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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE – FURG 
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS – EQA 
CURSO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA 
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Extração da enzima invertase de levedura 
Saccharomyces cerevisiae: influência do pH e da 
temperatura na atividade enzimática 
 
 
 
 
 
Gabriel da Rosa Nunes (135433) 
Mariana Teixeira de Avila (137968) 
 
 
 
 
 
 
 
Rio Grande, 2023 
 
 
 
 
RESUMO 
A atividade enzimática está relacionada com a velocidade com que a enzima converte substratos 
em produtos e é medida afim de quantificar a ação de uma enzima. A invertase (E.C. 3.4.2.36) 
é uma enzima que catalisa a hidrólise de sacarose em glicose e frutose. A atividade enzimática 
é influenciada por fatores como pH e temperatura, uma vez que estes impactam na estrutura e 
função das enzimas. A hidrólise do substrato resulta na produção de açúcares redutores totais, 
representados geralmente por glicose. Assim, a quantificação pode ser realizada por 
espectrofotometria, consistindo na determinação do produto da redução de 3,5-DNS por 
açúcares redutores. Diante disso, o objetivo foi avaliar a influência do pH e da temperatura na 
atividade enzimática de invertase extraída da levedura Saccharomyces cerevisiae. A extração 
da invertase foi realizada utilizando fermento comercial e o extrato foi diluído 200 vezes. Para 
o ensaio de influência do pH na atividade, foi fixada a temperatura ambiente de 22 ºC e 
analisados diferentes pHs (3,0; 5,0; 6,5; 8,0). Para o ensaio de influência da temperatura, foi 
fixado um pH de 6,5 e analisadas diferentes temperaturas (22, 40, 60 e 90 ºC). Foi construída 
uma curva padrão de açúcares redutores a partir de diferences diluições da solução de glicose 
1,0 mg/mL. Todas as amostras passaram por reação com 3,5-DNS e foi realizada a leitura da 
transmitância em espectrofotômetro ajustado em 540 nm. A curva padrão apresentou equação 
da reta 𝑦 = 1,8008𝑥 − 0,132 e coeficiente de correlação 𝑅² = 0,9972. As concentrações de 
glicose nas amostras foram determinadas através da eq. da reta para posterior cálculo da 
atividade enzimática. Os resultados de pH apresentaram duas faixas distintas, 3,0 e 6,5. A 
melhor temperatura obtida foi de 60ºC. Se faz necessário avaliar uma maior faixa de pH e 
temperatura, bem como estudos de melhoria de estabilidade. 
 
 
Palavras-chave: 3,5-DNS; açúcares redutores totais; hidrolase 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
A atividade enzimática, que se refere à velocidade com que a enzima converte 
substratos em produtos, é medida para quantificar a ação de uma enzima. A unidade (U) de 
medida é a quantidade de enzima que produz 1 µmol de produto em 1 minuto. Para determinar 
essa atividade, um substrato específico é utilizado e os produtos da reação são quantificados. A 
taxa de reação é inferida pela variação na concentração de substrato ou produto ao longo do 
tempo. A espectrofotometria é o método mais adequado para medir essa conversão, e a atividade 
pode ser medida mesmo na presença de outras proteínas devido à especificidade de cada enzima 
(BRACHT; ISHII-IWAMOTO, 2003; STRYER; BERG; TYMOCZKO, 2002). 
A invertase (E.C. 3.2.1.26), também conhecida como sacarase ou β-frutofuranosidase, 
é uma enzima que catalisa a hidrólise da ligação α-1,4-glicosídica entre D-glicose e D-frutose 
da sacarose, transferindo o resíduo αβ-D-O-frutofuranosídeo para um substrato aceptor. Assim, 
a invertase tem atividade hidrolisante e de transferência de grupos, sendo esta última mais 
evidente em alta concentração de sacarose. A enzima também hidrolisa outros oligossacarídeos, 
como rafinose e estaquiose. As invertases de interesse comercial são geralmente derivadas de 
cepas de Saccharomyces sp. (KOTWAL; SHANKAR, 2009; MANOOCHEHRI et al., 2020). 
A atividade enzimática é altamente influenciada pelo pH e temperatura, visto que esses 
fatores impactam a estrutura e função das enzimas. Cada enzima possui um pH ótimo onde sua 
atividade é máxima, já que mudanças de pH podem alterar a carga das moléculas de 
aminoácidos na enzima, afetando sua estrutura tridimensional. Se o pH estiver muito abaixo ou 
acima do pH ótimo, a atividade enzimática pode diminuir significativamente ou até mesmo 
cessar. A temperatura também é crucial, pois seu aumento geralmente acelera a reação 
enzimática devido ao aumento da energia cinética e frequência de colisão das moléculas. 
Contudo, acima de uma determinada temperatura, a atividade enzimática começa a diminuir 
devido a desnaturação da enzima causada pelo calor, resultando na perda de sua estrutura 
tridimensional (NELSON; COX, 2011). 
A hidrólise resulta na produção de açúcares redutores totais (ART), que são geralmente 
representados como glicose. Esses açúcares podem ser quantificados por meio de um método 
espectrofotométrico. O método consiste na reação entre o açúcar e o ácido 3,5-dinitrossalisílico 
(DNS), onde o DNS é reduzido em meio alcalino e passa da coloração amarela para a laranja-
avermelhada gerando um composto estável chamado 3-amino 5-nitrosalicílico (MILLER, 
1959). 
 
 
 
2. OBJETIVOS 
Avaliação da influência do pH e da temperatura na atividade enzimática de invertase 
extraída da levedura Saccharomyces cerevisiae. 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
3.1 Material 
• Fermento comercial; 
• Solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,15 M; 
• Solução de glicose 1,0 mg/mL; 
• Reagente 3,5-DNS; 
• Solução de sacarose 0,3 M em soluções tampão 5 mM (pH 3,0; 5,0; 6,5; 8,0); 
• Tubos de ensaio; 
• Pipetas graduadas; 
• Frasco Erlenmeyer 500 mL; 
• Banho de gelo; 
• Balança semi-analítica; 
• Banho termostatizado; 
• Agitador shaker; 
• Espectrofotômetro. 
 
3.2 Métodos 
3.2.1 Curva padrão de açúcares redutores 
 Para a construção da curva padrão de açucares redutores foi utilizada a solução de 
glicose 1 mg/mL e todos os tubos foram preparados conforme a Tabela 1. Foram pipetadas 
alíquotas dessa solução e água, afim de obter diferentes concentrações de glicose, em tubos de 
ensaio. Após a homogeneização das soluções, o reagente 3,5-DNS foi adicionado aos tubos e 
levado em banho de água fervente por 5 min. Após parar a reação resfriando os tubos em água 
corrente seguido por banho de gelo, foi adicionado aos tubos o volume especificado de água 
destilada. 
 
 
 
 
 
 
 
TABELA 1 – Dados para a construção da curva padrão de açúcares redutores 
Tubos 0 1 2 3 4 5 
Solução estoque de glicose (mL) 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 
Água destilada (mL) 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0 
3,5-DNS (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 
Banho à 100 ºC (min) 5 5 5 5 5 5 
Esfriar e adicionar H2O (mL) 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 
 
Com as soluções preparadas, os tubos foram agitados e foi realizada a leitura da 
transmitância (T) no espectrofotômetro ajustado para 540 nm de acordo com o método. Com a 
transmitância, foi possível calcular a absorbância (Abs) de cada amostra pela Equação 1. 
𝐴𝑏𝑠 = 2 − log⁡(𝑇) (1) 
Afim de remover alguma interferência causada por componentes presentes no meio 
reacional, a amostra 0 foi utilizada como branco, logo os demais valores de absorbância obtidos 
tiveram o valor do branco subtraído de acordo com a Equação 2. 
𝐴𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎 = 𝐴𝑛 − 𝐴0 (2) 
Onde: 
𝐴𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎 é a absorbância com o valor do branco descontado 
𝐴𝑛 é a absorbância da amostra; sendo 𝑛 o correspondente da amostra 
𝐴0 é a absorbância do branco 
 
As diferentes concentrações de glicose para a curva padrão foram obtidas com base na 
Equação 3. 
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2 (3) 
Onde: 
𝐶1 é a concentração da solução padrão de glicose 
𝑉1 é o volume utilizado da solução padrão 
𝐶2 é a concentração de glicose na amostra 
𝑉2 é o volume da amostra 
 
Posteriormente, com o auxílio da planilha eletrônicafoi obtido o gráfico da curva 
padrão de glicose que relaciona os dados de absorbância corrigida com as concentrações de 
glicose nas amostras afim de obter a equação da reta e o coeficiente de correlação (R²). 
 
 
 
3.2.2 Extração da invertase de S. cerevisiae 
Para a extração da enzima invertase da levedura S. cerevisiae, foram pesadas 50 g do 
fermento comercial e adicionadas em 250 mL de solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 
0,15 M em um frasco Erlenmeyer de 500 mL. O frasco foi vedado e levado em banho à 37°C 
para autólise (ruptura da parede celular), por 24 h com agitação em shaker. Após incubação, a 
solução passou por centrifugação e o sobrenadante (extrato enzimático) foi coletado. O extrato 
enzimático foi diluído 200× (𝐹𝐷 = 200) e permaneceu em banho de gelo até a realização dos 
ensaios afim de evitar a desnaturação da enzima. 
 
3.2.3 Influência do pH na atividade enzimática 
Em diferentes tubos de ensaio, foi adicionado 1 mL de solução do substrato sacarose 
0,3 M com diferentes pH (3,0; 5,0; 6,5; 8,0). Para a reação enzimática, foi adicionado 1 mL do 
extrato enzimático em cada tubo, estes foram misturados e mantidos em temperatura ambiente 
(22 ºC) por 10 min. O ensaio do branco foi realizado em pH 5,0 no qual o substrato enzimático 
foi substituído por 1 mL de água destilada. Após o tempo de reação, 1 mL de 3,5-DNS foi 
adicionado a cada tubo e estes foram colocados em banho fervente por 5 min. Posteriormente, 
os tubos foram resfriados em água corrente e banho de gelo, seguido por adição de 8 mL de 
água destilada. Por fim, foi realizada a leitura da transmitância (T) das soluções no 
espectrofotômetro ajustado para comprimento de onda de 540 nm. 
 
3.2.4 Influência da temperatura na atividade enzimática 
Foi adicionado 1 mL de solução do substrato sacarose 0,3 M pH 6,5 em diferentes 
tubos de ensaio. Para a reação enzimática, foi adicionado 1 mL do extrato enzimático em cada 
tubo, estes foram misturados e mantidos em diferentes temperaturas (40, 60 e 90 ºC) por 10 
min. Foi utilizado o mesmo branco do experimento do ensaio de influência do pH. Após o 
tempo de reação, foi adicionado 1 mL de 3,5-DNS em cada tubo e estes foram levados em 
banho fervente por 5 min. Posteriormente, os tubos foram resfriados em água corrente e banho 
de gelo, seguido por adição de 8 mL de água destilada. Assim, foi realizada a leitura da 
transmitância (T) das soluções no espectrofotômetro ajustado em 540 nm. 
 
3.2.5 Determinação da atividade enzimática 
Após as reações, o branco foi utilizado para calibrar o espectrofotômetro e 
posteriormente, a transmitância (T) dos compostos presentes nas soluções foi medida. Com os 
 
 
valores de transmitância, foi possível obter a absorbância de cada solução através da Equação 
1. 
Após os cálculos, os valores de absorbância foram colocados em 𝑦 na equação da reta 
gerada pela curva padrão de açúcares redutores para obtenção das concentrações (𝑥). Assim, 
foi possível obter a atividade enzimática (U/mL) de cada solução de acordo com a Equação 4. 
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒⁡𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎⁡(𝑈 𝑚𝐿⁄ ) =
(
[𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒]
𝑀𝑀𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒
)×⁡𝑉𝑟𝑒𝑎çã𝑜⁡×⁡𝐹𝐷⁡×⁡10
6
𝑉𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎⁡×⁡𝑡
 (4) 
Onde: 
𝑈 𝑚𝐿⁄ é a unidade de atividade da enzima por mL de extrato; sendo 𝑈 em 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑖𝑛⁄ 
[𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒] é o fator de concentração da curva padrão de glicose (g/L) 
𝑀𝑀𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 é a massa molar de glicose (180 g/mol) 
𝑉𝑟𝑒𝑎çã𝑜 é o volume total do tubo de reação (0,002 L) 
𝑉𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 é o volume de extrato enzimático utilizado (mL) 
𝐹𝐷 é o fator de diluição do extrato bruto enzimático (medida adimensional) 
106 é a conversão de mol para µmol 
𝑡 é o tempo de reação (min) 
 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
4.1 Curva padrão de açúcares redutores 
A partir da transmitância obtida para cada amostra por espectrofotometria, os valores 
de absorbância foram calculados pela Equação 1. Posteriormente as absorbâncias foram 
corrigidas com o branco conforme a Equação 2. As diferentes concentrações de glicose das 
amostras para a curva padrão foram calculadas utilizando a Equação 3 e estão apresentadas na 
Tabela 2. 
TABELA 2 – Concentração de glicose nas amostras da curva padrão 
Amostra Concentração de glicose (mg/mL) 
Tubo 0 (branco) 0 
Tubo 1 0,2 
Tubo 2 0,4 
Tubo 3 0,6 
Tubo 4 0,8 
Tubo 5 1,0 
 
Com os valores de absorbância corrigida e concentração das amostras, foi obtido o 
gráfico da curva padrão de açúcares redutores que está apresentado na Figura 1. 
 
 
FIGURA 1 – Curva padrão de açúcares redutores 
 
Com a curva padrão de açúcares redutores foi obtida a equação da reta 𝑦 = 1,808𝑥 −
0,132 e o coeficiente de correlação 𝑅2 = 0,9972. A equação da reta foi utilizada para calcular 
os fatores de concentração de glicose das diferentes soluções dos ensaios de influência do pH e 
da temperatura. 
 
4.2 Determinação da atividade enzimática 
Os valores de absorbância foram calculados utilizando a Equação 2 com base na 
transmitância da amostra obtidas espectrofotometricamente. Neste caso, os valores de 
absorbância não precisaram de correção com o branco pois este foi utilizado para a calibração 
do equipamento. Portanto, realizando os cálculos, os valores de transmitância e absorbância das 
soluções utilizadas nos ensaios de influência do pH e da temperatura estão listados na Tabela 3. 
TABELA 3 – Dados de transmitância e absorbância das amostras e branco 
Ensaio de influência do pH 
Amostra Transmitância (%) Absorbância 
Tubo 0 (branco) 100 0 
Tubo 1 (pH 3,0) 40,4 0,3936 
Tubo 2 (pH 5,0) 46,3 0,3344 
Tubo 3 (pH 6,5) 44,0 0,3565 
Tubo 4 (pH 8,0) 50,01 0,3009 
 
 
 
 
 
 
TABELA 3 – Dados de transmitância e absorbância das amostras e branco 
Ensaio de influência da temperatura 
Amostra Transmitância (%) Absorbância 
Tubo 0 (branco) 100 0 
Tubo 1 (22 ºC) 44,0 0,3565 
Tubo 2 (40 ºC) 06,1 1,2146 
Tubo 3 (60 ºC) 0,08 3,0969 
Tubo 4 (90 ºC) 81,8 0,0872 
 
Posteriormente, os valores de absorbância foram inseridos na equação da reta para 
obtenção do fator de concentração de glicose de cada solução. Estes foram obtidos em mg/mL 
e convertidos para g/L para o cálculo da atividade enzimática (U/mL) que foi realizado de 
acordo com a Equação 4. Os valores obtidos para ambos os cálculos estão apresentados na 
Tabela 4. 
TABELA 4 – Dados de concentração de glicose e atividade enzimática 
Ensaio de influência do pH 
Amostra 
Fator de concentração de 
glicose (g/L) 
Atividade enzimática 
(U/mL) 
Tubo 1 (pH 3,0) 0,2918 64,84 
Tubo 2 (pH 5,0) 0,2589 57,53 
Tubo 3 (pH 6,5) 0,2712 60,26 
Tubo 4 (pH 8,0) 0,2403 53,40 
Ensaio de influência da temperatura 
Amostra 
Fator de concentração de 
glicose (g/L) 
Atividade enzimática 
(U/mL) 
Tubo 1 (22 ºC) 0,2712 60,26 
Tubo 2 (40 ºC) 0,7477 166,15 
Tubo 3 (60 ºC) 1,7930 398,44 
Tubo 4 (90 ºC) 0,1217 27,04 
 
Com os valores de atividade enzimática de cada solução foi possível obter os gráficos 
de pH versus atividade enzimática (U/mL) e temperatura (ºC) versus atividade enzimática 
(U/mL) e estes estão apresentados nas Figuras 2 e 3, respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 2 – Gráfico pH versus atividade enzimática 
 
FIGURA 3 – Gráfico temperatura versus atividade enzimática 
 
A Figura 2 mostra que os resultados de pH máximo correspondente ao “pH ótimo” de 
hidrólise à 22 ºC revelaram duas faixas de pH distintos, 3,0 e 6,5. A atividade catalítica de uma 
reação enzimática é geralmente alcançada dentro de um intervalo estreito de pH, com a maioria 
das enzimas tendo um pH ótimo entre 4,5 e 8,0 (BOBBIO; BOBBIO,1995). Almeida et al. 
(2005) sugerem que, especificamente, a invertase de levedura apresenta pH ótimo no intervalo 
de 3,5 e 6,0. 
Bora et al. (2005) obtiveram o pH ótimo para invertase igual a 5,0. Amaya-Delgado et 
al (2005) analisaram a influência do pH na faixa de 5,0 a 7,0 onde a maior atividade enzimática 
foiobtida em pH de 5,5. Goulart, Adalberto e Monti (2003) obtiveram duas faixas de pH ótimo, 
 
 
com máximos em 6,0 e 9,0, no entanto, a invertase utilizada em seu trabalho foi extraída do 
fungo Rhizopus sp. 
O pH influencia significativamente a atividade e estabilidade das enzimas. A carga da 
enzima, influenciada pelo pH, afeta a catálise enzimática, pois os aminoácidos que compõe a 
estrutura da proteína possuem grupos laterais básicos, neutros ou ácidos, assim a enzima pode 
ser carregada positiva ou negativamente. Apenas um estado específico de ionização permite 
que a enzima esteja catalíticamente ativa. A taxa de reação aumenta com o pH até um valor 
ótimo, após o qual diminui devido à desnaturação ou estados de ionização inadequados 
(SEGEL, 1979; DIXON; WEBB, 1979). 
A Figura 3 mostra que na temperatura de 60 ºC a invertase apresentou maior atividade 
enzimática entre as temperaturas analisadas, sendo esse o máximo correspondente à 
“temperatura ótima”. No entanto, um aumento além dessa temperatura levou a uma rápida 
diminuição da atividade enzimática, provavelmente devido à desnaturação térmica da enzima. 
No entanto, não existem dados precisos sobre a temperatura ótima de atividade desta enzima. 
Em alguns casos, utiliza-se a temperatura de 55 ºC para soluções diluídas de sacarose e 65 a 70 
ºC para soluções concentradas (UHLIG, 1998). 
Amaya-Delgado et al. (2005) também observaram a influência da temperatura na 
atividade da invertase na hidrólise de sacarose, apresentando maior atividade enzimática na 
faixa de 55 a 65 ºC seguida por uma queda acentuada a partir de 70 ºC. Enquanto Draetta (1971) 
destaca que a temperatura ótima depende do grau de purificação da enzima e da concentração 
de substrato, tendo encontrado valores entre 23 e 55 ºC. 
Wiseman e Woodward (1975) sugerem que a estabilidade térmica da invertase pode 
ser atribuída à sua estrutura terciária, que inclui interações carboidrato-proteína e ligações 
cruzadas na cadeia polipeptídica. Bailey e Ollis (1986) acrescentam que a estabilidade térmica 
de uma enzima é influenciada por fatores como pH, concentração de substrato, presença de 
estabilizadores e se a enzima está em sua forma livre ou imobilizada. 
 
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS 
Este estudo destaca a importância da enzima invertase, que é amplamente utilizada 
para o processamento de carboidratos. Assim, uma boa atividade enzimática é crucial para 
aplicações industriais. A melhor temperatura de hidrólise da invertase foi de 60 ºC, e os pHs 
ideais obtidos foram 3,0 e 6,5. O estudo sugere a necessidade de explorar uma gama maior de 
 
 
pH e temperatura. Além disso, a concentração de substrato e a imobilização da enzima são áreas 
importantes a serem estudadas futuramente, visando melhorar a estabilidade da enzima. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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