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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA _______________________________________________________________ ALIMENTOS E ALIMENTAÇÃO EM VETERINÁRIA Professora: Almira Biazon França Disciplina: Alimentos e Alimentação em Veterinária Código da disciplina: VET 013 Curso: Medicina Veterinária Juiz de Fora-MG 2016 2 SUMÁRIO CAPÍTULO 1 - CONCEITOS SOBRE NUTRIÇÃO E ALIMENTAÇÃO ANIMAL.................................................................................................................................. 4 1. Introdução......................................................................................................................... 4 2. Principais conceitos sobre nutrição e alimentação animal........................................ 4 2.1) Dieta, concentrado e ração.............................................................................................. 4 2.2) Exigência nutricional........................................................................................................ 5 2.3) Fibra................................................................................................................................. 5 2.4) Aminoácidos essenciais, não essenciais e limitantes.................................................... 8 2.5) Proteína ideal................................................................................................................... 8 2.6) Proteína degradada no rúmen e proteína não degradada no rúmen............................ 9 2.7) Suplementos.................................................................................................................... 10 a) Aditivos................................................................................................................................ 10 a.1) Minerais orgânicos – aditivo nutricional........................................................................... 11 a.2) Prebióticos – aditivo zootécnico....................................................................................... 11 a.3) Probióticos – aditivo zootécnico....................................................................................... 11 a.4) Simbióticos – aditivo zootécnico...................................................................................... 12 a.5) Antimicrobianos – Aditivo zootécnico melhorador do crescimento e anticoccidianos.... 12 a.6) Óleos essenciais - Aditivo zootécnico melhorador do crescimento................................ 13 a.7) Enzimas – Aditivo zootécnico digestivo........................................................................... 14 CAPÍTULO 2 – CONTITUINTES DOS ALIMENTOS PARA NUTRIÇÃO ANIMAL............. 16 1. Introdução......................................................................................................................... 16 2. Nutrientes.......................................................................................................................... 16 2.1 Água.................................................................................................................................. 16 2.2 Carboidratos...................................................................................................................... 17 2.3 Proteínas........................................................................................................................... 19 2.4 Lipídeos............................................................................................................................. 20 a) Lipídeos simples................................................................................................................. 21 b) Lipídeos complexos............................................................................................................ 21 2.5 Minerais............................................................................................................................. 22 a) Macrominerais..................................................................................................................... 22 i) Cálcio (Ca)........................................................................................................................... 22 ii) Fósforo (P)........................................................................................................................... 23 iii) Potássio (K) ....................................................................................................................... 23 iv) Magnésio (Mg).................................................................................................................... 24 v) Sódio (Na)........................................................................................................................... 24 vi) Cloro (Cl)............................................................................................................................ 24 vii) Enxofre (S)......................................................................................................................... 24 b) Microminerais...................................................................................................................... 25 i) Ferro (Fe)............................................................................................................................. 25 ii) Cobre (Cu)........................................................................................................................... 25 2.6 Vitaminas........................................................................................................................... 25 a) Vitaminas lipossolúveis....................................................................................................... 26 i) Vitamina A............................................................................................................................ 26 ii) Vitamina D........................................................................................................................... 26 iii) Vitamina E.......................................................................................................................... 26 iv) Vitamina K.......................................................................................................................... 27 b) Vitaminas Hidrossolúveis.................................................................................................... 27 i) Tiamina................................................................................................................................ 27 ii) Niacina................................................................................................................................. 27 iii) Vitamina B6 (piridoxina, piridoxal e piridoxamina).............................................................. 27 iv) Ácido fólico......................................................................................................................... 27 CAPÍTULO 3 – TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE ALIMENTOS PARA NUTRIÇÃO ANIMAL................................................................................................................................... 28 3 1. Introdução.......................................................................................................................... 28 2. Obtenção de amostras...................................................................................................... 28 2.1 Amostragem de pasto....................................................................................................... 28 2.2 Amostragem de silagens e fenos......................................................................................29 2.3 Amostragem de grãos e farelos em sacarias................................................................... 29 2.4 Amostragem de grãos e farelos a granel.......................................................................... 29 3. Processamento físico da amostra................................................................................... 30 3.1 Redução do teor de umidade em estufa com circulação forçada de ar......................... 30 3.2 Redução do tamanho de partículas.................................................................................. 31 4. Métodos de análises de alimentos.................................................................................. 31 4.1 Avaliação do teor de umidade.......................................................................................... 33 4.2 Avaliação das cinzas ou matéria mineral.......................................................................... 33 4.3 Avaliação do nitrogênio total (proteína bruta) pelo método de Kjeldahl......................... 34 4.4 Avaliação da gordura bruta ou do extrato etéreo.............................................................. 34 4.5 Avaliação da fibra insolúvel em detergente neutro (FDN) e da fibra insolúvel em detergente ácido (FDA)........................................................................................................... 35 4.6 Avaliação da lignina e celulose......................................................................................... 36 4.7 Avaliação da energia bruta................................................................................................ 37 4.8 Método de refletância no infravermelho proximal (NIRS)................................................. 37 5. Avaliações biológicas....................................................................................................... 38 4 CAPÍTULO 1 CONCEITOS SOBRE NUTRIÇÃO E ALIMENTAÇÃO ANIMAL 1. Introdução Entende-se por nutrição a associação dos processos físicos, químicos e biológicos pelo qual o animal assimila o alimento. Para que os animais possam ser supridos de suas necessidades nutricionais diárias, aos mesmos devem ser fornecidos alimentos que possuam todos aqueles nutrientes dos quais necessitam. Por sua vez, o alimento constitui em toda matéria possível de ser ingerida pelo animal, podendo ou não conter nutrientes digestíveis, assim, alimentar é diferente de nutrir. Desta forma, só se está nutrindo um animal quando se estiver fornecendo, pela dieta, todas as quantidades de nutrientes dos quais ele necessita para a sua manutenção e produção, e se está alimentando quando se fornece um alimento ou conjunto de alimentos aos animais. 2. Principais conceitos sobre nutrição e alimentação animal 2.1) Dieta, concentrado e ração A dieta consiste na porção ou mistura de alimentos, incluindo a água, a serem ingeridos pelos animais. Considerando um animal herbívoro, como por exemplo, uma vaca leiteira, a dieta é composta por forragens, concentrado e água, os quais, exceto á água, devem ser misturados em uma proporção ótima para se obter uma mistura de conteúdo nutricional. Esta é a filosofia no uso da Dieta Completa (TMR) como sistema alimentar. O termo concentrado refere-se a mistura de ingredientes adicionados a um ou mais alimentos em proporções adequadas, devidamente conhecidos e especificados, destinado a alimentação dos animais, e o termo ração se refere a quantidade total de alimentos fornecidos a um animal no espaço de 24 h. Assim, para animais onívoros, como por exemplo, os suínos e aves criados em sistemas convencionais, ração 5 e concentrado significam a mesma coisa, pois estes animais não consomem forragem. 2.2) Exigência nutricional A exigência nutricional é um conceito teórico prático que descreve o nível ideal de um nutriente e/ou energia que permita atender uma função fisiológica (mantença, crescimento, reprodução, produção). Estas exigências mínimas, embora fisiologicamente relevantes, são difíceis de definir e impossíveis de medir com precisão. As exigências nutricionais têm sido atualmente estimadas por meio de dois métodos: dose resposta (empírico) ou fatorial (mecanicista). No método dose resposta, as necessidades nutricionais são estimadas com base na resposta média da população obtidas de animais alimentados com diferentes níveis de um determinado nutriente na dieta. No método fatorial, as exigências nutricionais são estimadas pela soma das exigências de mantença, ganho, gestação, lactação e/ou produção em diferentes condições. Os modelos de crescimento estimam as exigências de um indivíduo representativo da população pela integração do método fatorial. Devido à complexidade das respostas dos animais e os muitos fatores que modulam estas respostas, os modelos matemáticos têm sido propostos para simular o crescimento e estimar exigências nutricionais dos animais sob diferentes condições de produção (Van Milgen et al., 2008) No Brasil, os estudos de exigências de aves e suínos embasam as recomendações da “Tabelas Brasileiras para aves e suínos” (Rostango et al., 2011), e estudos na área de exigência de bovinos de corte a publicação do BR CORTE (Valadares Filho et al., 2010), o qual apresenta os requerimentos nutricionais para bovinos de corte (Nelore e cruzados) criados em condições brasileiras. 2.3) Fibra A definição de fibra, do ponto de vista da morfologia vegetal, corresponde aos componentes estruturais das plantas, sendo os constituintes da parede celular destas, a qual é composta de pectina, celulose, 6 hemicelulose, complexos fenólicos (lignina) e proteína. Do ponto de vista nutricional, a fibra designa a fração do alimento composta por unidades formadoras unidas por ligações do tipo beta, não digerida por enzimas secretadas pelo trato digestivo dos animais, mas passível de degradação microbiana no estômago de animais ruminantes e no intestino grosso dos animais ruminantes e não ruminantes. No entanto, o conceito de fibra encontrado na literatura diverge entre as linhas de pesquisas da nutrição de ruminantes e não ruminantes. Na nutrição de não ruminantes quimicamente a fibra representa um agregado de compostos, e entre eles se destacam os polissacarídeos não amiláceos (PNA), como a celulose, hemicelulose, pectina e frutctana, e os compostos fenólicos, dos quais se destaca a lignina. No entanto na nutrição de ruminantes a fibra é definida como a fração indigestível ou de lenta digestão do alimento que ocupa espaço no trato gastrointestinal, e que promove o perfeito funcionamento do rúmen. Desta forma, a parede celular vegetal e/ou os PNA não podem ser considerados como medida acurada da fibra, pois também contém pectina, que possui digestibilidade alta e constante no rúmen. Desta forma, em termos nutricionais, a classificação dos carboidratos em fibrosos e não fibrosos parece mais apropriada porque é baseada em características nutritivas, ao invés de composição química ou função exercida na planta. Nessa classificação, os carboidratos não fibrosos (CNF) representão as frações degradadas mais rapidamente e incluem a pectina, amido e açúcares. Os carboidratos fibrosos (CF), que ocupam espaço no trato gastrintestinal e exigem mastigação para redução do tamanho de partícula e passagem através desse trato, incluem a celulose, hemecelulose. No caso dos CF a fibra em detergente neutro (FDN) tem o mesmo significado nutricional, pois representam a mesma fração de carboidratos dos alimentos. Os termos fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA) referem-se aos métodos de análise originalmente desenvolvidos por P.J. Van Soest na década de 1960. Esse método se baseia na separação por meio de detergente neutro o conteúdocelular (formado principalmente de proteínas, gorduras, carboidratos solúveis, pectina e outros constituintes solúveis em 7 água) da parede celular, chamada de FDN que é constituída de celulose, hemicelulose e lignina. Já o uso do detergente ácido solubiliza o conteúdo celular, a hemicelulose e os minerais solúveis, além da maior parte da proteína insolúvel, obtendo assim um resíduo insolúvel em detergente ácido, denominado de fibra em detergente ácido (FDA), constituído de celulose e lignina. Sniffen et al. (1992) classificaram os carboidratos com base no modo diferenciado em que os microrganismos, presentes no rúmen-retículo, fazem uso desses, ou seja de acordo com sua taxa de degradação (h-1) ruminal. Dessa forma os carboidratos foram classificados em quatro frações: Fração A – formada pelos carboidratos que apresentam taxas de degradação rápida, são considerados nesse grupo os açúcares simples, glicose, sacarose e ácidos orgânicos; Fração B1 - carboidratos de degradação intermediária como o amido e pectina; Fração B2 - conhecida como fibra disponível, são os carboidratos de taxa de degradação lenta como a celulose e a hemicelulose e Fração C – denominada como fibra indigestível ou não disponível. A fibra fisicamente efetiva (peFDN) de um alimento corresponde às propriedades físicas da FDN (principalmente tamanho de partículas) que estimulam mastigação e estabelecem uma estratificação bifásica do conteúdo ruminal, contribuindo para formação de uma camada flutuante de partículas grandes, denominadas de “mat” sobre um pool de líquido, e partículas pequenas (Mertens, 1997). O valor de peFDN dos alimentos está relacionado à concentração de FDN e na variação do tamanho de partícula, sendo esses fatores críticos para estimulação da ruminação e motilidade do rúmen (Mertens, 1998). Considerando que a secreção de tampões da saliva é fator importante para manutenção do pH ruminal em nível ótimo, a peFDN está diretamente relacionada à saúde do animal e depressão da gordura do leite, porque afeta a atividade de mastigação, a produção de saliva e pH ruminal (Mertens, 1998). A fração da FDN efetiva (eFDN) esta relacionada com a capacidade total de FDN de um alimento em manter efetivamente o teor de gordura no leite(Mertens, 1997). Portanto peFDN e eFDN diferem em conceito e valores estabelecidos para cada alimento. 8 2.4) Aminoácidos essenciais, não essenciais e limitantes Os aminoácidos essenciais não são sintetizados ou são em quantidades muito inferiores às necessidades dos animais, enquanto que os aminoácidos não essenciais são sintetizados a partir do esqueleto de carbono da glicose ou de outros aminoácidos e dos grupos amino de aminoácidos em excesso. Dentre os aminoácidos não essências podemos citar o ácido glutâmico, glutamina, cistina, glicina, serina, alanina, aspartato e asparagina. Os mamíferos exigem cerca de nove aminoácidos essenciais, sendo eles a metionina, lisina, treonina, triptofano, valina, fenilalanina, leucina, isoleucina e histidina. Contudo, a essencialidade de um aminoácido pode ser transitória, e a ausência de alguns aminoácidos na dieta pode ser mais letal do que a de outros. A limitação de um aminoácido por deficiência se dá quando um ou mais aminoácidos não são fornecidos na dieta e limitam a síntese proteica. O aminoácido causador da interrupção da síntese proteica é considerado o limitante. Uma vez suplementado, pode surgir um segundo ou terceiro aminoácido limitante. Desta forma, na nutrição de suínos o primeiro aminoácido limitante é a lisina, enquanto que para aves a metionina. Para bovinos a maioria dos trabalhos tem mostrado que dois aminoácidos essenciais são limitantes para a produção de leite e de carne, a lisina e a metionina, já os aminoácidos essências limitantes para a síntese de proteína microbiana são os de cadeia ramificada, leucina, valina e isoleucina. 2.5) Proteína ideal O conceito de proteína ideal é utilizado na nutrição de aves e suínos e refere-se ao balanço de aminoácidos da dieta, capaz de prover, sem deficiência nem excesso, as exigências de todos os aminoácidos necessários à perfeita manutenção, e máxima deposição proteica. O conceito prevê a relação entre os aminoácidos essenciais e a lisina, considerada padrão (100) em virtude de ser utilizada basicamente para a síntese proteica, sendo o componente principal do tecido magro (tecido muscular). 9 A ideia básica é que, embora as exigências de aminoácidos essenciais possam variar entre as diversas situações práticas, as relações entre estes aminoácidos permanecem razoavelmente estáveis. Desta forma, ao se estimar a exigência para um único aminoácido referência (lisina) em determinada condição de campo, basta ajustar as exigências dos aminoácidos restantes pela relação entre estes e a lisina. A lisina foi escolhida como aminoácido referência principalmente em função de ser um aminoácido utilizado quase que exclusivamente para a síntese proteica, não sofrendo transaminação para síntese de aminoácidos não essenciais, havendo, assim, alta correlação entre a digestibilidade ileal verdadeira e a disponibilidade biológica deste aminoácido. 2.6) Proteína degradada no rúmen e proteína não degradada no rúmen A proteína bruta (PB) contida nos alimentos dos ruminantes é composta por uma fração degradada no rúmen (PDR) e uma fração não degradada no rúmen (PNDR). A degradação da proteína no rúmen ocorre por meio da ação de enzimas (proteases, peptidases e deaminases) secretadas pelos microrganismos ruminais. Peptostreptococcus ssp., Clostridium aminophilum e Clostridium sticklandii, esses microrganismos degradam a fração PDR da proteína bruta da ração e utilizam peptídeos, aminoácidos e amônia para síntese de proteína microbiana (Pmic) e multiplicação celular. A proteína microbiana é a principal fonte de proteína metabolizável para os ruminantes, segundo Clarck (2009) a Pmic corresponde a 59% da proteína utilizada pelos ruminantes. Na nutrição de animais ruminantes a proteína dos alimentos também foi classificada por Sniffen et al. (1992) conforme a sua taxa de degradação (h-1) ruminal em cinco frações, sendo elas: Fração A – proteína de rápida fermentação (nitrogênio não proteico – NNP e peptídeos); Fração B - representa a proteína potencialmente degradável, sendo dividida em três subfrações; Fração B1 - proteína solúvel no rúmen, Fração B2 - proteína insolúvel de degradação intermediária e Fração B3 – proteína insolúvel de degradação lenta; e Fração C - insolúvel em detergente ácido. 10 2.7) Suplementos Suplemento, conforme descrito na Instrução Normativa nº 15 de 2009 do MAPA, é a mistura composta por ingredientes (macro e micro minerais, ureia e ingrediente energético) ou aditivos, podendo conter veículo ou excipiente, que deve ser fornecida diretamente aos animais ou ser indicada para diluição para melhor balanço nutricional. Dentre os suplementos serão abordados alguns aditivos de maior destaque na nutrição e alimentação animal a) Aditivos Conforme a Instrução Normativa nº 13 de 2004 do MAPA, aditivo é a substância, microrganismo ou produto formulado, adicionado intencionalmente aos produtos, que não é utilizada normalmente como ingrediente, tenha ou não valor nutritivo e que melhore as características dos produtos destinados à alimentação animal ou dos produtos animais, melhore o desempenho dos animais sadios e atenda às necessidades nutricionais ou tenha efeito anticoccidiano. Segundo estabelece a IN nº 13 de 2004 os aditivos foram classificados em cinco categorias: 1) Aditivos Tecnológicos: qualquer substância adicionada ao produto destinado à alimentação animal com fins tecnológicos, exemplos aditivos adsorventes, aglomerantes, antioxidantes, conservantes,estabilizantes, emulsificantes, espessantes, reguladores da acidez entre outros; 2) Aditivos Sensoriais: qualquer substância adicionada ao produto para melhorar ou modificar as características visuais dos produtos, exemplos os aditivos corantes e pigmentos, aromatizantes e palatabillizantes; 3) Aditivos Nutricionais: toda substância utilizada para manter ou melhorar as propriedades nutricionais do produto, exemplos vitaminas, oligoelementos ou seus compostos (microminerais orgânicos), aminoácidos, seus derivados e análagos, ureia e seus derivados; 4) Aditivos Zootécnicos: toda substância utilizada para influir positivamente na melhoria do desempenho dos animais, exemplos aditivos digestivos (enzimas), equilibradores da flora intestinal (probióticos, prebióticos 11 e acidificantes) e melhoradores de desempenho (antimicrobianos como a avilamicina, flavomicina e monensina); 5) Anticoccidianos: substância destinada a eliminar ou inibir protozoários, exemplo os anticoccidianos químicos e os ionóforos. a.1) Minerais orgânicos – aditivo nutricional Minerais orgânicos, ou quelatos, são compostos formados por íons metálicos sequestrados por substâncias orgânicas como aminoácidos, peptídeos ou complexos polissacarídeos que proporcionam a esses íons alta disponibilidade biológica, alta estabilidade e solubilidade (Kiefer, 2005). Os microminerais orgânicos disponíveis atualmente no mercado possuem diferentes características químicas e físicas, em decorrência do tipo de ligante utilizado e, consequentemente, geram diferentes respostas nutricionais. Deve-se levar em consideração que nem todos minerais orgânicos são capazes de aumentar a biodisponibilidade de um mineral da mesma maneira (Cao et al., 2000). a.2) Prebióticos – aditivo zootécnico Os prebióticos podem ser definidos como substâncias alimentares, carboidratos não digestíveis, que nutrem um grupo seleto de microrganismos que povoam o intestino, favorecendo a sua multiplicação. Em geral, com o uso desses produtos busca-se maior multiplicação das bactérias benéficas, em detrimento das bactérias prejudiciais. Estes carboidratos não digestíveis (como parede celular de plantas e leveduras) são classificados desta forma por serem constituídos de complexos de oligomananoproteínas, principalmente de mananoligossacarídeos (MOS), que possuem a capacidade de ligar-se a fímbria das bactérias e inibir a colonização do aparelho digestivo. Os prebióticos mais estudados e utilizados na nutrição animal são os mananoligossacarídeos (MOS) e os frutoligossacarédeos (FOS). a.3) Probióticos – aditivo zootécnico Os probióticos são microrganismos vivos, administrados em quantidades adequadas, que conferem benefícios à saúde do hospedeiro. Os probióticos 12 influenciam beneficamente a saúde do hospedeiro pela melhoria do balanço microbiano intestinal, ou seja, eles competem com a flora patogênica por nutrientes, locais de adesão no epitélio intestinal, sintetizando metabólitos (ácidos orgânicos) que criam resistência ao crescimento de microrganismos patogênicos. Segundo Butolo (1999), nos produtos comerciais disponíveis para aves, suínos, bovinos, ovinos e equinos, as espécies de bactérias mais comumente utilizadas no preparo são as dos gêneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Streptococus, Bacillus e as leveduras. a.4) Simbióticos – aditivo zootécnico Um produto simbiótico é aquele no qual estão combinados um probiótico e um prebiótico, ou seja, alia o fornecimento de microrganismos probióticos juntamente com substâncias prebióticos específicas que estimulem seu desenvolvimento e atividade, potencializando o efeito de ambos os produtos. a.5) Antimicrobianos – Aditivo zootécnico melhorador do crescimento e anticoccidianos A suplementação de antimicrobianos nas dietas de suínos e aves tem sido utilizada com finalidades profiláticas e como meio de melhorar o crescimento e a utilização de alimentos pelos animais. Quando adicionados às dietas em doses subterapêuticas como promotores de crescimento, têm se mostrado eficientes no controle de bactérias patogênicas intestinais. Os principais benefícios da utilização dos antimicrobianos são alterações no metabolismo da microbiota intestinal, assim como a troca de organismos patogênicos por bactérias benéficas, resultando em maior utilização dos nutrientes, menor carga de substratos para proliferação microbiana patogênica e melhoria na condição de saúde e integridade intestinal. Entretanto, esse efeito nas bactérias sempre foi muito contestado, alegando-se que essa é uma forma de estabelecer, nos animais, reservatórios para organismos patógenos resistentes a antibióticos específicos isolados em humanos. Apesar dos conhecidos benefícios associados à produção animal, a atribuição do desenvolvimento de resistência bacteriana levou a diferentes casos de proibição do uso de antibióticos como promotores de crescimento nos 13 sistemas de produção animal, como a União Europeia, que a partir de janeiro de 2006, o uso de antibióticos para este fim passou a ser proibido nas dietas de aves e suínos. No entanto no Brasil, alguns antibióticos utilizados como aditivos melhoradores do desempenho e como anticoccidianos são permitidos pelo MAPA, dentre eles podemos citar: a bacitracina, avilamicina, flavomicina, monensina (melhoradores do desempenho) e lasalocida, salinomicina e monensina (anticoccidianos). Na nutrição de ruminantes, a monensina (ionóforo), é provavelmente o aditivo mais pesquisado. A ação dos ionóforos no rúmen ocorre por mudanças na população microbiana, selecionando as bactérias Gram-negativas, produtoras de ácido succínico, e inibindo as Gram-positivas, produtoras de ácidos acético, butírico e lático e H+. Como resultado dessa alteração na população microbiana, há mudanças nos produtos finais da fermentação, em geral com redução das concentrações de ácido acético e butírico e aumento das de propionato. Consequentemente, em virtude da relação inversa entre o ácido propiônico e a produção de metano, observa-se redução da produção de metano em resposta ao aditivo. Consequentemente, pesquisadores e nutricionistas têm o desafio de encontrar alternativas seguras ao uso de antibióticos, e dentre as alternativas que são estudadas nos dias de hoje, é dada especial atenção ao uso de óleos essenciais e ácidos orgânicos como promotores de desempenho e saúde animal. a.6) Óleos essenciais - Aditivo zootécnico melhorador do crescimento Quanto aos óleos essenciais, diversas referências na literatura científica demonstram clara evidência de atividade antimicrobiana, antifúngica e antiviral in vitro de extratos vegetais contra patógenos dos animais, dos alimentos e humanos. Brugalli (2003) relata que, dentre os possíveis mecanismos de ação dos óleos essenciais no organismo animal, aponta-se alterações na microflora intestinal, aumento na digestibilidade e absorção de nutrientes através do estímulo à atividade enzimática, melhoria da resposta imune, controle na produção de amônia e modificações morfo-histológicas no trato gastrointestinal. 14 Apresentam ainda certa vantagem sobre os antimicrobianos tradicionais, pois estes possuem apenas um princípio ativo, enquanto os óleos essenciais podem conter vários compostos e um só produto, tendo assim, efeito sinérgico benéfico na melhora do desempenho do animal. Recentemente, espécies como a do alho, manjerona, orégano, hortelã, alecrim, tomilho, pimenta-vermelha e cebola despertaram interesse dos pesquisadores da nutrição animal, pois possuem princípios ativos que podem trazer benefícios aos animais. No entanto, considerando a vasta diversidade de plantas existentes, o grande desafio na utilização de extratos vegetais, como alternativas ao usode antimicrobianos na alimentação animal está na identificação e quantificação dos efeitos exercidos pelos diferentes componentes presentes nos óleos essenciais sobre o organismo animal. O uso de ácidos orgânicos como controladores da carga microbiana no trato digestivo e promotor de melhoria da morfologia intestinal tem demonstrando resultados interessantes. Dentre os efeitos dos ácidos orgânicos estão a inibição do crescimento da E. coli e outras bactérias patogênicas, assim como efeito redutor do pH gástrico, resultando em aumento da proteólise e consequentemente melhoria na digestão da proteína e aminoácidos. a.7) Enzimas – Aditivo zootécnico digestivo Dentre os aditivos zootécnicos podemos destacar o uso das enzimas, que tem sua utilização voltada para a melhoria do processo de digestão e absorção de nutrientes. Na alimentação de monogástricos é preconizada de forma suplementar a ação das enzimas endógenas (amilases, proteases e lípases), ou de forma aditiva, visando reduzir os fatores antinutricionais de alguns ingredientes, bem como melhorar a disponibilidade dos nutrientes, principalmente aqueles encapsulados dentro da parede celular e/ou ligados em estrutura química que as enzimas endógenas ao animal não conseguem degradar eficientemente, como no caso das fitase, beta-glucanases e pentosanases, que degradam fitatos, beta-glucanos e pentosanas, respectivamente. Dentre as enzimas citadas a fitase ganha destaque, visto que possibilita a liberação do fósforo fítico e de outros nutrientes. Isto pode reduzir a 15 suplementação com fósforo inorgânico, reduzindo custo e melhorando a utilização do fósforo presente nos alimentos, além de reduzir o fósforo excretado. As enzimas são usadas na elaboração de rações pela adição direta (forma granular) ou por incorporação pela indústria em pré-misturas (premix). Os benefícios com o uso de enzimas podem ser obtidos também no custo, pela substituição de ingredientes tradicionais de alto custo por ingredientes alternativos de menor custo. 16 CAPÍTULO 2 CONSTITUINTES DOS ALIMENTOS PARA NUTRIÇÃO ANIMAL 1. Introdução O alimento constitui em toda matéria possível de ser ingerida pelo animal, podendo ou não conter nutrientes digestíveis. Os alimentos são constituídos por uma mistura complexa de nutrientes, os quais por sua vez podem ser divididos em duas frações: água e matéria seca; sendo na fração da matéria seca que se encontram os nutrientes orgânicos (matéria orgânica) e inorgânicos (matéria mineral), exceto a água, naturalmente. Desta forma, os nutrientes podem ser classificados em nutrientes orgânicos (lipídeos, carboidratos, proteínas, nitrogênio não proteico e vitaminas) e inorgânicos (minerais e água). 2. Nutrientes 2.1 Água As fontes de água para os animais são: a) água de beber; b) água presente nos alimentos consumidos e, c) água metabólica isto é, a água resultante da oxidação do H2 contidos nas proteínas, carboidratos e lipídeos. Os fatores que afetam as exigências de água são a espécie animal; a ingestão de matéria seca (MS); a temperatura ambiente; a ingestão de sal; a ingestão de proteína para excreção de ureia e incremento calórico; a condição fisiológica; e entre outros fatores. No organismo animal a água atuará principalmente no transporte de nutrientes para as células, no transporte de compostos a serem eliminados, nas reações químicas do metabolismo, na regulação da temperatura corporal, na manutenção da forma das células e na lubrificação das articulações, além de compor grande parte do sangue, leite e urina, bem como muitos outros fluídos do organismo. 17 A principal fonte de água que supre as necessidades diárias dos animais é a de beber, a qual deve estar sempre disponível para o animal, de forma limpa e livre de contaminantes e odores. Com relação á água encontrada nos alimentos, os alimentos volumosos úmidos, naturalmente, apresentam maior teor de água que os alimentos concentrados. Como exemplo pode-se citar o clone de capim elefante anão, BRS Kurumi, lançado pela EMBRAPA, o qual apresentou teor de matéria seca de 13,38% quando manejado em regime de lotação intermitente na época das águas no município de Valença-RJ (Madeiro, 2010); e o grão de milho, alimento concentrado energético, que possui em média 87% de matéria seca. Estima-se o consumo diário, aproximado, de água por bovinos de corte com até 410 kg de peso corporal, de 32 L; por vacas leiteiras em lactação de 62 L; por frangos de corte com 1 semana de 32 mL e com 8 semanas de 286 mL e; por suínos, de 56 a 95 dias, de 8 litros (Embrapa 2005). 2.2 Carboidratos Os compostos mais abundantes na natureza são os carboidratos. A origem primária dos carboidratos está na fotossíntese quando a energia luminosa da radiação solar é incorporada às ligações químicas da molécula de glicose. O arranjo das moléculas de glicose nos vegetais, com ligações do tipo alfa (α) do amido e beta (β) da celulose, moldou o desenvolvimento dos sistemas digestivos dos animais heterótrofos. Os carboidratos são classificados pelo grupo funcional em aldoses (presença do grupo funcional aldeído) e cetoses (presença do grupo funcional cetona), e estas podem ser classificadas pelo número de carbonos de sua estrutura como trioses (3C), tetroses (4C), pentoses (5C – ribose, arabinose e xilose), hexoses (6C-glicose, galactose e frutose), heptoses (7C) e assim por diante. A classificação dos carboidratos em estruturais e não estruturais refere- se unicamente à função desempenhada nas plantas e não deve ser confundida com papel dos carboidratos na nutrição animal. Os carboidratos estruturais são encontrados na parede celular dos vegetais e fornecem o suporte físico necessário para o crescimento das plantas. A parede celular é composta de 18 pectina, celulose, hemicelulose, compostos fenólicos, dentre os quais se destaca a lignina, e proteína. Os carboidratos não estruturais estão localizados no conteúdo celular e são encontrados em maior concentração nas sementes, folhas e hastes e representam reservas de energia usadas para reprodução, crescimento e sobrevivência durante períodos de estresse. Em relação à composição de alimentos, fibra é um termo usado para estabelecer um conceito puramente nutricional que designa a fração do alimento composta por unidades formadoras unidas por ligações do tipo beta, não digerida por enzimas secretadas pelo trato digestivo dos animais, mas passível de degradação microbiana no estômago de animais ruminantes e no intestino grosso doa animais ruminantes e não ruminantes. Na nutrição de ruminantes a fibra é definida como a fração indigestível ou de lenta digestão do alimento que ocupa espaço no trato gastrointestinal, e que promove o perfeito funcionamento do rúmen. Desta forma, a prede celular vegetal não pode ser considerada como medida acurada da fibra, pois também contém pectina, que possui digestibilidade alta e constante. Desta forma, em termos nutricionais, a classificação dos carboidratos em fibrosos e não fibrosos parece mais apropriada porque é baseada em características nutritivas, ao invés de composição química ou função exercida na planta. Nessa classificação, os carboidratos não fibrosos (CNF) representão as frações degradadas mais rapidamente e incluem a pectina, amido e açúcares. Os carboidratos fibrosos (CF), que ocupam espaço no trato gastrintestinal e exigem mastigação para redução do tamanho de partícula e passagem através desse trato, incluem a celulose, hemecelulose. No caso dos CF a fibra em detergente neutro (FDN) tem o mesmo significado nutricional, pois representa a mesma fração de carboidratos dos alimentos. Sniffen et al. (1992) classificaram os carboidratos com base no modo diferenciado em queos microrganismos, presentes no rúmen-retículo, fazem uso desses, ou seja de acordo com a sua taxa de degradação (h-1). Dessa forma os carboidratos foram classificados em quatro frações: Fração A - apresenta taxas de degradação rápida, são considerados nesse grupo os açúcares simples, glicose, sacarose e ácidos orgânicos; Fração B1 - carboidratos de degradação intermediária como o amido e pectina; Fração B2 - 19 conhecida como fibra disponível, são os carboidratos de taxa de degradação lenta como a celulose e a hemicelulose e Fração C – denominada como fibra indigestível ou não disponível. 2.3 Proteínas As proteínas são macromoléculas presentes nas células com funções diversas, como componentes estruturais, funções enzimáticas e hormonais e armazenamento de informações genéticas. Embora não exerçam função de reserva energética como os carboidratos e os lipídeos, as proteínas, pela oxidação dos aminoácidos, podem liberar energia, mas isso tem alto preço para o produtor e um custo elevado para o organismo e para o meio ambiente. Todas as proteínas são constituídas por aminoácidos unidos covalentemente em sequências caracterizadas por ligações denominadas peptídicas, em que o ácido carboxílico de um aminoácido se liga ao radical amina do outro aminoácido. Na natureza podem ser encontrados mais de 200 aminoácidos, mas destes, apenas 20 são considerados proteicos. A proteína é o componente mais caro da ração animal, e a qualidade da proteína de um alimento pode ser comparada com a de outro pela composição dos aminoácidos, especialmente a proporção dos nove aminoácidos essenciais. Os aminoácidos são classificados como essenciais (metionina, lisina, treonina, triptofano, valina, fenilalanina, leucina, isoleucina e histidina) e não essenciais (ácido glutâmico, glutamina, cistina, glicina, serina, alanina, aspartato, asparagina) e, considerando a espécie animal, surgem mais duas categorias: os exigidos pela espécie animal (Arginina – gatos, aves e peixes; taurina – gatos) e os condicionalmente não essenciais. Os aminoácidos essenciais não são sintetizados ou são em quantidades muito inferiores às necessidades dos animais, enquanto que os aminoácidos não essenciais são sintetizados a partir do esqueleto de carbono da glicose ou de outros aminoácidos e dos grupos amino de aminoácidos em excesso. Considerando a nutrição de ruminantes a proteína bruta dos alimentos pode ser classificada em proteína degradável no rúmen (PDR) e proteína não degradável no rúmen (PNDR). Dentro deste contexto, Sniffen et al. (1992) 20 classificaram a proteína dos alimentos em cinco frações, sendo elas: Fração A - de rápida fermentação (nitrogênio não proteico – NNP e peptídeos); Fração B - representa a proteína potencialmente degradável, sendo dividida em três subfrações; Fração B1 - proteína solúvel no rúmen, Fração B2 - proteína insolúvel de degradação intermediária e Fração B3 – proteína insolúvel de degradação lenta; e Fração C - insolúvel em detergente ácido. Dentre os alimentos disponíveis para serem utilizados na alimentação animal como fonte de proteína, destacam-se os concentrados: farelo de soja com 45 a 48% de proteína bruta (PB); o farelo de algodão com 30% de PB; o farelo de girassol com 46% de PB; e dentre os volumosos destacam-se as leguminosas, como a alfafa com 21% de PB (Rostango et al., 2011;Valadares Filho et al., 2011). 2.4 Lipídeos Biologicamente, os lipídeos fazem parte de um grupo de compostos quimicamente heterogêneos entre si, e a única característica comum a todos eles é a insolubilidade em água e, portanto, são solúveis em solventes orgânicos (clorofórmio, benzeno, éter, acetona e octano). As funções biológicas dos lipídeos são tão diversas quanto à sua química. Gorduras e óleos são as principais formas de armazenamento de energia em muitos organismos. Os fosfolipídeos e os esteróis são os elementos estruturais mais presentes nas membranas biológicas. Outros lipídeos, embora relativamente presentes em pequenas quantidades, têm papel importante como cofatores enzimáticos (vitaminas), carreadores de elétrons, pigmentos para absorção de energia, agentes emulsificantes no trato digestivo, hormônios e mensageiros intracelulares (Lehninger, 2011). Em termos energéticos, as gorduras são mais concentradas (9,4 kcal EB) que os carboidratos (4,15 kcal EB) e as proteínas (6,65 kcal EB), entretanto a densidade energética das gorduras depende do tamanho da cadeia carbônica e da presença e do número de duplas ligações na cadeia. Os lipídeos podem ser classificados como lipídeos simples, sendo aqueles que não possuem ácido graxos na sua molécula, e lipídeos complexos os quais apresentam ácido graxos na sua molécula. 21 Os ácidos graxos geralmente não apresentam cadeia ramificada, e quando contêm apenas ligações simples são chamados de saturados (gorduras), e com uma ou mais dupla ligação, são chamados de insaturados (óleos). Os principais ácidos graxos saturados são o acético (2C), propiônico (3C), Butírico (4C), Valérico (5C), Caproico (6C), Caprílico (8C), Cáprico (10C), Láurico (12C) Mirístico (14C), Palmítico (16C) e Esteárico (18C); já os insaturados são o Caprílico (C8-1), Palmitoleico (C16 -1), Oleico (C18-1) e Linoleico (C18-2), Linolênico (C18-3). a) Lipídeos simples Constituem este grupo os terpenos e os esteroides. Os terpenos são lipídeos de cadeia longa, sendo componentes de moléculas biologicamente ativas tais como os pigmentos da clorofila, carotenoides como beta-caroteno (provitamina A), tocoferóis como precursores da vitamina E, ubiquinona (coenzima Q), vitamina K e componentes dos óleos essenciais como o da laranja (limoneno), das flores (geraniol), do óleo da hortelã (mentol). Os esteroides pertencem ao grupo de moléculas derivadas do colesterol, como por exemplo, os hormônios esteroides (testosterona e estrógeno) e a vitamina D3 (colicalciferol). b) Lipídeos complexos São os mais presentes na ração e no corpo dos animais, sendo formados por triacilgliceróis, galactolipídeos, fosfolipídeos, glicolipídeos e ceras. Os triacilgliceróis ou triglicerídeos são ésteres de três ácidos graxos com o glicerol (carboidrato), e representam a forma típica de armazenamento de energia nos organismos animais e vetais e, portanto, têm maior importância nutricional para os animais onívoros como suínos e aves. Os herbívoros como coelhos, cavalos e ruminantes ingerem considerável quantidade de galactolipídeos vegetais, os quais são formados por um ou dois resíduos de galactose esterificados na posição três (Mayes & Botham, 2006). Dentre os cereais, a canola apresenta elevada concentração, 60%, do ácido graxo oleico (C18:1), também conhecido como ômega 9; e a soja e o 22 girassol elevada concentração, 52%, de ácido linoleico (C18:2), ou ômega 6 (Rostango et al., 2011). Com relação à concentração de ácidos graxos nas forrageiras, segundo Bauchart et al. (1984) gramíneas de clima temperado contêm 1 a 3% de ácidos graxos na matéria seca, sendo sua composição, predominantemente, de ácidos graxos insaturados (em média, 70 a 90%), com prevalência dos ácidos graxos linoleico e α-linolênico. Lopes et al (2011) em compilação dos dados da literatura reportaram o perfil de ácidos graxos de forrageiras tropicais com destaque para os elevados teores de ácido α-linolênico nas gramíneas do gênero Brachiaria e no capim elefante, e as concentrações de ácido linoleico na cana de açúcar e na silagem de milho. 2.5 Minerais Os minerais podem ser classificados quanto aos seus requerimentos em macro e microminerais. Os que são necessários em grandes quantidades (quantidades maiores que 100 mg/dL) são denominados macrominerais: Cálcio (Ca), Cloro(Cl), Enxofre(S), Fósforo(P), Magnésio(Mg),Potássio(K), e Sódio(Na); e os que são exigidos em menores quantidades (quantidades inferiores a 100 mg/dL) são os microminerais: Ferro (Fe), Cobre(Cu), Cobalto(Co), Iodo(I), Manganês(Mn), Zinco(Zn), Selênio(Se), Molibdênio(Mo) e Flúor (F). A falta ou quantidades insuficientes destes resultam em sintomas de deficiência de minerais, reduzindo o desempenho, e quantidades em excesso, por outro lado, também levam a redução no desempenho pela ocorrência de toxidez. a) Macrominerais i) Cálcio (Ca) É o elemento mais abundante no organismo animal e, juntamente com o fósforo, compreende aproximadamente 70% das “cinzas” do organismo. Aproximadamente 99% do cálcio estão contidos nos ossos e dentes. Apresenta interação com o P e o Mg, em que, o excesso de ambos interferem na absorção de cálcio. O sinal mais evidente de deficiência observa-se na estrutura do esqueleto, com raquitismo nos jovens e osteomalácea nos adultos. 23 Possui ainda interação com a vitamina D, a qual ativa o sistema de absorção de cálcio. O conteúdo de cálcio na forragem é influenciado pela espécie, porção da planta consumida, maturidade, quantidade de Ca trocálvel no solo e clima. As forrageiras geralmente são boas fontes de Ca, as leguminosas apresentam maior teor de Ca que as gramíneas, e o grão e cereais são pobres em cálcio. No entanto, a literatura mostra que o cálcio nas leguminosas é geralmente menos disponível que na farinha de carne e ossos ou no fosfato bicálcico. Cerca de 20 a 30% do cálcio da alfafa está na forma de oxalato de cálcio e, aparentemente indisponível para ruminantes. ii) Fósforo (P) A absorção do P pode ser prejudicada pelo Mg, Al, Fe e Ca, que formam precipitados fosfatados no trato gastrintestinal. O P pode ser ingerido pelo animal na forma inorgânica como mono, di ou trifosfato, ou na forma orgânica como fitatos, fosfolipídeos ou fosfoproteínas. Nos vegetais, o maior percentual do fósforo presente encontra-se ligado ao ácido fítico que não é digerido pelos animais não ruminantes e, portanto não é aproveitado. A inclusão da enzima fitase impacta positivamente a biodisponibilidade do P presente no milho e farelo de soja em rações práticas para não ruminantes, porém, em animais ruminantes, em virtude da produção de fitase microbiana no rúmen o fitato é amplamente utilizado. iii) Potássio (K) Desempenha importante papel na regulação da pressão osmótica dos líquidos do organismo e no balanço ácido base. No rúmen, o potássio está ligado à manutenção da ação tampão. As forragens contêm entre 1% e 4% de K, portanto, são excelentes fontes desse mineral. Em geral, os grãos de cereais são deficientes, com menos de 0,5% de K, no entanto, farelos de oleaginosas são uma boa fonte. 24 iv) Magnésio (Mg) Cerca de 70% do magnésio encontra-se formando o esqueleto, enquanto os 30% restantes estão no interior das células e nos líquidos do organismo. Em relação à absorção, apresenta interação com o Ca e P. Em geral, os grãos de cereais contêm entre 0,11 e 0,17% de Mg. A concentração de Mg nas forrageiras varia com a espécie, teor de Mg do solo, estádio de crescimento e condições ambientais. As leguminosas, em geral, possuem maior teor de Mg que as gramíneas v) Sódio (Na) É o principal cátion do fluído extracelular, e juntamente com o K apresenta papel importante na manutenção do equilíbrio ácido base. Grãos de cereais e farelos de oleaginosas fornecem inadequado conteúdo de Na. Geralmente, os produtos de origem animal são mais ricos em Na do que produtos vegetais. O teor de Na nas forragens varia consideravelmente, mas sempre está presente em baixas concentrações e é considerado um elemento prejudicial à planta. vi) Cloro (Cl) É o principal ânion do fluído extracelular, desempenhando, através de sua combinação com o Na e o K papel importante na regulação do equilíbrio ácido base. Por outro lado é importante na digestão dos alimentos no estômago, onde é secretado na forma de ácido clorídrico (HCl) pelas células principais, garantindo o pH ácido (pH 2). Grãos de cereais e farelos de oleaginosas fornecem inadequado conteúdo de Na. O teor de Na nas forragens varia consideravelmente, mas sempre está presente em baixas concentrações e é considerado um elemento prejudicial à planta. vii) Enxofre (S) O S é encontrado amplamente nos alimentos como um constituinte da proteína, no entanto, a deficiência de S no solo pode refletir no seu conteúdo na planta, que se relaciona diretamente com o teor de proteína dos alimentos. 25 b) Microminerais i) Ferro (Fe) O ferro esta presente no sangue, principalmente na hemoglobina, nos eritrócitos e na transferrina. Tem interações com a vitamina E e faz parte de vários sistemas enzimáticos. Grão de cereais contêm normalmente de 30 a 60 mg de Fe/kg; farelos de oleaginosas contêm de 100 a 200 mg de Fe/kg. Com exceção do leite e seus derivados, os alimentos de origem animal possuem alto teor de Fe. Nas plantas forrageiras, o conteúdo de Fe varia de 70 a 500 mg de Fe/kg. No Brasil, os teores de Fe nos solos são elevados, proporcionando concentração desse mineral nas plantas que atende as exigências dos animais. ii) Cobre (Cu) O cobre está envolvido na absorção e utilização do Ferro. O conteúdo de Cu na forragem varia muito, dependendo da espécie da planta e da disponibilidade de Cu no solo. As leguminosas apresentam geralmente mais Cu do que as gramíneas. 2.6 Vitaminas As vitaminas são moléculas orgânicas complexas encontradas naturalmente nos alimentos ou na forma de precursores, responsáveis pelo controle de muitos processos metabólicos e requeridos em quantidades mínimas para a manutenção da saúde, crescimento e reprodução. Na ausência de uma ou mais vitaminas sintomas específicos, conhecidos como doenças carenciais, podem acometer animais jovens e adultos. As vitaminas são classificadas segundo a solubilidade em dois grandes grupos: a)Vitaminas lipossolúveis, solúveis nos lipídeos e nos solventes orgânicos, formado pelas vitaminas A, D, E e K; b)Vitaminas hidrossolúveis, solúveis em água, formado pelas vitaminas B1, B2, B6, B12 e ácido nicotínico, ácido pantotênico, ácido fólico, biotina, colina e ácido ascórbico. 26 a) Vitaminas lipossolúveis i) Vitamina A Nas plantas (frutas e vegetais), pode-se encontrar o caroteno, precursor da vitamina A (provitamina A). As funções da vitamina A incluem o metabolismo da visão (previne xeroftalmia), pela formação da rodopsina e a síntese de mucopolissacarídeos, que atuam no crescimento dos ossos e dentes, e no desenvolvimento do tecido epitelial. As fontes de vitamina A nos alimentos são o milho, feno de gramíneas e leguminosas e pastagens verdes. Os carotenoides, especialmente o beta-caroteno, transformam-se em vitamina A no intestino delgado. A eficácia desta conversão, na vaca, é relativamente pequena, de forma que, a gordura do leite das raças Jersy e Guernsey apresenta três vezes mais caroteno que as vacas da raça Holandesa, o que explica a intensa cor amarela do leite destas raças. Por sua vez, os bubalinos possuem eficácia na transformação do beta-caroteno em vitamina A no intestino, de forma que o leite de búfala apresenta coloração branca. ii) Vitamina D A vitamina D é encontrada nas plantas na forma de ergocalciferol (vitamina D2). O ergosterol das plantas sob a ação dos raios ultravioleta é transformado em ergocalciferol (vitamina D2). As funções da vitamina D incluem o controle do metabolismo do cálcio e fósforo, a atuação como promotor do crescimento e mineralização dos ossos e dentes. iii) Vitamina E A vitamina E, também chamada de tocoferol, está presente na fração lipídica dos vegetais na forma dealfa-tocoferol. A vitamina E atua como antioxidante, em que retarda a rancificação, protegendo as células corporais de substâncias tóxicas formadas pela oxidação de ácidos graxos insaturados. As fontes de vitamina E são as forragens verdes, milho e farelo de soja. 27 iv) Vitamina K A vitamina K ocorre em duas formas naturais, a vitamina K1 presente nas plantas verdes, e a vitamina k2 sintetizada pelos microrganismos presentes no rúmen e intestino grosso. A vitamina K atua na coagulação sanguínea, em que a mesma é indispensável à produção de protrombina, que junto com o cálcio são transformados em trombina, que adicionado ao fibrinogênio, produz a fibrina (coágulo). As rações são, normalmente, ricas em vitamina K, como também a pastagem verde, o feno,o milho e o farelo de soja. b) Vitaminas Hidrossolúveis i) Tiamina A tiamina (vitamina B1) é ingerida no alimento e também disponível na forma livre, na forma de tiamina pirofosfato (TPP) e como complexo de proteína fosfato. ii) Niacina A niacina encontra-se na forma de ácido nicotínico e nicotinamida, estando o ácido nicotínico presente nas plantas e a nicotinamida no corpo do animal. A niacina é constituinte do NAD e NADP. iii) Vitamina B6 (piridoxina, piridoxal e piridoxamina) A vitamina B6 encontra-se na forma de piridoxina, piridoxal e piridoxamina. A forma predominante nas plantas é a piridoxina e as predominantes nos animais são o piridoxal e piridoxina. A vitamina B6 atua no metabolismo dos aminoácidos, envolvendo os processos de transaminação e descarboxilação. iv) Ácido fólico O ácido fólico é encontrado em folhas de plantas verdes (espinafre) e é uma vitamina essencial para o crescimento, reprodução, prevenção de desordens sanguíneas, e entre outros. Atua na formação do heme (proteína contendo ferro na hemoglbina) e na síntese de aminoácidos não essenciais. 28 CAPÍTULO 3 TÉCNICAS PARA ANÁLISE DE ALIMENTOS PARA NUTRIÇÃO ANIMAL 1. Introdução A análise de alimentos é um dos principais pontos a serem observados no setor de nutrição animal. O objetivo principal da análise é conhecer a composição química do alimento, sua ação no organismo, seu valor alimentício e calórico, suas propriedades físicas, toxicológicas e também adulterantes, contaminações, fraudes, etc (Silva e Queiroz, 2002). Desta forma serão abordadas as principais técnicas de análise de alimentos empregadas, desde a obtenção e preparo da amostra até os ensaios de digestibilidade nos laboratórios de nutrição e alimentação animal. 2. Obtenção de amostras Para a realização de uma análise é necessária à obtenção de amostra representativa do material a ser analisado; assim, a amostragem de alimentos tem por finalidade a obtenção de uma fração (amostra) química e fisicamente representativa do material a ser avaliado, e que tenha tamanho apropriado para o trabalho no laboratório (Silva e Queiroz, 2002). O método de amostragem deve ser realizado em função do material e do ambiente de amostragem, tornando-se, portanto, essencial o cuidado na coleta destas amostras. A quantidade de amostra tomada para a realização da análise é relativamente pequena em comparação com a amostra total, de forma que, a amostragem deve compreender de 10 a 20% do número de embalagens ou de 5 a 10% do peso total do alimento a ser analisado (Cecchi, 2003). 2.1 Amostragem de pasto A pastagem constitui um ambiente muito complexo, devendo ser coletado o material representativo do consumido pelo animal. No caso de sistemas de pastejo intermitente, a amostragem deve ser feita com cortes em 29 vários pontos do pasto simulando a altura de saída dos animais. Para sistemas de pastejo contínuo as amostras devem ser obtidas por simulação manual do pastejo (pastejo simulado), buscando-se obter porções da planta similares àquelas ingeridas pelos animais. Deve-se evitar amostrar próximo de estrada ou cochos de sal mineral por conta de eventuais contaminações. 2.2 Amostragem de silagens e fenos No caso das silagens, deve-se fazer a amostragem em todo o perfil do silo devido à heterogeneidade causada por diversos fatores (compactação, tempo de enchimento, respiração, umidade). Deve-se evitar a tomada de amostras nas proximidades das paredes e do chão, pois são locais propícios à degradação da silagem devido à presença de oxigênio e/ou acúmulo de umidade. No caso de feno a campo (medas ou montes), deve-se desprezar a camada exposta ao ar e retirar do fardo uma camada de 8-15 cm de espessura, em vários pontos. 2.3 Amostragem de grãos e farelos em sacarias A coleta da amostra deve ser realizada utilizando-se calador simples, introduzindo-o na diagonal, procurando chegar o mais fundo possível. Com relação ao número de sacos a amostrar recomenda-se na prática amostrar 10% dos sacos, respeitando a premesse de que em lotes constituídos de 10 sacos coletar amostra em todos. 2.4 Amostragem de grãos e farelos a granel As amostras devem ser colhidas usando-se caladores de parede dupla. É necessário que a amostra seja coletada ao acaso, em lugares diferentes. As amostras devem ser coletadas em todo o perfil vertical devido à estratificação ocorrida durante o transporte do produto. Deve-se evitar amostrar menos de 50 cm da borda do caminhão, pois os grãos localizados na parte superior e lateral do caminhão ou vagão podem ter sofrido influência de ventos, chuva ou sol. Depois de colhidas, as amostras deverão ser colocadas em sacos plásticos, lacradas, identificadas e transportadas imediatamente ao laboratório, 30 a fim de não alterar a umidade do material durante o transporte e evitar ocorrência de fermentação. O ideal seria analisar as amostras frescas o mais rápido possível. Mas nem sempre isto é possível e, nesses casos, deve-se preservá-las até o momento do processamento e/ou análise (Cecchi, 2003). Quando as análises não forem processadas imediatamente, é necessário que as amostras sejam conservadas em congelador entre -5 e -10ºC para evitar alterações na composição do alimento. 3. Processamento físico da amostra O processamento físico da amostra constituí a adequação da amostra para análise, sem alteração ou com a mínima alteração possível, evitando-se promover a perda de sua representatividade. Esse processo geralmente envolve secagem e moagem. Se a massa de amostra é muito grande para a análise, esta deve ser reduzida. A redução (quarteamento) poderá ser feita manualmente ou por meio de equipamentos (amostrados tipo Jones, tipo Riffle, Tipo Boener). 3.1 Redução do teor de umidade em estufa com circulação forçada de ar Materiais que contenham teor de umidade acima de 15%, como silagens e amostras de pasto, devem ser submetidos a uma secagem parcial, ou pré- secagem, para facilitar o processamento mecânico (moagem) e permitir seu armazenamento até a realização das análises. A secagem parcial é realizada em estufa com circulação forçada de ar e temperatura de 60±5ºC, por 72 horas (AOAC, 1995), para evitar perda de compostos voláteis e alterações químicas permitindo a análise dos seus componentes posteriormente. Após a secagem, a amostra deve entrar em equilíbrio com a temperatura ambiente, com a finalidade de minimizar alterações da umidade que podem ocorrer durante o processo de moagem e de armazenamento. Contudo, alimentos que contêm altos valores de umidade, e que sofrem aquecimento acima de 60ºC, sofrem modificações induzidas pela reação de Maillard, reações não enzimáticas entre os carboidratos solúveis e grupos aminas dos aminoácidos, resultando em compostos denominados produtos da 31 reação de Maillard, que têm como principal consequência a diminuição do valor nutritivodas proteínas afetando as características da parede celular. Os compostos de Maillard são mensurados junto com a lignina, quando esta é determinada pelo método da lignina em detergente ácido (Van Soest, 1994), gerando dados errôneos acerca da composição química do alimento e influenciando negativamente no balanceamento da dieta pelo sistema CNCPS. 3.2 Redução do tamanho de partículas A redução do tamanho de partículas é necessária para padronização da superfície específica do alimento, promovendo, assim, melhor homogeneização para uma futura sub-amostragem ou suprindo as exigências de métodos específicos. Para análise quantitativa do alimento, este deve ter seu tamanho de partícula reduzido após a secagem, pois a moagem de amostras úmidas pode causar perdas do material e mudanças químicas. Essa redução ocorre por desintegração mecânica, procedendo à moagem em moinho de facas ou similar. Sugere-se peneiras com porosidade de 5 mm para avaliação in situ de alimentos para ruminantes e de 1 mm para as análises quantitativas. 4. Métodos de análises de alimentos A partir do estabelecimento dos pressupostos para avaliação quantitativa de alimentos na Estação Experimental de Weende no século XIX, quatro grupos de compostos químicos foram adotados como análises laboratoriais usuais para alimentos: cinzas ou matéria mineral (MM), proteína bruta (PB), gordura bruta ou extrato etéreo (EE) e fibra bruta (FB). Contudo, a avaliação quantitativa de um alimento deve se basear na pressuposição de que sua composição centesimal é inteiramente conhecida. Portanto, a união dos compostos químicos definidas acima em uma avaliação quantitativa de alimento somente pode ser realizada se, e somente se, sua soma produza a composição total do alimento. Isto obviamente não é verificado. A partir disso, um quinto grupo químico foi estabelecido, o qual deveria compreender todas as características químicas que não fossem contempladas nos demais grupos. Este novo grupo de compostos químicos 32 seria estimado como: ENN=100-(MM+PB+EE+FB), em que ENN é o extrativo não nitrogenado (todos os temos são expressos como percentual da matéria seca (MS)). De um ponto de vista teórico, o ENN deveria compreender todos os compostos não nitrogenados, não gordurosos e não fibrosos do alimento e deveria apresentar alta digestibilidade (pois conteria amido, açúcares, etc.). Adicionalmente, como o ENN é calculado por diferença, a soma dos cinco grupos de compostos químicos resultaria no alimento total (100%), fazendo com que a suposição básica para avaliação quantitativa fosse suprida. Ao contrário do ENN, a FB deveria representar ou mensurar o material indigestível dos alimentos, notoriamente para animais não ruminantes. O conceito analítico FB foi baseado em características químicas da digestão (extração em ácido simulando a digestão estomacal, seguida por extração em base, simulando o intestino) (Detmann, 2010). No entanto, a extração ácido- base causa a solubilização de hemicelullose e de lignina solúvel (Van Soest, 1994). Portanto, a FB é teoricamente formada por celulose, lignina insolúvel e por resíduos de hemicelulose. Assim, grande parte da hemicelulose e da lignina seria incluída no ENN. A partir disso, o ENN, o qual deveria representar a fração facilmente digerível dos carboidratos, passa a apresentar digestibilidade baixa e altamente variável entre alimentos (Detmann, 2010). Este aspecto, em conjunto com a subestimação dos compostos fibrosos, constitui a principal limitação funcional para utilização da FB e do ENN na nutrição de ruminantes. A partir do desenvolvimento do conceito analítico de fibra insolúvel em detergente neutro (FDN) por P.J. Van Soest na década de 1960, novas perspectivas foram geradas para a avaliação quantitativa de alimentos e dietas para animais ruminantes. A FDN representa uma aproximação química da fibra insolúvel em meio aquoso (como o rúmen) e corresponde à porção do alimento que efetivamente causa efeito de enchimento no rúmen ou em outros segmentos do trato gastrintestinal (Detmann, 2010). A FDN é formada basicamente por celulose, hemicelulose e lignina e sua utilização elimina grande parte das distorções causadas pela solubilização de compostos fibrosos durante a análise por intermédio do conceito de FB. 33 A substituição da FB pela FDN representa uma opção lógica na nutrição de animais ruminantes, pois confere entendimento nutricional mais correto e amplo de alimentos e dietas. Assim, inicialmente, o novo grupo de compostos calculado “por diferença” foi denominado de carboidratos não estruturais (CNE) (Sniffen et.al., 1992). Contudo, uma inconsistência teórica foi observada com esta nomenclatura, pois a pectina (um composto fibroso solúvel com papel estrutural na planta) seria classificada como não estrutural. Posteriormente, essa nomenclatura foi alterada para carboidratos não fibrosos (CNF) (Mertens, 1997). Neste contexto, o novo grupo de compostos químicos seria estimado como: CNF=100-(MM+PB+EE+FDN), sendo todos os termos expressos como base da MS. 4.1 Avaliação do teor de umidade O teor de umidade residual de uma amostra manejada em laboratório representa a umidade remanescente em um alimento úmido após sua desidratação prévia em estufas de ventilação forçada, ou a umidade total de alimentos com baixo teor de umidade, como grãos e farelos. Essa umidade é rotineiramente denominada de “amostra seca em estufa” (ASE). Os teores de ASE de alimentos são normalmente obtidos no Brasil por intermédio da secagem em estufas isentas de ventilação forçada sob temperatura de 105ª por 16 horas. O teor de ASE é utilizado para correta expressão dos teores obtidos com base na matéria seca (MS) da amostra. Contudo, por constituir denominador comum a todos os demais procedimentos laboratoriais, erros cometidos na quantificação dos teores de ASE tornam-se vícios ou erros sistemáticos em todas as demais avaliações, propagando-se, desta forma, ao entendimento global de todas as características do alimento (Mertens, 2003). 4.2 Avaliação das cinzas ou matéria mineral A matéria mineral (MM) é constituída pelo resíduo inorgânico obtido após a queima da matéria orgânica a qual é convertida em CO2, H2O e NO2 e 34 eliminada em conjunto com as substâncias voláteis decompostas pelo calor (Harbers, 1998). O método consiste basicamente na incineração do alimento em altas temperaturas (normalmente de 500 a 600ºC) por 3 a 4 horas, ou tempo suficiente para que ocorra combustão total da matéria orgânica (Silva e Queiroz, 2002). Sendo a matéria seca total do alimento formada pelas frações orgânica e inorgânica, o teor de MM em alimentos constitui estimador indireto do conteúdo de componentes orgânicos totais. Adicionalmente, o conhecimento do teor de MM se faz necessário para se conhecer a proporção dos componentes quantificados por diferença em alimentos, como o extrativo não nitrogenado e os carboidratos não fibrosos. 4.3 Avaliação do nitrogênio total (proteína bruta) pelo método de Kjeldahl O termo proteína bruta (PB) envolve grande grupo de substâncias com algumas semelhanças químicas, porém com funções bioquímicas e fisiológicas diferentes. O nitrogênio é o elemento de propriedades mais distintas presente nas proteínas. O teor de nitrogênio não provém somente das proteínas, mas também de outros componentes como ácidos nucleicos, aminas, aminoácidos não proteicos, etc (Gomes e Oliveira, 2011). Assim, baseado no fato de as proteínas terem percentual de nitrogênio (16%) aproximadamente constante, pode-se proceder à sua avaliação indireta por intermédio da concentração de nitrogênio no material e utilizando-se fatores de conversão para a expressão do resultado em termos de equivalentes proteicos (Silvae Queiroz, 2002). Ou seja, o teor de nitrogênio obtido é multiplicado pelo fator 6,25 para obtenção do teor de proteína bruta. O método mais utilizado no Brasil foi proposto por Kjeldahl na Dinamarca em 1883, quando estudava proteína em grãos. Este apresenta três etapas distintas: digestão, destilação e titulação. 4.4 Avaliação da gordura bruta ou do extrato etéreo O termo extrato etéreo (EE) envolve grande grupo de substâncias insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos, denominados 35 extratores (éter etílico, éter de petróleo, clorofórmio, benzeno). O conhecimento do teor de EE é relevante na análise de alimentos, pois constitui a fração de maior energia dos alimentos, fornecendo, em média 2,25 vezes mais energia que os carboidratos (Silva e Queiroz, 2002). O resíduo obtido é, na verdade, uma fração heterogênea, constituída, além dos lipídeos (galactolipídeos e triglecerídeos), por todos os demais compostos apolares que possam ser extraídos pelo solvente, como: fosfatídeos, esteróis, pigmentos, vitaminas lipossolúveis, ceras, etc. Por isso o resíduo extraído é corretamente denominado de gordura bruta em função da divergência entre o conceito analítico e o conceito bioquímico de lipídeos (Silva, et al., 2011). O método de Goldfish utilizado para a quantificação de EE apresenta três etapas distintas: extração, remoção e pesagem. O método de Randall ou de submersão, também utilizado para avaliação do teor de EE, constitui método previamente aplicado para alimentos à base de carne; no entanto esse pode ser usado nos laboratórios de análises de alimentos para quantificação do teor de EE em rações, grãos e forragens. O Método difere do Goldfish na etapa de extração com o solvente orgânico, pois este deve estar em quantidade suficiente para que ocorra a submersão do cartucho, aumentado a taxa de extração do EE. O método de submersão diminui consideravelmente o tempo de extração necessário para concluir a análise. 4.5 Avaliação da fibra insolúvel em detergente neutro (FDN) e da fibra insolúvel em detergente ácido (FDA) Em termos teóricos, os métodos laboratoriais para análise de fibra em alimentos deveriam ser desenvolvidos para se ajustarem a um conceito nutricional e não o contrário. Contudo, torna-se praticamente impossível que algum método baseado em mensurações laboratoriais químicas ou enzimáticas possa reproduzir todos os efeitos nutricionais da fibra no trato digestivo do animal (Mertens, 2003). Assim, embora a fibra da dieta devesse ser definida por conceitos nutricionais (e não analíticos), esta constitui na prática uma mensuração empírica que é definida pelo método de análise em si. 36 Os métodos de análise denominados fibra insolúvel em detergente neutro (FDN) e fibra insolúvel em detergente ácido (FDA) foram originalmente desenvolvidos por P.J. Van Soest na década de 1960. Esse método se baseia na separação por meio de detergente neutro o conteúdo celular (formado principalmente de proteínas, gorduras, carboidratos solúveis, pectina e outros constituintes solúveis em água) da parede celular, chamada de FDN que é constituída de celulose, hemicelulose e lignina. Já o uso do detergente ácido solubiliza o conteúdo celular, a hemicelulose e os minerais solúveis, além da maior parte da proteína insolúvel, obtendo assim um resíduo insolúvel em detergente ácido, denominado de fibra em detergente ácido (FDA), constituído de celulose e lignina. O método para determinação da FDN e FDA descritos, em que o processo de aquecimento é realizado em aquecedores tem sido substituído pelo uso do autoclave e de analisadores de Fibra Ankom®, o que permite a análise de um número de amostras maior por tempo. 4.6 Avaliação da lignina e celulose Existem diferentes métodos empregados na avaliação da lignina, porém nenhum atende plenamente à expectativa nutricional, relacionando o teor de lignina ao processo digestivo do animal. Há divergências significativas nos resultados obtidos em laboratórios para todos os métodos aplicados. Dentre os métodos, cita-se o da lignina insolúvel em ácido sulfúrico com extração prévia com detergente ácido (método da hidrólise ácida), adotado como padrão por alguns sistemas nutricionais (ex. NRC, 2001), o método de oxidação por permanganato de potássio, que constituí na avaliação gravimétrica do teor de lignina (Van Soest e Robertson, 1985), e o método da lignina Klason. Como rotina em diferentes laboratórios de bromatologia utiliza-se o método de permanganato de potássio, o qual é realizado sequencialmente a análise de FDA. De forma sequencial, também, pode-se analisar a celulose, submetendo o resíduo da análise da lignina em permanganato para o forno mufla, a 500ºC por 3 horas. No entanto, quando realizada análises sequencial 37 incorre a soma dos erros associados às análises químicas realizadas anteriormente. 4.7 Avaliação da energia bruta Para a avaliação do valor energético dos alimentos faz-se necessária a realização de ensaios de digestibilidade, onde, após o fornecimento das dietas experimentais são coletadas as fezes e urina e/ ou excretas. As dietas e o material coletado são analisados em bomba calorimétrica, fornecendo o valor de energia bruta (EB). A energia bruta refere-se a quantidade de calor liberado (kcal/kg ou kcal/g) de determinada amostra, quando está é completamente oxidada em meio rico em oxigênio (25 a 30 atm de oxigênio), por meio do uso da bomba calorimétrica. No entanto, os nutrientes de um alimento têm diferentes capacidades de produção de energia quando completamente oxidados. Apesar da energia bruta pode ser medida de forma relativamente simples, a variabilidade na digestibilidade e metabolismo entre alimentos exclui o seu uso na formulação de ração de ruminantes. Dentre as fontes de variação estão o animal, o alimento e os fatores dietéticos. Além disso, a grande demanda por energia pelos ruminantes de alta produção requer uma determinação mais acurada da energia disponível dos alimentos para o animal. 4.8 Método de refletância no infravermelho proximal (NIRS) O equipamento NIRS (Near Infra Red Spectrometry), ou seja, aparelho de Refletância no Infravermelho Próximo, é um procedimento rápido de análise que não envolve reagentes químicos e destruição da amostra. O funcionamento do NIRS baseia-se na absorção de energia monocromática infravermelha, por ligações químicas dos grupos funcionais dos nutrientes. O espectro obtido é relacionado com uma amostragem padrão, mediante a utilização de equações de predição pré-estabelecidas. São necessárias no mínimo 60 amostras de cada alimento para elaborar as equações de calibração do aparelho. O uso do NIRS para estimar o conteúdo de aminoácido total dos alimentos é uma ferramenta importante para a indústria de rações, pois é 38 rápida e de baixo custo, tornando a formulação mais precisa que em termos de conteúdo de aminoácido total. É importante que o banco de dados seja representativo da variedade de alimentos utilizados na nutrição animal, não limitando sua aplicação a um grupo pequeno de ingredientes. 5. Avaliações biológicas Outra forma de avaliação de alimentos é a biológica, a qual não visa avaliar a composição química do alimento, mas principalmente a sua digestibilidade. A digestibilidade aparente de um alimento é considerada a proporção do ingerido que não foi excretada nas fezes, não considerando a matéria metabólica fecal, representada principalmente pelas secreções endógenas, contaminação por microrganismos e descamações do epitélio. Quando se desconta a perda de matéria fecal metabólica, obtém-se a digestibilidade verdadeira dos alimentos. Existem três diferentes métodos utilizados na experimentação animal para a determinaçãoou estimativa da digestibilidade, sendo eles os métodos in vivo, in situ e in vitro. O método in vivo é o qual se obtém o controle do total de alimento ingerido e do total de fezes produzidas, e por meio da diferença entre consumido e excretado se obtém a digestibilidade aparente do alimento. Esse método é considerado o mais confiável, no entanto, apresenta o inconveniente de requerer maior número de animais, controle rigoroso da quantidade ingerida e excretada, e instalações adequadas. Para isso os animais devem permanecer estabulados individualmente ou em gaiolas metabólicas que permitem a coleta de amostras de fezes e urina separadamente e o consumo individual. É comum o uso de bolsas coletoras de fezes em animais em baias ou até mesmo mantidos em gaiolas, para evitar a contaminação das fezes pela urina, o que leva a alteração no teor de nitrogênio da amostra. Neste ensaio muitas vezes o uso de machos facilita o procedimento experimental pela maior facilidade de separação das fezes e urina. 39 Em algumas situações, com animais sob condições de pastejo ou quando não se possuem instalações adequadas, o controle efetivo do consumido e/ou excretado pelos animais não é possível. Nesses casos, torna- se necessário o uso de ferramentas que possibilitem estimar alguns parâmetros com o uso de marcadores (indicadores). Os marcadores são substâncias indigestíveis, normalmente de fácil determinação, podendo ser administrada com o alimento ou diretamente em algum segmento do trato digestivo, sendo posteriormente identificados e quantificados nas fezes. Dentre as características ideais de um indicador, pode-se enfatizar a capacidade deste ser completamente recuperado nas fezes, ou em qualquer segmento do trato gastrintestinal, ser inerte, não tóxico, não ter função fisiológicas, entre outras. Os marcadores são classificados em internos, representados por substâncias indigestíveis, presentes naturalmente em algum componente no alimento, como a MS, FDN e FDA, denominados de matéria seca idigestível- MSi, fibra em detergente neutro indigestível-FDNi, e fibra em detergente ácido indigestível-FDAi; e os marcadores externos, quando adicionados intencionalmente à dieta ou fornecido via oral ou ruminal, como o óxido crômico (Cr3O3), titânio e LIPE. O óxido crômico é o indicador externo mais utilizado para quantificação de excreção fecal de bovinos em confinamento ou a pasto. Tal peculiaridade se deve ao fato do óxido crômico ser facilmente adicionado à dieta, ser facilmente analisado e apresentar baixo custo. A técnica da degradabilidade in situ propicia uma estimativa rápida e simples da degradação dos nutrientes no rúmen, além de permitir o acompanhamento da degradação ao longo do tempo. O método foi criado por Mehrez e Orskov em 1977 e baseia-se no desparecimento da amostra de alimento acondicionada em sacos de náilon e incubados no rúmen por diferentes períodos de tempo. O método apresenta como vantagem o fato do processo de degradação ocorrer em condições reais do rúmen, de rápida e fácil execução. No entanto, apresenta alguns entraves como a necessidade de animais fistulados no rúmen, os sacos no rúmen devem apresentar livre movimentação, o ambiente ruminal deve estar adaptado aos ingredientes a serem avaliados, e a 40 contaminação do resíduo obtido devido à colonização das partículas pelos microrganismos ruminais, que é possivelmente uma das maiores fontes de erro da técnica. Os métodos in vitro, teoricamente, devem ser capazes de representar o processo de digestão que ocorre no rúmen, abomaso ou intestino, para estimar quantitativamente a taxa e o grau de digestão similar aos obtidos in vivo. A metodologia discrita por Tilly e Terry (1963) ainda é a mais utilizada para a predição da digestibilidade in vitro, simulando a digestão ruminal por 48 horas, seguida por digestão com pepsina e ácido fraco (pH 2) por 48 h. A técnica exige um animal doador de líquido ruminal, normalmente fistulado, que será utilizado em laboratório para incubação das amostras. Outra possibilidade para estudos in vitro que envolvem a taxa de extensão da degradação dos alimentos é a técnica da produção de gás, estimando a digestibilidade do alimento por correlação entre a produção microbiana de gás e a matéria orgânica fermentada. Os sistemas aplicados à determinação da produção de gás fazem uso da incubação in vitro de amostras, mensurando o gás produzido com a utilização de seringas (por meio do deslocamento do êmbolo), por meio do aparato de vasos comunicantes, ou sensores com leitura computadorizada, o que permite a medição contínua e melhor acompanhamento do perfil de degradação por intermédio dos dados de taxa e extensão de fermentação. Entre os fatores que podem influenciar os resultados estão o baixo peso das amostras, variações causadas pela variabilidade do inoculo ruminal, a variação entre alimentos, e outros fatores como temperatura, pressão atmosférica, pH da amostra e conteúdo de ácidos orgânicos no alimento.