Relatório 1 - Atividade enzimática

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE – FURG 
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS – EQA 
CURSO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA 
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA II 
 
 
 
 
 
 
 
Análise Qualitativa e Quantitativa da Atividade 
Enzimática 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gabriel da Rosa Nunes (135433) 
Mariana Teixeira de Avila (137968) 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio Grande, 2023 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
As enzimas atuam como biocatalisadores, geralmente de origem proteica, acelerando 
a velocidade das reações químicas que ocorrem nos seres vivos, sem serem consumidas ou 
alteradas durante essas reações (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005). Devido ao formato de seu 
sítio ativo e aos resíduos de aminoácidos presentes nele, são altamente específicas e capazes de 
reconhecer e interagir seletivamente com seus substratos (FATIBELLO-FILHO; VIEIRA, 
2002). As enzimas são essenciais para os sistemas metabólicos de todos os organismos e podem 
ser obtidas de fontes vegetais, animais e microbiana (MONTEIRO; SILVA, 2009; 
ORLANDELLI et al., 2012; TEIXEIRA & MILAGRE, 2020). 
A polifenoloxidase (PFO) é uma enzima oxidorredutase que contém cobre como grupo 
prostético. Esta enzima está envolvida na oxidação de compostos fenólicos na presença de 
oxigênio molecular. Compostos difenólicos e monofenólicos são substâncias provenientes de 
produtos secundários contendo um grupo fenol (grupo hidroxila funcional ligado a um anel 
benzênico) e estão presentes em uma variedade de células. A PFO compreende duas enzimas 
diferentes, cuja diferença entre elas está relacionada à especificidade do substrato. O primeiro 
é denominado lacase, este não atua sobre os monofenóis e se limita à oxidação de orto e para-
difenóis. A segunda, denominada catecol oxidase, é responsável por alterações oxidativas nos 
tecidos (principalmente frutas e vegetais), catalisando a hidroxilação de monofenóis seguida 
pela oxidação do orto-difenol em orto-quinonas (MENDONÇA & GUERRA, 2003; PAZ, 
2010). 
Também no grupo das oxirredutases estão a peroxidase e a catalase. São responsáveis 
pela oxidação de substratos orgânicos e têm a função de degradar peróxidos (moléculas 
formadas naturalmente nos organismos durante o metabolismo oxidativo). Durante a reação da 
catalase, o peróxido de hidrogênio atua como aceptor de elétrons e é reduzido a água e oxigênio. 
O papel da peroxidase é acelerar a reação do peróxido de hidrogênio com um substrato 
específico formando um composto marrom, levando ao escurecimento enzimático em frutas e 
vegetais, bem como da PFO (APOLINARIO; SILVA; COSTA, 2019; NELSON & COX, 2011). 
Para quantificar a ação de uma enzima, a sua atividade enzimática deve ser medida. A 
atividade enzimática representa a velocidade com que a enzima converte substratos em 
produtos. O método mais adequado para medir essa conversão é baseado na espectrofotometria, 
e devido a especificidade de cada enzima, a atividade pode ser medida mesmo na presença de 
outras proteínas (BRACHT & ISHII-IWAMOTO, 2003). 
 
 
2. OBJETIVOS 
Observação qualitativa da atividade de enzimas presentes em células vegetais e 
quantificação da atividade enzimática da peroxidase em maçãs. 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
3.1 Material 
• Amostras de maçã e batata; 
• Solução de peróxido de hidrogênio 0,08% e 3%; 
• Tampão fosfato de sódio 5 mM pH 6,5; 
• Solução de guaiacol 1%; 
• Solução salina de 0,9%; 
• Béquer de vidro; 
• Placa de Petri; 
• Proveta de 250 mL; 
• Pipetas graduadas; 
• Funil de vidro; 
• Papel filtro; 
• Algodão; 
• Bico de Bunsen; 
• Balança semi-analítica; 
• Liquidificador; 
• Banho termostatizado; 
• Espectrofotômetro. 
 
3.2 Métodos 
3.2.1 Análise qualitativa 
Para o primeiro procedimento, uma maçã foi descascada e cortada em dois pedaços. 
Um pedaço foi exposto ao ambiente na placa de Petri, enquanto o segundo pedaço foi colocado 
em um béquer contendo água até que a amostra fosse coberta. A coloração das amostras em 
ambas as situações foi monitorada durante a aula prática. 
Para o segundo procedimento, 250 mL de água foram aquecidas até ebulição com 
auxílio de um bico de Bunsen. Enquanto isso, uma batata foi descascada e cortada em pequenos 
quadrados. Metade dos pedaços de batata foram adicionados em água fervente por 5 min para 
branqueamento (tratamento térmico). Os pedaços de batata tratados termicamente e os pedaços 
não tratados foram adicionados a dois béqueres distintos contendo 250 mL de peróxido de 
hidrogênio 3%. Foi utilizada uma proveta de 250 mL para medir o reagente. Ambas as reações 
foram observadas durante a aula prática. 
 
3.2.2 Análise Quantitativa 
Foram pesadas 50 g de maçã descascada e colocadas no liquidificador junto com 100 
mL de solução salina de 0,9%. Após agitação no liquidificador por 1 min, a solução foi filtrada 
com auxílio de funil, algodão e papel filtro. O filtrado (extrato enzimático) foi separado e 
mantido em banho de gelo para posterior quantificação da atividade enzimática. 
A quantificação da atividade enzimática de peroxidase foi realizada conforme a Tabela 
1. Após o preparo, a mistura reacional e o branco foram incubados em banho termostatizado a 
30 ºC por 10 min. 
TABELA 1 – Dados para a determinação de atividade enzimática de peroxidase 
Reagentes (mL) 
Tubos 
Amostra Branco 
Tampão fosfato de sódio 5 mM pH 6,5 1,5 1,5 
Guaiacol 1% 0,5 0,5 
Peróxido de hidrogênio 0,08% 1,0 1,0 
Água destilada 2,0 3,0 
Extrato enzimático* 1,0 – 
*adicionado por último 
Após as reações, a transmitância (T) do branco e dos compostos oxidativos presentes 
na amostra foi medida utilizado um ajustado no comprimento de onda de 470 nm usando um 
fator de diluição de 4× (1 mL de amostra/3 mL de água destilada) calculado conforme a Equação 
1. 
𝐹𝐷 =
𝑉𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎+𝑉á𝑔𝑢𝑎
𝑉𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
 (1) 
Onde: 
𝐹𝐷 é o fator de diluição (diluição do extrato bruto enzimático) 
𝑉𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 é o volume do extrato enzimático utilizado 
𝑉á𝑔𝑢𝑎 é o volume da água destilada utilizada 
 
Após a obtenção dos dados de transmitância do branco e da amostra, estes foram 
aplicados à Equação 2 para obter a sua absorbância (A). 
𝐴 = 2 − log⁡(𝑇) (2) 
Para eliminar interferências causadas por componentes presentes no meio reacional, o 
valor de absorbância obtido para a amostra teve o valor do branco subtraído conforme a 
Equação 3. 
𝐴𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎 = 𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐴𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜 (3) 
Onde: 
𝐴𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎 é a absorbância da reação com o branco descontado 
𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 é a absorbância inicial da reação 
𝐴𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜 é a absorbância do branco 
 
Após os cálculos e o valor da absortividade molar (𝜀) do tetraguaiacol obtido na 
literatura, foi possível obter a atividade enzimática do extrato de maçã (U/mL) de acordo com 
a Equação 4. 
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒⁡𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎⁡(𝑈 𝑚𝐿⁄ ) =
𝐴𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎⁡×⁡𝑉𝑟𝑒𝑎çã𝑜⁡×⁡𝐹𝐷⁡×⁡10
6
𝜀⁡×⁡𝑉𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎⁡×⁡𝑏⁡×⁡𝑡
 (4) 
Onde: 
𝑈 𝑚𝐿⁄ é a unidade de atividade da enzima por mL de extrato; sendo 𝑈 em 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑖𝑛⁄ 
𝐴𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎 é a absorbância corrigida da reação 
𝑉𝑟𝑒𝑎çã𝑜 é o volume total do tubo de reação (mL) 
𝑉𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 é o volume de extrato enzimático utilizado (mL) 
𝐹𝐷 é o fator de diluição (diluição do extrato bruto enzimático) 
106 é a conversão de mol para µmol 
𝜀 é absortividade molar do tetraguaiacol (26600 M-1.cm-1) 
𝑏 é o tamanho horizontal da cubeta (1 cm) 
𝑡 é o tempo de reação (min) 
 
Com o valor da atividade enzimática do extrato de maçã, foi possível obter-se a 
quantidade de produto liberado na reação enzimática (µmol) conforme a Equação 5. 
𝑃𝑟𝑒𝑎çã𝑜 =
𝐴𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎⁡×⁡𝑉𝑟𝑒𝑎çã𝑜⁡×⁡10
6
𝜀⁡×⁡𝑏⁡
 (5) 
Onde: 
𝑃𝑟𝑒𝑎çã𝑜 é a quantidade de produto liberado na reação enzimática (µmol)𝐴𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎 é a absorbância corrigida da reação 
𝑉𝑟𝑒𝑎çã𝑜 é o volume total do tubo de reação (mL) 
106 é a conversão de mol para µmol 
𝜀 é absortividade molar do tetraguaiacol (26600 M-1.cm-1) 
𝑏 é o tamanho horizontal da cubeta (1 cm) 
 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
4.1 Análise Qualitativa 
Com o primeiro procedimento, observou-se que a fatia de maçã colocada em placa de 
Petri exposta ao oxigênio ambiente sofreu escurecimento enzimático mais rápido em 
comparação com a fatia imersa em água (Figura 1). O escurecimento enzimático ocorre por 
meio de uma reação catalisada pela enzima PFO presente na maçã. Ao entrar em contato com 
o oxigênio, a enzima oxida os compostos fenólicos da fruta para gerar quinona como produto 
inicial. A quinona se condensa formando pigmentos escuros, denominados malanina. Essas 
reações ocorrem nos tecidos vegetais quando as células se rompem e a reação não é controlada. 
Figura 1 – Atividade enzimática da PFO em maçãs submetidas a diferentes situações 
 
(a) maçã exposta ao oxigênio; (b) maçã imersa em água 
 
No segundo procedimento foi observada a atividade da catalase contida na batata. Ao 
adicionar a batata que não foram submetidas ao tratamento térmico ao peróxido de hidrogênio, 
a enzima aumentou a velocidade da reação química, de modo que o peróxido de hidrogênio se 
decompôs em água e oxigênio mais rapidamente, sem se tornar parte do sistema reacional. Já a 
batata que passou pela etapa de branqueamento não sofreu essa reação quando em contato com 
o peróxido de hidrogênio. Isto se deve à desnaturação das proteínas presentes na batata durante 
o tratamento térmico, resultando na inativação enzimática. As duas situações podem ser 
observadas na Figura 2. 
Figura 2 – Atividade da enzima catalase na batata em contato com o peróxido de hidrogênio 
 
(a) batata sem tratamento térmico; (b) batata branqueada 
 
4.2 Análise Quantitativa 
Os valores de absorbância foram calculados utilizando a Equação 2 com base na 
transmitância da amostra e do branco obtidos espectrofotometricamente. Posteriormente, o 
valor de absorbância da amostra foi corrigido com branco conforme Equação 3. Portanto, 
realizando os cálculos, os valores de transmitância e absorbância estão listados na Tabela 2. 
Tabela 2 – Dados de transmitância e absorbância da amostra e branco 
Tubo Transmitância (%) Absorbância Absorbância corrigida 
Branco 98,5 0,006563 − 
Amostra 26,0 0,5850 0,5784 
 
Posteriormente o fator de diluição foi calculado de acordo com a Equação 1 e com 
todos os dados obtidos foi possível calcular a atividade enzimática do extrato de maçã conforme 
a Equação 4. 
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒⁡𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 =
0,5784 × ⁡0,06⁡𝐿⁡ × ⁡4⁡ × ⁡106
26600⁡ 𝐿 𝑚𝑜𝑙⁄ ⁡× ⁡1⁡𝑚𝐿⁡ × ⁡1⁡𝑐𝑚⁡ × ⁡10⁡𝑚𝑖𝑛
 
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒⁡𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 = 0,5218⁡ 𝑈 𝑚𝐿⁄ 
 
 
A quantidade de produto liberado na reação enzimática foi obtida através da Equação 
5. 
𝑃𝑟𝑒𝑎çã𝑜 =
0,5784 × ⁡0,06⁡𝐿⁡ × ⁡106
26600⁡ 𝐿 𝑚𝑜𝑙⁄ ⁡× ⁡1⁡𝑐𝑚⁡
 
𝑃𝑟𝑒𝑎çã𝑜 = 1,3046⁡𝜇𝑚𝑜𝑙 
 
Assim, o extrato enzimático de maçã apresentou atividade enzimática de 0,5218 
U/mL (atividade enzimática contida em 1 mL da solução enzimática) e a quantidade de 
produto liberado na reação enzimática foi de 1,3046 µmol. 
 
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
As análises qualitativas permitiram observar as reações de oxidorredução da 
polifenoloxidase e da catalase, que levam ao escurecimento enzimático e a peroxidação, 
respectivamente. A análise quantitativa mostrou que a atividade enzimática do extrato de maçã 
foi de 0,5218 U/mL, e a quantidade de produto liberado na reação enzimática foi de 1,3046 
µmol. Portanto, pode-se concluir que as enzimas são altamente específicas em relação ao 
substrato e que fatores como concentração do substrato e da própria enzima estão relacionados 
a ocorrência e velocidade dessas reações catalíticas. Além disso, podem ser observadas 
propriedades semelhantes das enzimas às proteínas, como a desnaturação devido a de altas 
temperaturas, como na etapa de branqueamento. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
APOLINARIO, G.S.; SILVA, R.G.G.; COSTA, I.R. Metabolismo celular do peróxido de 
hidrogênio: visualização da ação da catalase a níveis microscópicos. Encontros Universitários 
da UFC, Fortaleza, v. 4, n. 4., 2019. 
 
BRACHT, A.; ISHII-IWAMOTO, E.L. Métodos de Laboratório em Bioquímica. 1 ª ed., 
Barueri: Manole, 2003. 
 
FATIBELLO-FILHO, O.; VIEIRA, I.C. Uso analítico de tecidos e de extratos brutos vegetais 
como fonte enzimática. Química Nova, v. 25, n. 3, p. 455-464, 2002. 
 
MENDONÇA, S.C.; GUERRA, N.B. Métodos físicos e químicos empregados no controle do 
escurecimento enzimático de vegetais. Boletim SBCTA, Campinas, v. 37, n. 2, p. 113-116, 
2003. 
 
MONTEIRO, V.N.; SILVA, R.N. Aplicações industriais da biotecnologia enzimática. Revista 
Processos Químicos, v. 3, n. 5, p. 9-23, 2009. 
 
NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de bioquímica. 5ª ed., Porto Alegre: Artmed, 2011. 
 
ORLANDELLI, R.C.; SPECIAN, V.; FELBER, A.C.; PAMPHILE, J.A. Enzimas de interesse 
industrial: produção por fungos e aplicações. SaBios: Revista de Saúde e Biologia, v. 7, n. 3, 
p. 97-109, 2012. 
 
PAZ, J.C.S.N. Caracterização bioquímica da polifenoloxidase e da peroxidase de ameixa 
rubimel, polpa de cacau e estudo do efeito de agentes anti-escurecimento. Campinas, 2010. 
Tese (Doutorado em Ciências de Alimentos) - Faculdade de Engenharia de Alimentos, 
Universidade Estadual de Campinas. 
 
TEIXEIRA, I.S.; MILAGRE, C.D.F. Evolução dirigida de enzimas: pequenas modificações, 
melhores biocatalisadores. Química Nova, vol. 43, n. 6, p. 773-786, 2020. 
 
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Metabolismo microbiano. Em: Microbiologia. 8 
ed. Porto Alegre: Artmed, cap. 5, p. 111-121, 2005.