Resumo Bromatologia - 2 prova

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DETERMINAÇÃO DE MINERAIS NOS ALIMENTOS
Cinzas totais X compostos minerais:
Antes de fazer uma análise elementar, deve-se fazer uma análise de cinzas. Cinza é o resíduo inorgânico que permanece após a queima da matéria orgânica, que é transformada em CO2, H2O e NO2, chamado resíduo mineral fixo (RMF).
As cinzas não apresentam exatamente a mesma composição da matéria mineral originalmente presente no alimento, devido a perdas por volatilização de alguns minerais e interações entre constituintes da amostra. O mercúrio (Hg), por exemplo, se volatiliza a temperaturas entre 100 a 550 °C, o Cd se volatiliza a temperaturas maiores que 450 °C, e Zn e Pb se volatilizam a temperaturas entre 300 a 1000 °C.
Basicamente, as cinzas são constituídas de grandes quantidades de Na, K, Ca e Mg, pequenas quantidades (microminerais) de Al, Fe, Cu, Mn e Zn e quantidades traços de As, I, F e outros. Os elementos se encontram nas cinzas nas formas de óxidos, sulfatos, fosfatos, silicatos e cloretos, dependendo das condições de incineração e da composição do alimento.
Classificação dos minerais:
Os minerais são classificados de acordo com o teor percentual no corpo humano. Dessa forma, têm-se os macrominerais, se o teor for maior ou igual a 0,005%, como Ca, Na, K, Mg e Cl, e os microminerais, se o teor for menor que 0,005%, como Fe, Zn, Cu e Mn. O Fe está presente em pequenas quantidades no organismo, embora seja um mineral muito demandado. O fígado, por ser responsável pela hemocaterese, funciona como um depósito de Fe no organismo.
Tem-se, também, os elementos traços, que são encontrados em quantidades ainda menores, como é o caso do Li e Se. Muitos dos microminerais e elementos traços são cofatores enzimáticos, ligando-se à enzima, num local diferente do sítio ativo, capacitando o bom funcionamento da enzima.
O teor de minerais é variável nos alimentos, dependendo do tipo de solo, cultivo e agrotóxicos para produtos vegetais, ração e composição da ração para produtos de origem animal e dos processos tecnológicos para produtos industrializados.
Importância da determinação das cinzas:
A determinação das cinzas permite determinar a composição centesimal de um alimento, que deve ser descrita em seu rótulo, e é a primeira etapa para análise de um elemento específico, uma vez que as cinzas determina a composição mineral bruta e, a partir dela, é possível determinar a composição elementar.
É interessante para indústrias, pois, muitas vezes, o teor de cinzas influencia do índice de refinação de farinhas e açúcares, uma vez que teores elevados de cinzas, por exemplo, dificultam cristalização e descoloração de açúcares.
Permite a verificação de adulterações. Utilizando-se a solubilidade, é possível determinar se uma cinza é solúvel ou insolúvel em água, permitindo estimar o conteúdo de frutas em geléias e doces, por exemplo, já que as cinzas de frutas são solúveis em água. Pode-se observar, também, a alcalinidade das cinzas, já que cinzas de vegetais e frutas, por exemplo, geralmente são alcalinas, pois, nos vegetais, é possível encontrar maiores quantidades de ácido cítrico e, quando as cinzas forem formadas, haverá formação de citrato, que é um ácido fraco, que gera uma base forte. Já cinzas de carnes e certos cereais são ácidas, pois, nesse caso, haverá formação de sulfatos, fosfatos e nitratos, que geram ácidos mais fortes. Assim, a partir desse parâmetro, é possível observar a quantidade de produto animal e vegetal que compõe um alimento. Pode-se também observar a solubilidade em ácido. Um alto teor de cinzas insolúveis em ácido indica presença de matéria mineral, como areia.
Importância da análise elementar:
A análise elementar é importante para a determinação de elementos minerais individuais da cinza, como elementos indispensáveis para o metabolismo normal e elementos essenciais da dieta. Isso pode ser importante, por exemplo, na análise de um alimento para fins especiais.
Permite, também, a quantificação do elemento, pois os minerais apresentam zona manejável estreita, ou seja, faixa terapêutica e faixa tóxica próximas.
Além disso, permite determinar a quantidade de elementos que não apresentam nenhuma função conhecida ou podem ser prejudiciais à saúde, como Pb e Hg, que são decorrentes do uso de agrotóxicos ou resíduos de processos industriais, e permite identificar os aspectos tecnológicos do processamento de alimentos.
Métodos para determinação de cinzas e elementos minerais:
Para a determinação de cinzas (totais, alcalinidade, solúveis e insolúveis), pode-se utilizar o método de queima seca ou de queima úmida (permite a utilização de temperaturas mais baixas, já que alguns metais são voláteis). Para a análise elementar, pode-se utilizar a titulometria, a espectrofotometria (ou colorimetria, onde complexa-se o mineral, formando uma substância colorida e faz-se várias concentrações, criando-se uma curva de calibração que permite determinar a concentração de um elemento numa amostra), a turbidimetria, a emissão de chama (alguns metais, principalmente os metais alcalinos e alcalinos terrosos, quando queimados geram uma coloração específica, devido ao nível de transição do elétron, sendo possível medir a intensidade dessa cor e, a partir disso, determinar a concentração do elemento na amostra), a absorção atômica ou o ICP-OES (Espectrometria de emissão ótica indutivamente acoplada ao plasma).
Queima seca:
O método de queima seca é normalizado pela AOAC para certos produtos, como frutas e grãos, e baseia-se na carbonização da amostra em chama de gás e posterior incineração em mufla, a 525-600 °C, até completa queima da matéria orgânica. O que sobra é pesado e, então, mede-se a diferença entre o peso inicial e o peso após a incineração. A carbonização prévia em bico de gás evita a formação de fuligem no interior da mufla simples e reduz o tempo de incineração. Uma alternativa é o uso de mufla com sistema de exaustão.
A quantidade de amostra utilizada é de 5 a 10 g, dependendo do conteúdo de cinzas. O tempo de incineração demora cerca de 3-5 h, até se obter um resíduo completamente branco ou cinza, dependendo dos minerais presentes. A temperatura de secagem varia de 525 a 600 °C, dependendo do produto.
Podem-se ter alguns problemas de interferências nos resultados, como perdas, já que as cinzas são muito leves e podem ser facilmente projetadas para fora do cadinho, ou elementos que volatilizam, como Hg e Pb, ganhos, no caso de cinzas higroscópicas, como as de frutas, e reações entre os metais e os componentes da amostra ou entre amostra e material do cadinho.
Preparo de amostras:
Em caso de amostras líquidas, deve-se, primeiramente, secá-las em estufa, banho-maria e chapa aquecedora. Substâncias com elevado teor de substâncias voláteis devem ser aquecidas lentamente para fumegar sem pegar fogo, evitando-se perdas por volatilização. Substâncias ricas em açúcares devem sofrer adição de azeite de oliva ou vaselina, para evitar perdas por borbulhamento. Substâncias ricas em amido e proteína devem sofrer calcinação demorada. Substâncias ricas em gorduras devem ser aquecidas vagarosamente, evitando-se o excesso de chama.
Escolha do cadinho:
Para a escolha do cadinho, deve-se levar em consideração o custo, a estabilidade térmica (trinca e peso constante), a interação com a amostra (alimento) e a resistência (ácidos e bases).
O cadinho de quartzo é pouco resistente a álcalis, apresenta resistência térmica a 1100 °C e a limpeza é feita com HCl. O cadinho de porcelana é sensível a álcalis, racha com mudanças bruscas de temperatura, apresenta resistência térmica a 1200 °C, a limpeza é feita com HCl, e apresenta custo baixo. O cadinho de aço pode ser utilizado para amostras grandes, é resistente a ácidos e álcalis e à limpeza mecânica, apresenta baixo custo, e é passível de contaminação (Cr e Ni). O cadinho de platina apresenta resistência térmica a 1773 °C, é quimicamente inerte, a limpeza é feita por fervura com água ou ácidos e apresenta custo muito elevado. O cadinho de liga ouro-platina (90:10) apresenta resistência térmica a 1100°C e seu custo é muito elevado.
Procedimento – determinação do resíduo mineral fixo – Cinzas totais:
Primeiramente, o cadinho é identificado e colocado na mufla a 500-550 °C, durante 1 h, depois, resfria-o no dessecador, por 30 minutos e, depois, pesa-o, retornando ao dessecador e pesando novamente, até que se obtenha peso constante (Mcadinho), obtendo-se o cadinho preparado. Após isso, pesa-se a amostra, coloca-a no cadinho preparado e pesa o sistema cadinho preparado + amostra (Mamostra). Esse sistema é submetido à carbonização inicial na chama, obtendo-se o cadinho preparado + amostra carbonizada, que é colocado na mufla a 500-600 °C, para, então, ser incinerado, até que se obtenham cinzas brancas ou acinzentadas. Depois, coloca-se o sistema no dessecador, por 30 minutos, e realiza-se a pesagem, retornando eu dessecador e pesando novamente, até que se obtenha peso constante (Mfinal).
Queima úmida:
É um método normalizado pela AOAC para a análise de metais em alguns produtos. Consiste na digestão da matéria orgânica, com um ou mais ácidos, geralmente ácido nítrico e ácido sulfúrico, em altas temperaturas. Indicada na preparação da amostra para análise de um elemento específico, principalmente elementos traços e de metais tóxicos, e minerais muito voláteis, já que, nesse caso, os minerais são solubilizados sem volatilização, reduzindo-se a perda que poderia ser provocada pela queima seca.
Para o preparo de amostras ricas em gorduras e açúcares, utiliza-se ácido sulfúrico até embeber a amostra, e uma pequena quantidade de ácido nítrico, com aquecimento entre os dois, para evitar perdas por borbulhamento. Os ácidos normalmente utilizados para decompor a amostra são: ácido sulfúrico, que não é um oxidante muito forte e, portanto, o tempo necessário para a análise será um pouco maior; ácido nítrico, que é um bom oxidante, entretanto, pode evaporar antes do final da oxidação, e pode levar a formação de óxidos insolúveis; ácido sulfúrico + ácido nítrico, que é a mais utilizada, aproveitando-se as vantagens de cada um dos componentes da mistura; ácido perclórico, que é um ótimo oxidante, entretanto, em temperaturas elevadas torna-se explosivo, logo, seu uso requer experiência.
Procedimento:
Primeiramente, o cadinho é identificado e colocado na mufla a 500-550 °C, durante 1 h, depois, resfria-o no dessecador, por 30 minutos e, depois, pesa-o, retornando ao dessecador e pesando novamente, até que se obtenha peso constante (Mcadinho), obtendo-se o cadinho preparado. Após isso, pesa-se a amostra, coloca-a no cadinho preparado e pesa o sistema cadinho preparado + amostra (Mamostra). A esse sistema, adiciona-se o ácido, e, depois, coloca-se na mufla a 350°C (temperatura mais baixa que na queima seca), para, então, ser incinerado, até que se obtenham cinzas brancas ou acinzentadas. Depois, coloca-se o sistema no dessecador, por 30 minutos, e realiza-se a pesagem, retornando eu dessecador e pesando novamente, até que se obtenha peso constante (Mfinal).
Queima seca e úmida por microondas:
Nesse método, utiliza-se o Microondas na obtenção da queima seca e úmida, permitindo reduzir o tempo do procedimento a minutos para obtenção das cinzas, tendo-se, portanto, uma maior velocidade. É muito empregado para a determinação elementar.
As vantagens é que o tempo é reduzido, atingem-se maiores temperaturas devido ao aumento da pressão, utilizam-se menores quantidades dos reagentes, e evitam-se perdas de componentes voláteis. As desvantagens é que o custo inicial é elevado, é empregado para pequenas quantidades de amostras e é aplicável a métodos mais sensíveis, logo, não pode ser empregado para qualquer método de determinação.
Cinza solúvel e insolúvel em água:
A solubilidade em água é importante, pois permite a identificação de fraudes nos alimentos. A partir da Cinza total, obtida por queima seca, por exemplo, adiciona-se água e aquece até ebulição, com cadinho tampado, para evitar perdas. Após isso, filtra-se num papel sem cinzas e lava-se com água quente. Carboniza-se o papel de filtro com o resíduo, esfria e pesa. O que sobra é o que não se dissolve na água, logo, é a cinza insolúvel. Assim, tem-se:
Cinza insolúvel em ácido:
A partir da Cinza total, adiciona-se HCl e aquece até ebulição, com cadinho tampado, por 5 minutos. Filtra-se num papel sem cinzas e lava-se com água quente. Incinera-se o papel de filtro com o resíduo até a cinza ficar clara, esfria e pesa. A cinza insolúvel é a cinza pesada.
Análise elementar:
Titulometria:
Utiliza-se a titulometria, que consiste, essencialmente, em determinar o volume de uma solução de concentração conhecida, que se requer para a reação quantitativa com um dado volume de solução da substância em análise.
Primeiramente, as cinzas são obtidas por via seca e são solubilizadas em água, transferindo e adicionando o indicador. Depois, faz-se a titulação até o ponto de viragem.
Espectrofotometria (colorimetria):
A variação da cor de uma solução, com a concentração do componente que se pretende analisar (analito), constitui a base da análise colorimétrica. A cor se deve a um composto colorido formado mediante a adição de um reativo apropriado ou do próprio analito. A intensidade da cor da solução sob análise é comparada com aquela obtida para quantidades conhecidas do analito (padrão), tratadas de forma igual à amostra.
As cinzas totais obtidas são solubilizadas e transferidas para um balão, obtendo-se a solução-mãe. A partir dessa soluça-mãe, retiram-se alíquotas, para sobter diferentes concentrações, e adiciona-se um quelante que reage apenas com o mineral de interesse, formando um composto colorido. Fazem-se concentrações diferentes da amostra e, então, uma curva de calibração é traçada com o espectrofotômetro.
Emissão de chama (fotometria):
Este método é utilizado para determinar a concentração dos metais alcalinos o alcalinos terrosos como o sódio, potássio e cálcio. O espectro emitido por cada metal é diferente, e sua intensidade depende da concentração dos átomos em uma chama. Emite luz após passar do estado excitado ao fundamental, que é quantificada.
Absorção atômica:
Um elemento disperso, sob forma de vapor atômico, pode absorver energia na faixa espectral característica, que emite quando excitado. O princípio básico da absorção atômica está na propriedade de absorção de energia representada por fótons de comprimento de onda bem determinado. A chama converte o aerossol da amostra em vapor atômico. Os átomos no estado fundamental absorvem energia luminosa em um comprimento de onda específico, alcançando o estado excitado. Quanto mais átomos no caminho ótico, maior a quantidade de energia absorvida.
DETERMINAÇÃO DE LIPÍDEOS NOS ALIMENTOS
Lipídeos:
A principal característica dos lipídeos é seu caráter apolar, sendo, portanto, insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos, como éter etílico, éter de petróleo, acetona, clorofórmio, benzeno e alcoóis. Essa característica é utilizada na análise dos lipídeos.
Apesar de todos os lipídeos serem apolares, essa característica varia um pouco entre eles. Os triacilgliceróis (ou triglicerídeos), por exemplo, que são os lipídeos mais abundantes tanto no organismo animal quanto vegetal, são muito hidrofóbicos. Já mono e digliceróis (ou mono e diglicerídeos) possuem polaridade um pouco maior, dependendo do composto ao qual eles estão associados, logo, apresentam partes hidrofílicas e hidrofóbicas em suas moléculas, sendo solúveis em solventes pouco polares.
O principal lipídeo presente no organismo é o colesterol, que é encontrado somente em animais, e é importante como precursor de hormônios, como componente estrutural de membranas celulares, e como precursor de vitaminas (como a vitamina D), por exemplo.
Classificação dos lipídeos:
Lipídeos simples:
Lipídeos simples são os mais abundantes no organismo. São constituídos, basicamente, por C, H e O e, quando hidrolisados, liberam ácidos graxos e álcool. Quimicamente, os lipídeos simples são classificados como ésteres.
O glicerol é o álcool mais comum na formação dos lipídeos simples.É um triálcool, apresentando 3 grupos hidroxilas em sua molécula, que são capazes de reagir com 3 moléculas ácido graxo, formando ésteres, que podem ser monoglicerídeos, diglicerídeos ou triglicerídeos (lipídeos simples mais abundantes no organismo), e liberando água (síntese por desidratação).
Os ésteres formados a partir do glicerol e ácidos graxos (glicerídeos) são chamados, popularmente, de óleos e gorduras. Os óleos são mais encontrados em vegetais, e, geralmente, são formados por ácidos graxos insaturados. As gorduras são mais típicas dos animais e, normalmente, são formadas por ácidos graxos saturados, o que torna as moléculas mais lineares, logo, o empacotamento entre elas é maior, o que permite que elas estejam no estado sólido, diferentemente do que ocorre com os óleos, onde se tem mais insaturações, que promovem dobras em sua molécula, logo, menor empacotamento, o que permite sua maior fluidez. O óleo pode se transformar em gordura a partir da quebra de suas insaturações por hidrogenação, através do aquecimento, por exemplo.
As ceras são tipos de lipídeos simples, diferenciando das gorduras e óleos com relação ao álcool que as compõem, que geralmente são alcoóis de cadeia longa e não o glicerol, portanto, não são glicerídeos como os óleos e as gorduras. As ceras podem ser de origem vegetal ou animal. Os vegetais produzem ceras com o objetivo de evitar a perda de água.
Lipídeos compostos:
Os lipídeos compostos são aqueles cuja hidrólise leva a formação de ácidos graxos, álcool e outro composto. Os principais exemplos de lipídeos compostos são os fosfolipídeos, os glicolipídeos, as lipoproteínas e os esfingolipídeos.
Os fosfolipídeos compõem a membrana plasmática das células e apresentam um grupo fosfato em sua molécula, no lugar de uma cadeia de ácido graxo. Essa região é a região polar da molécula, chamada cabeça.
Os esfingolipídeos apresentam, além de ácidos graxos e glicerol, compostos nitrogenados em sua molécula. Um exemplo de esfingolipídeo é a mielina.
Lipídeos derivados:
Os lipídeos derivados são substâncias obtidas, em sua maioria, por hidrólise de lipídeos simples e compostos, como os ácidos graxos, esteróis, vitaminas lipossolúveis e pigmentos.
Ácidos graxos:
A constituição em ácidos graxos é determinante para as propriedades dos lipídeos, podendo variar bastante. Os principais exemplos são: ácidos graxos monocarboxílicos; ácidos graxos alifáticos; ácidos graxos de cadeia longa, que são os principais ácidos graxos constituintes dos lipídeos, sendo que, na alimentação, a principal exceção é com relação ao leite, cuja gordura é constituída por ácidos graxos de cadeia curta; ácidos graxos com número par de carbonos, que são os mais encontrados normalmente, pois derivam da acetilcoenzima A, que possui 2 átomos de carbono, porém algumas gorduras animais possuem ácidos graxos com número ímpar de carbono, em baixas concentrações; e ácidos graxos saturados, que apresentam apenas ligações simples entre os carbonos, ou insaturados, que apresentam ligações duplas entre os carbonos, sendo que na natureza é possível encontrar ácidos graxos insaturados com configuração cis e com ligações duplas não conjugadas.
Hidrogenação dos ácidos graxos:
A hidrogenação é uma reação de adição de hidrogênio às ligações insaturadas dos ácidos graxos dos óleos e gorduras. Para isso, os óleos e gorduras são misturados com o hidrogênio e um catalisador em um vaso reator. Na superfície do catalisador (partículas de Ni, Pt, Pd), os ácidos graxos insaturados e o hidrogênio passam ao estado ativado.
O processo de hidrogenação pode levar à formação de gorduras trans, que são compostos tóxicos, uma vez que sobrecarregam o metabolismo, gerando uma maior quantidade de radicais livres, que podem destruir as células e o DNA. A gordura trans, porém, é interessante para as indústrias alimentícias, pois é capaz de aumentar a longevidade do alimento, impedindo que ele estrague facilmente, e, além disso, deixa o alimento mais saboroso.
Nomenclatura ômega:
Ômega significa último. Logo, o último carbono do ácido graxo é chamado de carbono ômega (Cω). A nomenclatura ômega 3 e ômega 6 está relacionada ao Cω. Chamando o Cω de 1, se houver uma insaturação no carbono 3, tem-se um ácido graxo da família ômega 3. Se a insaturação estiver no carbono 6, tem-se um ácido graxo da família ômega 6. Esses ácidos graxos são encontrados, geralmente, em peixes.
Composição em ácidos graxos de 3 gorduras alimentares:
Apesar de o óleo de oliva ser composto em sua maior parte por ácidos graxos insaturados, quando aquecido pode formar compostos tóxicos, devido à quebra das insaturações, formando compostos saturados, e formação dos compostos trans. Os compostos saturados provocam inflamação no vaso sanguíneo, formando um processo conhecido como aterosclerose que, por sua vez, pode causar diversos problemas para o indivíduo.
Função dos lipídeos:
· Fonte de energia: estão associados a reserva energética. 1 g de lipídeo fornece mais energia (9 kcal/g) que 1 g de carboidrato (4 kcal/g), porém o corpo consome, primeiramente, o carboidrato, para depois consumir lipídeos;
· Fontes de ácidos graxos essenciais;
· Veículo de vitaminas lipossolúveis: importante para a absorção dessas vitaminas;
· Estruturais (fosfolipídeos);
· Hormonais (prostaglandinas e tromboxanos);
· Aumentam o tempo de digestão;
· Relacionados com a textura e consistência dos alimentos;
· Associados a pigmentos e aromas;
· Influenciam a palatabilidade;
· Transferência de calor.
Determinação de lipídeos nos alimentos:
A determinação de lipídeos nos alimentos é importante para se determinar o valor nutritivo dos alimentos, a composição centesimal, o conhecimento das propriedades funcionais dos óleos e gorduras nos alimentos, verificação do atendimento a legislação vigente, de acordo com a RDC 360, verificar o padrão de identidade e qualidade do alimento (PIQ) e a qualidade sensorial do alimento.
Como a característica comum dos lipídeos é a apolaridade, logo, não imiscíveis em água, mas miscíveis em solventes orgânicos, para a determinação de lipídeos em um alimento faz-se, primeiramente, uma extração em solvente orgânico. Depois, realiza-se uma filtração, separando o solvente contendo os lipídeos do restante da amostra do alimento, e esse solvente é removido a partir de secagem, restando apenas os lipídeos totais presentes no alimento. Logo, comparando-se a massa inicial do alimento com a massa final (após a remoção dos lipídeos), através da diferença tem-se a quantidade de lipídeos totais presentes no alimento. A partir dos lipídeos totais obtidos após a extração com solvente orgânico, é possível determinar o perfil lipídico do alimento, a partir de reações de saponificação e metilação, por exemplo.
O solvente orgânico utilizado na extração deve ser bem escolhido, pois ele pode extrair outros compostos que não são lipídeos, que também estão presentes no alimento, gerando erro no resultado. Nenhum solvente é capaz de extrair apenas lipídeos, portanto, considera-se que o resultado obtido corresponde a cerca de 99% de lipídeos. Além disso, não existe um solvente universal, ou seja, capaz de solubilizar todos os lipídeos do alimento, logo, deve-se escolher o solvente que solubilize a maior parte dos lipídeos da amostra, o que, muitas vezes, é feito a partir de tentativa e erro.
O sucesso da extração depende da quebra das ligações entre lipídeos e proteínas ou carboidratos, para que os lipídeos livres sejam solubilizados nos solventes extratores, logo, a técnica deve permitir essa separação.
Tipos de métodos:
Os métodos de determinação dos lipídeos são divididos em 4 tipos:
· Extração com solvente a quente: utiliza-se principalmente éter etílico e éter de petróleo. Os principais métodos incluídos nessa classe são: método de Soxhlet (processo semi-contínuo) e método de Goldfish (processo contínuo);
· Extração com misturas de solventes a frio: utilizada para compostos voláteis, que não suportam aquecimento e, portanto, não poderiam ser extraídos por extração a quente. Essa extraçãopode ser feita com clorofórmio, metanol e água, que permite a separação através de um funil de separação, obtendo-se a fase orgânica composta de clorofórmio e lipídeos (método Bligh-Dyer), ou com clorofórmio e metanol, na proporção de 2:1 (método Folch);
· Extração de lipídeos ligados a outros componentes: pode-se realizar a hidrólise ácida (métodos de Gerber e Babcock), ou a hidrólise alcalina (métodos Rose-Gottlieb e Mojonnier, que permite a extração com solvente em processos descontínuos), quebrando a ligação entre os lipídeos e outros compostos, como proteínas, permitindo que os lipídeos estejam em sua forma livre, e se solubilizem no solvente orgânico utilizado para a extração;
· Métodos instrumentais: são métodos com boa sensibilidade e seletividade, como os métodos cromatográfico e colorimétrico.
Preparo das amostras para extração com solventes:
O preparo da amostra para a extração com solventes depende do tipo de alimento e dos lipídeos presentes, logo, deve-se ter conhecimento sobre a ocorrência das principais classes de lipídeos e seus constituintes no alimento. Além disso, devem-se evitar exposições que provoquem alterações dos lipídeos antes da determinação, como luz, calor, oxigênio e microorganismos e, para isso, o preparo da amostra deve ser feito sob atmosfera de nitrogênio (livre de oxigênio), em temperaturas baixas (uma vez que a alta temperatura pode degradar alguns compostos mais sensíveis) e com solventes livres de peróxidos (que são compostos muito reativos).
O fracionamento da amostra é importante, uma vez que a extração de lipídeos de produtos secos depende do tamanho das partículas, logo, o fracionamento do alimento permite o aumento da superfície de contato do alimento com o solvente, permitindo uma melhor solubilização dos lipídeos ou um melhor ataque ácido ou básico.
A secagem da amostra também é importante, uma vez que a água dificulta a penetração do solvente, que é apolar, o que, consequentemente, dificulta o processo de extração. Além disso, o éter saturado com água perde eficiência como extrator. Por isso, pode-se utilizar a amostra que foi obtida na determinação de umidade. Devem-se evitar temperaturas altas para a secagem, pois os lipídeos podem se ligar a carboidratos e proteínas, que não resistem a altas temperaturas, logo, deve-se utilizar uma estufa a vácuo, que permite a utilização de uma temperatura menor, ou o processo de liofilização para a secagem da amostra, onde se congela a amostra e, depois, a água da amostra congelada é sublimada.
A hidrólise ácida também deve ser levada em consideração para o preparo da amostra, pois ela é capaz de romper ligações de lipídeos a proteínas e carboidratos, sendo utilizada, por exemplo, para amostras de pães, farinhas, produtos lácteos e outros produtos de origem animal.
Seleção do solvente:
A seleção do solvente deve levar em consideração algumas características desejáveis, como:
· Não solubilizar proteínas, aminoácidos e carboidratos;
· Penetrar rapidamente nas partículas da amostra;
· Evaporar rapidamente;
· Não ser inflamável;
· Atóxico;
· Não higroscópico;
· Livre de peróxidos;
· Baixo custo;
· Não deixar resíduos.
Extração a quente:
Para a extração a quente, utiliza-se, principalmente, éter etílico ou éter de petróleo como solvente. O éter etílico apresenta: ponto de ebulição de 34,6 °C, logo, evapora mais rapidamente; extrai uma ampla gama de lipídeos, inclusive lipídeos derivados (como carotenoides e esteróis), o que constitui um erro quando se deseja determinar somente gordura (triacilgliceróis), porém estes compostos aprarecem geralmente em pequenas quantidades, o que daria um erro aceitável; é mais caro em comparação a outros solventes; apresenta perigo de explosão; é higroscópio; e forma peróxidos. Por outro lado, o éter de petróleo apresenta: ponto de ebulição de 35 – 38 °C, logo, não evapora tão facilmente quanto o éter etílico; é menos polar que o éter de etílico, sendo mais seletivo para os lipídeos menos polares; é mais hidrofóbico que o éter etílico; e é menos inflamável. Assim, devem-se avaliar as características dos lipídeos encontrados no alimento em análise, para a escolha do solvente adequado para a extração.
Método de Soxhlet:
No método de Soxhlet original, o solvente é aquecido, evapora e condensa. Ao condensar, ele goteja, entrando em contato com a amostra que está presente em um cartucho, onde há um sistema de sifão, pelo qual o solvente, juntamente com os lipídeos extraídos, retorna ao frasco de aquecimento, após atingir certo volume, permitindo a recirculação do solvente ao longo do processo. É um processo descontínuo, pois a amostra não estará o tempo todo em contato com o solvente de extração. O solvente é secado e, pesa-se a quantidade de lipídeos totais presente no recipiente.
No método de Soxhlet modificado, a amostra é imersa no éter em ebulição, dentro de um suporte metálico. Depois, o suporte com a amostra é suspenso e o éter condensado goteja sobre a amostra (os tempos de imersão e de gotejamento do solvente são definidos para diferentes produtos). Para a determinação da quantidade de lipídeos totais, tem-se um recipiente, que é pesado anteriormente ao processo, que receberá o solvente contendo os lipídeos. Assim, seca-se o solvente, e obtém-se a massa de lipídeos a partir da subtração da massa inicial do recipiente. Sabendo-se a massa inicial da amostra, é possível determinar a porcentagem de lipídeos na amostra.
A extração a quente por Soxhlet também pode ser automatizada, onde se utiliza um aparelho mais sofisticado, que realiza o processo automaticamente.
- Características do método de Soxhlet:
· Normalizado pela AOAC para alguns produtos, como cereais;
· Aplicável somente a amostras sólidas;
· Processo semi-contínuo;
· Extração com refluxo de solvente;
· Determinação gravimétrica dos lipídeos extraídos;
· A amostra não fica em contato direto com o solvente em ebulição (tradicional), evitando decomposição;
· A quantidade de solvente é maior porque o volume total deve ser suficiente para atingir o sifão do equipamento;
· Possível saturação do solvente que permanece em contato com a amostra antes de ser sifonado, o que dificulta a extração;
· Longo tempo de análise, levando, aproximadamente 4 horas, com velocidade de 5 a 6 gotas por segundo de condensação.
Método de Goldfish:
Enquanto no método de Soxhlet há refluxo do solvente extrator, que evapora e depois condensa, retornando ao frasco inicial (método descontínuo), no método de Goldfish, a amostra fica continuamente imersa no solvente em ebulição (método contínuo), logo, para determinar a utilização de um ou outro método na análise, deve-se saber se o lipídeo suporta temperaturas mais altas, levando-se em consideração que o solvente condensado no método de Soxhlet, que entrará em contato com a amostra, apresenta uma temperatura menor.
- Características:
· Aplicável somente a amostras sólidas;
· Processo contínuo e, portanto, mais rápido;
· Extração com refluxo de solvente;
· Determinação gravimétrica dos lipídeos extraídos;
· O contato do solvente muito quente com a amostra pode levar à degradação, sendo essa uma desvantagem;
· Utiliza menos solvente, pois não necessita atingir um volume para ser sifonado.
Exemplo - PR/BRO-UE/007 Determinação do extrato etéreo - gordura bruta:
A amostra seca, que pode ser obtida da determinação de umidade, é pesada, transferida quantitativamente para um cartucho de papel e armazenada no dissecador. Paralelamente, o recipiente utilizado na extração é colocado em uma estufa, secando-o, preparando-o para a análise e, depois, ele é transferido para um dissecador, onde permanece por alguns minutos. O recipiente é, então, pesado, obtendo-se a massa do recipiente vazio. Coloca-se então, neste recipiente, o éter etílico e monta-se o sistema de extração por Soxhlet.
Ao entrar em ebulição, o solvente evapora e, ao atingir o condensador, se condensa, gotejando sobre o cartucho contendo a amostra, entrando, portanto, em contato com a amostra. O cartucho está ligado a um sistema de sifão. Assim, ao atingirdeterminado volume, a mistura de solvente e lipídeos retorna ao frasco inicial, sendo submetida ao calor novamente, reiniciando o processo.
Ao final do processo, o recipiente contendo éter + lipídeos é separado do restante do sistema. Seca-se, então, o éter presente no recipiente, restando os lipídeos. Pesa-se o recipiente contendo os lipídeos extraídos, e obtém-se a massa de lipídeos presente na amostra, através da subtração pela massa inicial do recipiente. A partir da massa inicial da amostra, pode-se determinar o percentual de lipídeos, comparando-o com o que é determinado.
Extração a frio:
Método de Bligh-Dyer:
No método de Bligh-Dyer, a amostra é colocada em contato com uma mistura de clorofórmio, metanol e água, e os lipídeos da amostra se dissolvem no clorofórmio. Assim, tem-se a formação de um sistema bifásico, contendo uma fase orgânica com clorofórmio e lipídeos, e uma fase aquosa, contendo metanol, água e as substâncias não lipídicas. Essas fases são separadas através de um funil de separação, e a fase aquosa é descartada, uma vez que o composto de interesse (lipídeos) está presente na fase orgânica. A fase orgânica é submetida ao aquecimento, onde o clorofórmio é evaporado, restando apenas os lipídeos. Assim, sabendo-se a massa inicial do recipiente onde se recolheu a fase orgânica, é possível determinar a quantidade de lipídeos presente na amostra, e sabendo-se a massa inicial da amostra, é possível determinar a porcentagem de lipídeos em tal.
- Características:
· Aplicável tanto a produtos com alto teor de umidade e secos;
· Extração de todas as classes de lipídeos, incluindo os polares, que representam um alto teor em produtos de trigo e soja;
· Separação das fases por decantação;
· Determinação gravimétrica dos lipídeos extraídos;
· Amostra não sofre aquecimento, não provocando alterações, podendo, portanto ser usado para amostras sensíveis ao calor, como vitamina E, carotenóides e esteróis;
· A determinação pode ser feita em tubos de ensaio, não requerendo equipamentos sofisticados;
· Etapa inicial de extração de lipídeos dos alimentos para análise de ácidos graxos, por cromatografia gasosa;
· Toxicidade dos solventes, que representa uma desvantagem do método;
· Extração dos contaminantes não lipídicos;
· É necessário conhecer o teor de umidade do alimento.
Extração de lipídeos ligados a outros compostos:
Hidrólise ácida – Métodos de Gerber e Babcock:
A hidrólise ácida é utilizada rotineiramente somente para análise de leite e produtos lácteos. Tendo-se como exemplo o leite, a olho nu ele parece uma mistura homogênea. Porém, observando-se ao microscópio, percebe-se a presença de glóbulos de gordura. Em um aumento maior, observa-se que esses glóbulos de gordura são, na verdade, micelas contendo uma película de proteína, que envolve os lipídeos, formando um filme proteico. Logo, para a análise dos lipídeos, é necessário que haja quebra da camada proteica que envolve os lipídeos, para que eles tenham acesso ao solvente. Para isso, realiza-se a extração por hidrólise ácida, pois o ácido é capaz de quebrar essa película, liberando os lipídeos.
Existem dois métodos de extração por hidrólise ácida: método de Gerber e método de Babcock, sendo que um é uma modificação do outro, se diferenciando apenas com relação ao solvente utilizado.
No método de Gerber, adiciona-se ácido sulfúrico e ácido isoamílico à amostra, e agita-se o sistema até solubilização. O ácido sulfúrico rompe o filme proteico que está protegendo os lipídeos, através da digestão proteica, e o ácido isoamílico reduz o efeito de carbonização do ácido sobre a gordura. Então, realiza-se uma centrifugação direta no butirômetro, separando-se a parte proteica e a parte lipídica da amostra, e obtendo-se um volume correspondente aos lipídeos, uma vez que o butirômetro é graduado.
O método de Babcock difere do método de Gerber com relação à menor quantidade de ácido que é utilizada, e pela adição de água quente no lugar do álcool isoamílico. O álcool isoamílico impede a carbonização dos açúcares pelo ácido, assim, se a amostra apresentar grande quantidade de açúcar, o método de Babcock não é indicado, pois ele não utiliza o álcool isoamílico, logo, o ácido sulfúrico degradará os carboidratos, gerando produtos que podem interferir no resultado da análise.
- Características:
· Aplicável a leite e produtos lácteos, sendo que o método de Babcock é normalizado pela AOAC;
· Não requer remoção da umidade previamente, nem conhecimento do teor, sendo possível realizar a hidrólise ácida diretamente;
· Separação das fases por centrifugação, através do butirômetro;
· Leitura volumétrica, uma vez que o butirômetro é graduado;
· O método de Gerber é mais utilizado na Europa e o de Babcock nos Estados Unidos;
· Não determinam fosfolipídeos, que estão presentes em apenas 1% no leite integral, e 24% na manteiga (nesse caso, opta-se por outro método, como Goldfish ou Soxhlet);
· Gerber é mais simples e rápido;
· Babcock não se aplica a produtos com chocolate ou açúcar, pois pode haver degradação dos açúcares pelo ácido, já que ele não utiliza o ácido isoamílico;
· Gerber é aplicável a uma variedade maior de produtos lácteos, pois o álcool isoamílico impede a carbonização dos açúcares pelo ácido.
Hidrólise alcalina – Métodos de Mojonnier e Rose-Gottlieb:
Na hidrólise básica, a película proteica que protege os lipídeos é destruída pela ação de uma base forte, e, depois, a extração é realizada com éter etílico e éter de petróleo. Então, seca-se o éter do produto obtido e, por gravimetria, tem-se a determinação da quantidade de lipídeos presentes na amostra.
- Características:
· Aplicável a amostras de leite, sendo que o método de Mojonnier é normalizado pela AOAC para leite e farinha;
· Processo de extração descontínuo;
· Não requer remoção da umidade previamente;
· Determinação gravimétrica dos lipídeos extraídos;
· Para amostras de leite, emprega-se hidróxido de amônio (neutraliza amostras ácidas e dissolve as proteínas), etanol (precipita a proteína, que é dissolvida na amônia), éter etílico (extração dos lipídeos) e éter de petróleo (remove umidade do éter etílico e extrai lipídeos menos apolares);
· Necessário branco de reagente.
Determinação do perfil lipídico:
 A determinação do perfil lipídico é importante, pois permite:
· Avaliação da presença e do teor de ácidos graxos essenciais em um alimento;
· Avaliação da proporção entre ácidos graxos saturados e insaturados;
· Avaliação das características de identidade e qualidade de alguns alimentos;
· Etapa da quantificação de ácidos graxos trans;
· Detecção de fraudes em alguns alimentos;
· Avaliação de propriedades funcionais, com relação aos ômegas.
Métodos:
· Cromatografia gasosa: nesse método, primeiramente prepara-se a amostra, pois os ácidos graxos devem ser metilados, já que são pouco voláteis (ésteres metílicos dos ácidos graxos são mais voláteis). Para isso, pode-se realizar a transesterificação com excesso de metanol, onde troca-se o álcool do lipídeo pelo metanol, ou saponificação com solução concentrada de álcali (com liberação de glicerol e sais dos ácidos graxos), permitindo o isolamento dos ácidos graxos e, depois, esterificação dos mesmos com metanol, possibilitando uma determinação mais facilitada, em ambos os casos. Obtém-se o resultado através de um cromatograma, que é comparado a um padrão.
· Espectrofotometria (colorimetria): nesse método, realiza-se a medida da intensidade da cor desenvolvida pela reação entre a gordura do leite e o ácido hidroxâmico, e compara-se com uma curva de calibração, que é determinada a partir de diferentes intensidades de cor e conteúdos de gordura previamente determinados pelo método de Mojonnier.
DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS NOS ALIMENTOS
Proteínas:
As proteínas são macromoléculas (moléculas de peso molecular elevado), cujas unidades monoméricas são aminoácidos, ligados entre si através de ligações peptídicas. Os aminoácidos são constituídos por um átomo de carbono central ligado a um grupamento amina, a um grupamento ácido carboxílico, hidrogênioe um grupamento R. Em todos os aminoácidos, o carbono é quiral, com exceção da glicina, logo, apresentam diversos isômeros.
A proteína é um peptídeo formado por uma cadeia de aminoácidos com peso molecular acima de 10.000 Da, sendo que 1 Da corresponde ao peso de 1 átomo de H.
Recomenda-se a ingestão de 70 g de proteína, para manter as funções orgânicas adequadas. Quantidades maiores não são absorvidas pelo organismo. Assim, indivíduos que praticam atividade física com o objetivo de ganhar massa muscular, e que fazem uso abusivo de suplementos proteicos, o excesso de proteína ingerido por eles será eliminado. A massa muscular aumentará devido ao aumento dos sarcômeros das células musculares esqueléticas, pela maior produção de proteínas nessas células, estimulado através de hormônios devido aos exercícios físicos realizados por esses indivíduos.
Alguns alimentos, como as leguminosas (soja, por exemplo), apresentam maior teor de proteínas, uma vez que apresentam bactérias fixadoras de nitrogênio. Porém, a soja, assim como outros vegetais, apresenta fatores antinutricionais, como substâncias que bloqueiam a ação da tripsina, o que não permite a digestão de toda a proteína, logo, nem toda a quantidade de proteínas da soja será absorvida pelo organismo.
Composição das proteínas:
Todas as proteínas são constituídas, basicamente, por carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio, e possuem composição muito semelhante. Muito raramente contém fósforo.
Na natureza, encontram-se 20 tipos de aminoácidos, que são divididos de acordo com características químicas semelhantes. Porém, atualmente, alguns aminoácidos podem ser produzidos sinteticamente. Esses aminoácidos podem se combinar de diversas formas entre eles, formando proteínas distintas, de acordo com o gene que é codificado, sendo que um mesmo gene pode codificar mais de uma proteína.
A sequência de aminoácidos de uma proteína é importante para o funcionamento de tal, sendo que qualquer mutação, seja em apenas 1 aminoácido, gera proteínas defeituosas, que não são capazes de exercer sua função adequadamente. A mutação de uma valina por glutamina (ácido glutâmico) na molécula de hemoglobina, por exemplo, provoca a anemia falciforme.
Ligação peptídica:
A ligação peptídica é a ligação entre o carbono do grupamento carboxila de um aminoácido com o nitrogênio do grupamento amina de outro aminoácido, através de desidratação. A partir desse conceito de ligação peptídica, é possível perceber que a quebra de uma ligação peptídica a partir de uma enzima específica para um determinado aminoácido, é feita através de hidrólise.
Classificação dos aminoácidos:
Os aminoácidos podem ser classificados em: essenciais, que são aqueles que o organismo não produz, logo, são necessários na alimentação, colo leucina, isoleucina, valina, triptofano, fenilalanina, metionina, treonina, lisina e histidina; aminoácidos não essenciais, que são aqueles que o organismo produz, sendo também chamados de aminoácidos naturais, como glutamato, alanina, aspartato e glutamina; e aminoácidos condicionalmente essenciais, que são aqueles que o organismo pode produzir, dependendo das condições. Na infância, por exemplo, alguns aminoácidos são essenciais e, com o passar do tempo, o organismo passa a produzi-lo, logo, eles são aminoácidos condicionalmente essenciais, dependendo do nível de maturação do organismo para que sejam produzidos. Numa situação de debilidade, por exemplo, ou baixa imunológica, o organismo pode passar a não produzir determinado aminoácido, ou diminuir sua produção, logo, nesse momento, esse aminoácido é considerado essencial, sendo mais um exemplo de aminoácidos condicionalmente essenciais.
Conforme a polaridade dos radicais ligados ao carbono adjacente ao carbono do grupamento carboxila, os aminoácidos podem ser classificados em: apolares ou hidrofóbicos, que são aminoácidos alifáticos ou aromáticos de caráter hidrofóbico, como alanina, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, prolina, triptofano e valina; polares neutros ou hidrofílicos, que são aminoácidos alifáticos ou aromáticos polares, possuindo hidroxilas e sulfidrilas, por exemplo, com capacidade de formar ligações de hidrogênio, como asparagina, cisteína, glutamina, hidroxiprolina, serina, tirosina e treonina; polares carregados positivamente ou básicos, que possuem um segundo grupo amínico ou imínico, como arginina, hidroxilisina, histidina e lisina; e polares carregados negativamente ou ácidos, que possuem um segundo grupo carboxílico, como o ácido aspártico e o ácido glutâmico.
Classificação das proteínas:
As proteínas podem ser classificadas em simples ou conjugadas. As proteínas simples são constituídas exclusivamente por aminoácidos, como a queratina, albumina e globulina. As proteínas conjugadas são constituídas por aminoácidos ligados a grupos prostéticos (não proteicos), como glicoproteínas (mucina e fibrinogênio), cromoproteínas (hemoglobina, que possui um grupo porfirina contendo ferro, chamado grupo heme), fosfoproteínas (caseína) e lipoproteínas (apoproteína + colesterol, como LDL, HDL, VLDL).
Estrutura:
A estrutura primária de uma proteína é a simples sequência dos aminoácidos presentes. A posição dos aminácidos é reflexo do DNA, que é o responsável pela codificação das proteínas do organismo. A estrutura secundária é formada devido a interações intramoleculares entre aminoácidos próximos, criando dobras, formando uma estrutura tridimensional de α-hélice ou folha β. Quando se tem a estrutura secundária, alguns aminoácidos que estavam distantes ficam mais próximos e começam a interagir entre si, formando estruturas mais complexas, que são as estruturas terciárias. A estrutura quaternária é a interação não covalente das estruturas terciárias, como ocorre na insulina (2 estruturas terciárias unidas) e na hemoglobina (4 estruturas terciárias unidas, sendo 2 alfas e 2 betas).
Desnaturação proteica:
A desnaturação proteica é a perda da conformação nativa, com modificação da conformação proteica, sem que haja ruptura das ligações peptídicas. Isso leva à perda da função proteica, já que a estrutura de uma proteína é importante para o seu funcionamento. Na enzima, por exemplo, existe o sítio ativo, onde ocorre a reação catalisada por ela. Esse sítio ativo depende da conformação da proteína, logo, diante de uma desnaturação e, consequentemente, perda dessa conformação, a enzima não será capaz de catalisar a reação, perdendo sua função.
A desnaturação pode ser reversível, porém, na maioria das vezes, ela é irreversível. Os agentes desnaturantes podem ser: físicos, como temperatura, agitação, irradiação e ultrassom; ou químicos, como pH, solventes orgânicos, detergentes, metais e sais.
A desnaturação pode ser vantajosa em algumas ocasiões, como: inativação de microorganismos, que é importante, principalmente, na higiene de alguns alimentos; inativação de enzimas, como ocorre com o milho, pois o milho, logo que é retirado, é doce, devido à presença de grande quantidade de frutose, porém, após sua retirada da plantação, uma enzima é ativada, sendo responsável pela transformação da frutose em polissacarídeos, o que diminui o sabor doce, logo, aquecendo-se o milho, essa proteína é desnaturada e, então, não terá função, e o milho continuará doce; e aumento da digestibilidade proteica e biodisponibilidade de aminoácidos. Em outras ocasiões, a desnaturação pode ser desvantajosa, como: coagulação do leite UHT; perda de atividade biológica; e exposição de grupos reativos (SH – sabor de leite cozido).
Na alimentação, não importa para o organismo se a proteína estará na sua forma nativa ou desnaturada, pois a mesma será degradada, uma vez que o importante para o organismo são os aminoácidos.
Funções:
As proteínas apresentam diversas funções biológicas, como função estrutural, hormonal (como a insulina), na defesa, energética e função enzimática. No alimento, as proteínas apresentam função nutricional, organoléptica, na textura, no fornecimento de aminoácidos essenciais e na estabilidade.
Determinação deproteínas:
Importância:
A determinação de proteínas é importante para determinar o valor nutritivo do alimento, as características de identidade e qualidade (PIQ), a rotulagem nutricional obrigatória, o rendimento de processos industriais e a avaliação de propriedades funcionais.
Tipos de métodos:
Têm-se, basicamente, dois grupos de métodos para a determinação de proteínas:
· Determinação de elemento: métodos que determinam a quantidade de nitrogênio no alimento, relacionando-a com a quantidade de proteínas, já que elas são ricas em nitrogênio, logo, cerca de 99% da quantidade de nitrogênio encontrada no alimento corresponde a proteínas. Porém, esses métodos estão muito susceptíveis a fraudes, pois se podem adicionar substâncias contendo nitrogênio ao alimento, o que dará um resultado falso-positivo. Exemplo: método de Kjeldahl;
· Determinação de grupo: métodos que determinam os aminoácidos ou ligações peptídicas pertencentes à proteína, estando menos susceptíveis a fraudes. Exemplos: método de biureto, método por fenol, método dye-binding, espectroscopia no UV, turbidimetria e métodos físicos.
Método de Kjeldahl:
O método de Kjeldahl é o mais utilizado para a determinação de proteínas. Esse método determina o nitrogênio orgânico total, ou seja, o nitrogênio proteico e não proteico orgânico. O método de Kjeldahl é constituído por, basicamente, 3 etapas: digestão, neutralização/destilação e titulação.
Na etapa de digestão, as proteínas e outros componentes orgânicos são digeridos na amostra pelo ácido sulfúrico concentrado na presença de catalisador, no digestor de Kjeldahl, a 365°C. Dessa forma, quebram-se todas as ligações, formando-se água, CO2 e amônia. Na presença de água, a amônia é convertida em íon amônio que, por sua vez, interage com o sulfato, e o nitrogênio total orgânico é convertido em sulfato de amônio. Isso é feito porque o nitrogênio está preso à matéria orgânica, logo, deve-se liberá-lo para permitir sua quantificação.
Na etapa de neutralização/destilação, a amostra digerida (sulfato de amônio) é neutralizada com uma base (hidróxido de sódio 40 a 50%), no destilador, produzindo hidróxido de amônio, que é mais volátil. Logo, aquecendo-se o hidróxido de amônio, é possível destilar, ou seja, separar o hidróxido de amônio. O destilado é coletado numa solução de ácido bórico. Ao reagir com o ácido bórico, ocorre a formação do borato de amônio, que é mais fácil de ser titulado.
Na etapa de titulação, deseja-se saber o quanto de borato de amônio foi formado. Para isso, os ânions borato formados são titulados com ácido clorídrico padronizado, ou seja, numa concentração conhecida. O ácido forte desloca o amônio da molécula de borato de amônio, na proporção de 1:1 (1 mol de ácido reage com 1 mol de borato de amônio). Dessa forma, é possível determinar o quanto se tinha de borato de amônio, e, consequentemente, de hidróxido de amônio e sulfato de amônio, estequiometricamente. O resultado representa o nitrogênio total contido na amostra, que é correlacionado à quantidade de proteína.
Na determinação da quantidade de nitrogênio, considera-se que, em média, as proteínas possuem 16% de nitrogênio, logo:
 16 g nitrogênio ______ 100 g proteínas
n g nitrogênio ______ X g proteínas
 X = n x 6,25 g proteínas
Assim, a partir da quantidade de nitrogênio encontrada, é possível determinar a quantidade de proteínas presente na amostra. Isso pode gerar erros se a quantidade de nitrogênio no alimento for muito diferente de 16%. Sendo assim, existem fatores de conversão específicos para alguns alimentos. Para outros alimentos, o fator de conversão será 6,25.
Utiliza-se uma mistura de vermelho de metila e verde de bromocresol como indicador na titulação. Isso deve ser feito porque o verde de bromocresol apresenta pH que varia de 3,8 (amarelo) a 5,4 (azul) e o vermelho de metila apresenta pH que varia de 4,2 (vermelho) a 6,3 (amarelo), porém, o pH que se deseja fazer a determinação varia de 4,0 a 5,5, o que não seria possível obter utilizando apenas um desses indicadores. Com a mistura, tem-se uma faixa de pH que varia de 3,8 a 6,3, conseguindo observar facilmente a mudança de coloração durante a titulação, que será de coloração alaranjada. Logo, a mistura de indicadores é importante para ter uma faixa de pH que atende à mudança durante a titulação.
Alguns catalisadores são utilizados durante a digestão, com o objetivo de acelerar essa etapa, como: óxidos de metais, como mercúrio, que são mais eficientes, mas deve-se acrescentar uma etapa para separar o complexo mercúrio-amônia formado e também não são muito utilizados por questões ambientais; cobre, que é pouco eficiente e apresenta limite de aplicação, pela sua toxicidade; selênio, que tem efeito mais rápido que o mercúrio e não precisa separação após seu uso, mas pode levar a perdas de nitrogênio se usado em excesso ou a temperaturas muito elevadas; misturas digestoras, que são a tendência atual, como óxido de selênio, sulfato de cobre e sulfato de potássio. Essas misturas digestoras são capazes de aumentar o ponto de ebulição da mistura na digestão, acelerando o processo.
- Vantagens:
· Aplicável para todos os tipos de alimentos;
· Relativamente simples e barato;
· Método oficial;
· Adaptável para pequenas quantidades de amostra.
- Desvantagens:
· Mede nitrogênio orgânico total, logo, toda molécula com nitrogênio, que estiver presente na amostra, interferirá no resultado, sendo computado como proteína. Isso permite que fraudes não sejam descobertas;
· Demorado e gera uma quantidade significativa de resíduos químicos, que são poluentes;
· Reagentes perigosos.
Método por biureto:
No método por biureto, utiliza-se o reagente de biureto, que é composto por sulfato de cobre, hidróxido de sódio e tartarato de sódio e potássio. Esse reagente é misturado a uma solução da amostra contendo proteína, e ocorre a formação de um complexo de coloração roxa, formado entre o íon cúprico e duas cadeias peptídicas adjacentes. Logo, esse método permite a determinação direta de proteínas, pois somente as proteínas apresentam ligações peptídicas. A intensidade da cor formada é proporcional à concentração de proteínas, então, necessita-se determinar uma curva de calibração, que, geralmente, é construída com albumina bovina.
A reação é rápida, durando cerca de 15 a 30 minutos, e realiza-se a filtração, caso a solução não esteja límpida. A leitura da absorbância é feita a 540 nm.
- Vantagens:
· Bastante específico, pois não apresenta problemas de interferentes, diferentemente do método de Kjeldahl;
· Simples, rápido e barato;
· Permite a determinação direta de proteína, por envolver uma reação com a ligação peptídica, ao contrário do método de Kjeldahl.
- Desvantagens:
· Necessita de curva de calibração;
· A cor formada não é idêntica para todas as proteínas, pois depende das cadeias laterais da proteína. Porém, os desvios causados são menores do que em outros métodos colorimétricos.
Método por fenol ou Folin-Ciocalteau-Lowry:
O método de Folin-Ciucalteau Lowry é uma combinação entre a reação de biureto e a redução do reagente fenólico de Folin-Ciocalteau por resíduos de tirosina e triptofano, que são aminoácidos aromáticos. O método baseia-se na mistura do reagente de biureto, composto por sulfato de cobre, hidróxido de sódio e tartarato de sódio e potássio, com o extrato proteico da amostra, seguido de incubação a temperatura ambiente, formando um complexo entre o cobre e as ligações peptídicas das proteínas (reação de biureto). Em seguida, adiciona-se o reagente fenólico de Folin-Ciocalteau, composto por molibdato, tungstato e ácido fosfórico, seguido de incubação a 50°C, que reage com o complexo e se reduz, formando um composto azul, com absorção máxima a 750 nm, logo, é necessária a construção de uma curva de calibração. A reação ocorre em condições alcalinas.
Os sais e ácidos de molibdênio e tungstênio são mais seletivos para aminoácidos com radicais aromáticos, logo, é um método mais seletivo, sendo considerado como uma evolução do método de biureto.
O método, então,envolve uma oxidação, catalisada por cobre, de aminoácidos aromáticos, por um reagente heteropolifosfato (fosfotúngstico-fosfomolíbdico), desenvolvendo uma cor azul, que será medida num colorímetro e comparada com uma curva padrão.
- Vantagens:
· É mais sensível e específico que o método de biureto;
· Determinação direta de proteínas.
- Desvantagens:
· Necessita da construção de uma curva de calibração;
· A cor varia com a composição da proteína analisada em aminoácidos, o que pode levar a erros no resultado;
· Processo lento;
· Exige operações múltiplas (muita manipulação) e necessita de um período de incubação entre a adição dos reagentes, o que aumenta as chances de erros;
· Sofre interferência de açúcares, principalmente, logo, não é um método indicado para amostras contendo grande quantidade de carboidrato;
· Método destrutivo.
Método dye-binding:
O método dye-binding consiste na interação da proteína com um corante, formando um complexo insolúvel, que precipita, sendo separado por centrifugação ou filtração. Ao filtrar, a solução resultante continua colorida devido ao excesso de corante, ou seja, a quantidade de corante que não reagiu. Esse excesso é determinado colorimetricamente. Mede-se, portanto, a intensidade da cor dessa solução, que é menor que a do corante puro, logo, é necessário construir uma curva de calibração. Através da diferença entre a intensidade do corante puro e a intensidade da cor da solução formada, é possível determinar a quantidade de proteína. A determinação também pode ser feita através de gravimetria, pela diferença de peso entre a amostra inicial e o precipitado formado.
- Vantagens:
· Rápido e econômico;
· Não manipula reagentes corrosivos;
· Utiliza apenas 1 equipamento para toda análise.
- Desvantagens:
· Necessita de curva de calibração;
· Outros componentes não proteicos podem se ligar ao corante, como o amido, o que reduz a quantidade de corante disponível para se ligar às proteínas;
· Outros componentes podem se ligar às proteínas, como o cálcio, servindo como competidores da ligação às proteínas com o corante, o que reduz a ligação da proteína com tal.
Método espectrofotométrico:
No método espectrofotomético, as proteínas são solubilizadas numa solução tampão ou alcalina específica, e realiza-se a leitura da absorvância de radiação UV em 280 nm, devido à presença de aminoácidos aromáticos, que possuem duplas ligações conjugadas, como tirosina, triptofano e fenilalanina. É utilizado, principalmente, para leite e produtos lácteos, cárneos e agrícolas, sendo mais aplicável a proteínas purificadas.
- Vantagens:
· Rápido;
· Simples;
· Não destrutivo.
- Desvantagens:
· Os resultados não são muito precisos, pois dependem da concentração dos 3 aminoácidos na composição da proteína;
· Interferência dos ácidos nucleicos.
Método turbidimétrico:
Ácidos em baixas concentrações são utilizados para precipitar proteínas, uma vez que ácidos são capazes de desnaturar proteínas. A precipitação de proteínas forma uma solução turva, com partículas de proteína em suspensão, e essa turbidez pode ser medida. Alguns agentes precipitantes são: ácido tricloroacético; ferrocianeto de potássio; e ácido sulfossalicílico.
A turbidez é medida através da redução na transmissão de radiação, devido à presença das partículas de proteína. A intensidade da redução da radiação pode ser relacionada com a concentração de proteína. 
Esse método é mais utilizado para determinar proteínas em farinha de trigo e milho.
- Vantagens:
· Rápido;
· Simples para amostras líquidas, nas quais as proteínas estão em solução;
· Não destrutivo.
- Desvantagens:
· Não compensa ser utilizada para amostras sólidas, nas quais a proteína deve ser extraída para uma solução;
· Resultado varia com o tipo de proteína;
· Pode haver precipitação de outras substâncias com as proteínas, causando interferência no método;
· O método depende da calibração com padrões conhecidos de proteínas determinados por outros métodos.
Métodos físicos:
Os métodos físicos não são muito utilizados. Alguns exemplos são: medida do índice de refração, ou seja, cálculo do desvio da luz em função da presença de proteínas na solução; densidade específica; viscosidade; tensão superficial; condutividade; e polarização, em função dos grupos radicais dos aminoácidos.
Melamina:
A melamina é habitualmente usada como agente retardador de fogo e na fabricação de plásticos (por reação com formaldeído dá origem a um plástico também designado por melamina). Essa substância foi detectada em leite em pó de origem chinesa, em setembro de 2008, resultando na hospitalização de 51.900 e 6 mortes admitidas pelas autoridades chinesas.
Sabendo-se que o método de Kjeldahl é o método mais utilizado e normalizado para a determinação de proteínas em amostras de alimentos, e que esse método determina a quantidade de nitrogênio na amostra, relacionando-a com a quantidade de proteínas, a melanina foi adicionada ao leite com o objetivo de aumentar a quantidade de nitrogênio no leite, uma vez que essa substância apresenta grande quantidade de nitrogênio em sua estrutura. Assim, permitiu-se a adição de água ao leite, aumentando seu volume, sem que a quantidade de nitrogênio presente na amostra (que seria derivada das proteínas) diminuísse, pois o N na melamina seria quantificado como proteínas, já que o método de Kjeldahl é indireto. Dessa forma, outros métodos mais específicos para a determinação de proteínas poderiam ser utilizados para a detecção dessa adulteração, como: método de biureto, Folin-Ciocalteau Lowry, dye-binding, entre outros, que se baseiam nas ligações peptídicas.
A melamina também foi detectada em outros alimentos, como ovos e carnes. A origem dessa contaminação pode ser dos alimentos ingeridos pelos animais, da ração utilizada na alimentação dos mesmos, ou até mesmo dos recipientes plásticos onde essa ração é armazenada.
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