, B e O). 
2- Pipetar duas gotas de plasma da amostra a ser testada obtida após a centrifugação em 
cada um dos tubos de EDTA. 
3- Pipetar duas gotas de cada uma das hemácias (solução a 5%) reconhecidamente dos 
grupos “A”, “B”e “O” nos seus respectivos tubos. 
4- Homogeneizar suavemente e centrifugar 15 segundos a 3000 RPM ou 1 minuto a 1500 
rpm. 
5- Fazer a leitura dos tubos observando a presença de aglutinação, agitando levemente. 
 
Observação: A prova Indireta não é realizada em Recém-Nascidos devido não ter 
anticorpos o suficiente para serem detectados. Quando há aglutinação fraca do grupo 
“A” é aconselhável que se faça o teste usando o anti-A1. 
 
Interpretação dos Resultados: 
 
- Se aglutinar somente o Anti-A na prova direta e na prova reversa apenas B, o grupo 
sanguíneo do paciente será “A”. 
- Se aglutinar somente o Anti-B na prova direta e na prova reversa apenas A, o grupo 
sanguíneo do paciente será “B”. 
- Se aglutinar Anti-A e Anti-B na prova direta e não aglutinar nas provas reversa A e B, 
o grupo sanguíneo do paciente será “AB”. 
- Se não aglutinar o Anti-A nem o Anti-B na prova direta e nas provas reversas 
aglutinar A e B, o grupo sanguíneo do paciente será “O”. 
- Se aglutinar no tubo Rh, será Rh positivo 
- Se não aglutinar no tubo Rh, deve-se fazer a pesquisa de D fraco 
Pesquisa de D Fraco: 
- Se não houver aglutinação de D fraco: Rh Negativo 
 
- Se houver aglutinação de D fraco: Rh Positivo, com presquisa de D fraco positiva. 
 
3) Pesquisa de D fraco 
1- Incubar o tubo Rh e o C- (controle negativo) a 37º por 20 minutos. 
2- Ler agitando os tubos levemente. 
3- Se houver aglutinação o Rh é positivo, se não continuar o teste. 
4- Lavar 3 vezes durante 4 minutos com solução salina 0,9%. 
5- Adicionar uma gota de soro de Coombs. 
6- Homogeneizar suavemente e centrifugar 15 segundos a 3000 rpm ou 1 minuto a 1500 
rpm. 
7- Fazer a leitura dos tubos observando a presença de aglutinação, agitando levemente. 
 
4) Preparação da suspensão de Hemácias à 5% 
1- Em um tubo de centrífuga colocar 1 mL de sangue homogeneizado colhido com 
anticoagulante mais 9 mL de soro fisiológico (NaCl a 0,85%) 
2- Centrifugar a ± 2500 rpm por 2 minutos 
3- Desprezar todo o sobrenadante 
4- Repetir este procedimento mais duas vezes, ou seja, lavar mais duas vezes, 
desprezando-se sempre o sobrenadante. A partir deste sedimento, preparar a suspensão 
de hemácias a 5%, completando com soro fisiológico o volume desejado (Usar uma 
gota do sedimento para 19 gotas de soro fisiológico). 
 
5) Preparação da “PAPA” de hemácias 
1- Separar 6 amostras de hemácias do Grupo A, Grupo B e Grupo O. 
2- Lavar 3 vezes as hemácias com solução salina 0,9% 
2.1- Com o pipetador automático, acrescentar solução salina 0,9% até 2/3 do tubo. 
2.2- Centrifugar durante 4 minutos a 3000 rpm. 
2.3- Desprezar o sobrenadante com pipeta de pausteur. 
2.4- Ressuspender as hemácias com salina a 0,9% até 2/3 do tubo. 
2.5- Centrifugar por 4 minutos a 3000 rpm. 
2.6- Fazer o procedimento por três vezes. 
2.7- Na terceira lavagem retirar o sobrenadante deixando mais ou menos 300 uL de 
salina para evitar a hemólise. 
 
 
 
 
AULA PRÁTICA: COOMBS DIRETO 
 
PROCEDIMENTO 
 
1- Colher amostra de sangue total em tubo contendo anticoagulante EDTA. 
Preparação da suspensão de Hemácias à 5% 
2.1- Em um tubo de centrífuga colocar 1 mL de sangue homogeneizado colhido com 
anticoagulante mais 9 mL de soro fisiológico (NaCl a 0,85%); 
2.2 - Centrifugar a ± 2500 rpm por 2 minutos 
2.3 - Desprezar todo o sobrenadante 
2.4 - Repetir este procedimento mais duas vezes. 
2.5 - A partir deste sedimento, preparar a suspensão de hemácias a 5%, completando com 
soro fisiológico o volume desejado (Usar uma gota do sedimento para 19 gotas de soro 
fisiológico). 
 
2- Identificar 3 tubos: 1 teste, 1 controle positivo (C+) e um controle negativo (C-) e 
proceder da seguinte forma: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3- Incubar o tubo número 2 em banho-maria à 37°C por 30 minutos, homogeneizando a 
cada 10 minutos. Lavar o mesmo 3 vezes com soro fisiológico e proceder da seguinte 
forma: 
 
 
 
 
 
4- Homogeneizar suavemente e centrifugar por 15 segundo a 3000 RPM ou 
1 minuto a 1500 RPM. 
5- Fazer a leitura agitando suavemente. 
6- Se não houver aglutinação incubar 5 minutos no banho-maria a 37°C. 
7- Retirar do banho-maria e fazer a leitura agitando levemente o tubo. 
8- Centrifugar 15 segundos a 3000 RPM ou 1 minuto a 1500 RPM. 
9- Fazer a Leitura agitando levemente. 
10- Anotar os resultados 
Presença de Aglutinação: resultado Positivo 
Ausência de Aglutinação: resultado Negativo 
O tubo controle positivo (C+) deverá sempre apresentar aglutinação. 
O tubo controle negativo (C-) não deverá apresentar aglutinação. 
 
 
 
AULA PRÁTICA: COOMBS INDIRETO 
 
PROCEDIMENTO 
 
Metodologia 
Reação de Aglutinação Direta 
 
Princípio da Reação 
O teste de Coombs indireto pesquisa a presença de anticorpos no soro de indivíduos 
sensibilizados. Numa primeira fase, os anticorpos incompletos são fixados às hemácias, 
contendo antígeno correspondente. Quando tratados na segunda fase pela antiglobulina 
humana, sofrem aglutinação. 
 
Técnica 
 Separar 12 tubos e numerá-los de 1 a 12. O primeiro tubo será empregado para o 
teste de Coombs Indireto qualitativo e os demais, para o teste quantitativo, controles 
positivo e negativo. 
 TUBO NÚMERO 1: Teste qualitativo 
Reagentes Tubo 1 
(Teste 1) 
Tubo 2 
(CP) 
Tubo 3 
(CN) 
Susp. Hemácias a 5% do 
Paciente Teste 
1 gota - - 
Susp. Hemácias a 5% do 
“Rh Positivo” 
- 1 gota 1 gota 
Soro Anti-D 1 gota 
Albumina Bovina à 22% 1 gota 1 gota 
Reagentes Tubo 1 
(Teste 1) 
Tubo 2 
(CP) 
Tubo 3 
(CN) 
Soro de Coombs 2 gotas 2 gotas 2 gotas 
 TUBO NÚMERO 2 a 10: Teste quantitativo 
 TUBO NÚMERO 11: Controle Negativo 
 TUBO NÚMERO 12: Controle Positivo 
 
 Colocar no tubo 1, 0,2 mL de soro do paciente. 
 Colocar nos tubos numerados de 2 a 10, 0,2 mL de soro fisiológico. 
 Colocar 0,2 mL do soro do paciente no tubo número 2, homogeneizar e transferir 
0,2 mL para o tubo seguinte até o tubo número 10, quando se retira do mesmo 0,2 mL e 
despreza-se. Não levar as diluições até os tubos 11 e 12 que representam os controles 
negativo e positivo, respectivamente. São feitas diluições de 1/2 até 1/512. 
 Colocar 0,2 mL de soro fisiológico no tubo número 11, que representa o controle 
negativo. 
 Colocar 2 gotas de soro anti-D ao tubo número 12, que representa o controle 
positivo. 
 Acrescentar 0,2 mL de suspensão de hemácias a 5% preparada a partir de sangue 
do grupo sanguíneo “O”, fator Rh positivo, a todos os tubos. Homogeneizar. 
Levar os tubos ao banho Maria a 37 graus Celsius durante 45 a 60 minutos, quando haverá 
oportunidade das hemácias “in vitro” se sensibilizarem, caso o soro do paciente apresente 
anti-D ou um outro anticorpo incompleto. E então teremos as hemácias sensibilizadas. 
• Completado o tempo, lavar todos os tubos 3 a 4 vezes com solução salina. Usar 
2500 rpm por aproximadamente 2 minutos. 
• Colocar sobre o último sedimento, após as lavagens, 2 gotas de soro de coombs 
(anti-globulina humana). 
• Ressuspender o sedimento suavemente e fazer a leitura tubo por tubo, observando 
se houve ou não aglutinação. 
 
 
 
AULA PRÁTICA: COAGULOGRAMA 
 
PROCEDIMENTO 
 
1- Contagem de Plaquetas 
 Método Direto – Contagem em Câmara de Newbauer 
 
A. Em um tubo ou frasco pequeno pipetar 2 mL de líquido diluidor ( normalmente 
utiliza-se diluidor de Brecher – a base de oxalato de amônio). 
B. Pipetar 0,02 mL de sangue total colhido em EDTA e transferir para o tubo 
contendo líquido diluidor, lavando com este a pipeta. Homogeneizar. 
C. Esperar vinte minutos. Homogeneizar. 
D. Com o auxílio de uma pipeta de aproximadamente 20 microlitros, encher os 
retículos dacâmara de Newbauer, tendo o cuidado de homogeneizar antes da 
pipetagem, evitando o excesso de líquido e formação de bolhas. 
E. Colocar a câmara numa placa de Petri contendo algodão úmido, deixando 10 a 15 
minutos, para que ocorra a sedimentação das plaquetas; 
F. Focalizar a câmara em microscópio de contraste de fase, com os respectivos 
cuidados da técnica desta microscopia e contar as plaquetas de todos os 25 
quadrados do retículo destinados a contagem de hemácias. As plaquetas se 
apresentam com refringência, contrastando-se com o campo escuro da 
microscopia de fase. 
G. Cálculos: substituir na fórmula abaixo a variável y pelo valor de plaquetas 
encontrado no item anterior. 
 X = 10 x 101 x Y 
 10: conversão de 0,1 mm3 para 1 mm3; 
101: Fator de diluição; 
Y : número de plaquetas contadas no 25 quadros do retículo central da câmara de 
Newbauer; 
X: número de plaquetas por mm3. 
 
Figura 01: Foto ilustrativa da Camara de Newbauer 
 
 Método Indireto – Contagem ou Método de Fônio 
 
A. Colher o sangue com os cuidados recomendados; 
B. Fazer a extensão e a coloração do modo habitual; contar as plaquetas existentes 
em, no mínimo, 10 campos (que contenham aproximadamente 200 eritrócitos / 
campo); 
C. Contar o número de eritrócitos/mm3 de sangue(contagem global); 
D. Em seguida, fazer o cálculo relacionando o número de plaquetas contado, com o 
número de eritrócitos. 
 
Por exemplo: em 10 campos de aproximadamente 200 eritrócitos (portando em 
2.000 eritrócitos) contaram-se 75 plaquetas. 
O número de eritrócitos do paciente era de 5.000.000/mm3, assim o número de 
plaquetas/mm3 será: 
 
75 plaquetas .......................... 2000 eritrócitos 
x ....................................... 5.000.000/mm3 (eritrócitos) 
 
x = 375.000 plaquetas/mm3 
 
 
2. Tempo de Sangria 
 
PROCEDIMENTO 
A. Limpar a ponta de um dedo ou o lobo da orelha com álcool 70% e deixar seca; 
B. Fazer a incisão em um dos locais com lanceta apropriada estéril. Disparar o 
cronômetro tão logo seja feito o ferimento; 
C. Limpar o sangue cada 15 segundos com papel de filtro sem colocá-lo em contato 
com a ferida. Quando o sangramento cessar parar o cronômetro; 
D. Anotar o tempo; 
E. Se o tempo de sangramento for maior que 6 minutos, interromper o teste e aplicar 
pressão à ferida até que esta pare de sangrar; 
F. Interpretação: 
 O tempo de sangria normal vai de 1 a 3 minutos. Resultados alterados sugerem 
alterações quantitativas ou qualitativas das plaquetas. 
 
 
3. Tempo de Protrombina 
 
PROCEDIMENTO 
A. Colocar em banho maria a 37°C, 3 tubos de hemólise; 
B. Numerar de 1 a 3 tubos. Os tubos 1 e 2 serão usados para o teste, enquanto o tubo 
número 3 será usado para controle normal; 
C. Colocar nos tubos 1 e 2, 0,2 mL do plasma citratado do paciente e no tubo 3, 0,2 
mL do plasma normal; 
D. Acrescentar ao tubo 3 (tubo normal) de 0,2 mL da solução de uso de trombina, 
com pipeta automática. Acionar imediatamente o cronômetro aguardando 5 
segundos; 
E. Após este tempo, retirar o tubo do banho maria e agitá-lo suavemente até o 
aparecimento do coágulo de fibrina. Neste momento, parar o cronômetro, 
registrando o valor obtido; 
F. Repetir os itens D e E para os tubos de números 1 e 2. Anotar os resultados que 
contém o plasma do paciente. Tirar a média dos resultados obtidos. 
G. Resultado: 
 Tirar a média dos tubos 1 e 2. 
 Ex.:1° tubo: 10 segundos 
 2° tubo: 12 segundos 
 PT: 11 segundos 
H. Valor de Referência 
 10 a 15 segundos. 
 
I. Interpretação Clínica 
 Este exame avalia a via extrínseca e comum da coagulação sanguínea. 
 
 
4. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada 
 
PROCEDIMENTO 
A. Colocar em banho maria a 37°C, 3 tubos de hemólise; 
B. Numerar de 1 a 3 tubos. Os tubos 1 e 2 serão usados para o teste, enquanto o tubo 
número 3 será usado para controle normal; 
C. Colocar nos tubos 1 e 2, 0,1 mL do plasma do paciente e no tubo 3, 0,1 mL do 
plasma normal; 
D. Acrescentar ao tubo 3 (tubo normal) de 0,1 mL de cefalina, com pipeta 
automática. Homogeneizar e manter exatamente 3 minutos a 37°C. Em seguida, 
acrescentar 0,1 mL da solução de cloreto de cálcio à 0,025M. Imediatamente, 
acionar o cronômetro; 
E. Homogeneizar o tubo dentro do banho maria. Aguardar 30 segundos; 
F. Retirar o tubo do banho-maria e observá-lo por inclinações sucessivas, registrando 
o tempo de formação do coágulo de fibrina do plasma normal; 
G. Repetir os itens D, E e F para os tubos de números 1 e 2 que contém o plasma do 
paciente. Tirar a média dos resultados obtidos. 
H. Resultado: 
 Tirar a média dos tubos 1 e 2. 
 Ex.: 1° tubo: 38 segundos 
 2° tubo: 40 segundos 
 PTTa: 39 segundos 
I. Valor de Referência 
 30 a 45 segundos. 
Obs.: alteração de 8 segundos em relação ao plasma normal é considerado alterado. 
J. Interpretação Clínica 
 Este exame avalia a via intrínseca e comum da coagulação sanguínea.