PCR em Tempo Real

Prévia do material em texto

PCR em Tempo Real 
PCR Quantitativa (qPCR) 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE 
LABORATÓRIO DE VIROLOGIA 
DOUTORANDA: TIANE MARTIN DE MOURA 
PPG MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE 
1 
http://www.ufrgs.br/ufrgs/
Histórico 
• Descrita pela primeira vez em 1993 por Higuchi e seus 
colaboradores 
• Acoplaram uma câmara de vídeo monitorando a PCR durante todos 
os ciclos para detectar a fluorescência 
• Ligação do EtBr às moléculas de dsDNA recém-sintetizadas 
2 
Princípios da PCR em Tempo Real 
• Metodologia de PCR + Sistema de detecção de sinais 
fluorescentes 
• Detecção, quantificação e amplificação de DNA em uma 
única etapa 
o Agilidade na obtenção de resultados 
• Técnica quantitativa 
o Quantificação do número de moléculas produzidas a cada ciclo 
 
3 
Princípios da PCR em Tempo Real 
• Etapas de amplificação de uma PCR convencional 
o Temperaturas e tempos diferentes 
o Curva de dissociação 
• Coleta de dados 
o Fase exponencial da reação 
• Reagentes de uma PCR convencional + Corante 
o Intercalantes de DNA de dupla fita (dsDNA) 
o Oligonucleotídeos marcados 
• Plataforma de instrumentação 
o Termociclador + Sistema Óptico 
o Computador com software para aquisição de dados e análise final 
4 
Vantagens 
PCR em Tempo Real PCR convencional 
• Coleta de dados na fase 
exponencial 
• SEM manipulação pós-
PCR 
• Resultados quantitativos 
• Requer concentrações de 
DNA/cDNA 1000 x < 
• Tempo de reação 
reduzido 
• Maior reprodutibilidade, 
sensibilidade e precisão 
 
 
• Coleta de dados na fase final 
da reação (plateau) 
• Manipulação pós-PCR 
• Preparação de gel de agarose 
- visualização 
• Resultados qualitativos 
• Requer concentrações 
maiores de DNA/cDNA 
• Muito tempo para obter 
resultados 
5 
Aplicações 
• Todas as aplicações da PCR tradicional 
• Quantificação de carga viral 
• Quantificação de expressão gênica 
• Testes de eficiência terapêutica 
• Detecção de agentes infecciosos 
• Caracterização de agentes (Genotipagem) 
6 
Curva de Amplificação 
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html 
Amplificação 
Exponencial 
7 
Princípios da PCR em Tempo Real 
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html
NTC 
(no template 
control) 
Fl
u
o
re
sc
ê
n
ci
a
 (
R
n
) 
Li
n
e
a
r 
Curva de Amplificação 
A1 A2 
8 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Baseline 
background 
Exponencial Plateau 
Gráfico de Amplificação 
Exponencial 
Baseline 
Ct 14,5 Ct 20,8 
Threshold 
Fl
u
o
re
sc
ê
n
ci
a
 (
d
e
lt
a
 R
n
) 
Li
n
e
a
r 
Curva de Amplificação 
9 
Princípios da PCR em Tempo Real 
NTC 
A1 A2 
Gráfico de Amplificação 
Exponencial Threshold 
Fl
u
o
re
sc
ê
n
ci
a
 (
d
e
lt
a
 R
n
) 
Lo
g
 
Curva de Amplificação 
10 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Gráfico de Amplificação 
Reagentes - Mix 
• Master Mix Comerciais 
o Primers e DNA/cDNA 
• Mix convencional 
11 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Ciclagem 
Tempo estimado: 00:57:34 
12 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Ciclagem 
Tempo estimado: 00:47:37 
13 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Otimização – Primers 
• Desenho de primers (Produto de 100 – 150 pb) 
• Determinar a concentração ideal de uso 
• Utilizar uma concentração fixa de DNA/cDNA 
• Gradiente da concentração dos primers 
o 0,25 μM; 0,4 μM; 0,5 μM e 0,7 μM 
14 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Otimização – Primers 
• Analisar a “Curva de dissociação” 
• Melhor concentração dos primers 
• Menor concentração de primers – Máxima 
amplificação 
15 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Validação – Primers 
• Determinar a concentração ideal de uso 
• Utilizar uma concentração fixa de primers 
• Gradiente da concentração de DNA/cDNA 
o 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng 
16 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Validação – Primers 
• Analisar a “Curva de dissociação” 
• Valores de “slope” e de “R2” – Eficiência 
Concentração ideal dos primers (Otimização) determinada e validada 
(Validação) → Reações Padronizadas 
17 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Sistemas de Detecção 
Detecção não-específica 
• Fluoróforos ligando-se ao dsDNA e emitindo fluorescência 
o SYBR-Green® 
Detecção específica 
• Oligonucleotídeos marcados com fluoróforos altamente 
específico a sequência alvo, emitindo fluorescência apenas na 
presença do produto de PCR de interesse 
o TaqMan® 
18 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Sistemas de Detecção 
• Fluoróforos ou Fluorocromos 
• Cada molécula apresenta um espectro de absorbância e 
emissão característicos 
 SYBR-green 
Absorção máxima : 494 nm 
Emissão máxima : 521 nm 
19 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Sistemas de Detecção 
TAMRA 
Absorção máxima : 555 nm 
Emissão máxima : 580 nm 
FAM 
 Absorção máxima: 495 nm 
Emissão máxima : 521 nm 
TET 
Absorção máxima : 519 nm 
Emissão máxima : 539 nm 
HEX 
Absorção máxima : 537 nm 
Emissão máxima : 556 nm 
20 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Sistemas de 
Detecção 
21 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Sistemas de Detecção 
Intercalantes de dsDNA – “green” 
• Detecta produtos inespecíficos – dímeros de primers 
• Fluoróforo disponível em suspensão 
• Curva de dissociação 
• Não permite multiplex 
 
22 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Sistemas de Detecção 
O corante liga-se 
imediatamente a todos os 
dsDNA 
Amplificação dos genes 
alvos 
O corante liga-se a cada 
nova cópia de dsDNA alvo 
23 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Sistemas de Detecção 
O corante liga-se a todos as moléculas 
de dsDNA 
Quando o DNA é desnaturado, o corante 
dissocia-se 
Polimerização é completada. O corante 
liga-se ao produto de dsDNA e a 
fluorescência aumenta 
Início da fase de anelamento de primers 
24 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Sistemas de Detecção 
Oligonucleotídeos Marcados 
• Detecta produtos específicos 
• Permite Multiplex 
• Não necessita curva de dissociação 
• Sondas 
o Corante reporter 5’ (fluorescente) e Corante quencher 3’ (silenciador) 
25 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Sistemas de Detecção 
26 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Sistemas de Detecção 
27 
Princípios da PCR em Tempo Real 
Máquinas 
Corbett 
Rotor Gene 6000 
Stratagene 
Mx series 
Eppendorf 
Mastercycler ep realplex 
28 
Máquinas 
Qiagen 
Rotor Gene Q 
Roche 
LigthCycler 
Bio-Rad 
29 
Máquinas 
Applied Biosystems 
7300/7500/7500 Fast/Step One/ Step One Plus 
30 
Máquinas 
Illumina 
EcoTM Real-Time PCR System 
31 
Eco Real-Time PCR System 
32 
Eco Real-Time PCR System 
33 
Ensaios 
Quantificação Absoluta 
• Correlacionar o número de cópias virais vs. estado de 
uma doença – DNA/RNA 
 
Quantificação Relativa 
• Analisar alterações na expressão gênica em determinada 
amostra relativa à outra amostra de referência (controle 
não tratado) → Transcrição - RNAm 
34 
Quantificação Absoluta 
Curva Padrão 
• Método para determinar o número exato de moléculas 
(cópias de DNA ou ng de DNA) 
• Determinar a concentração inicial de uma amostra de 
concentração desconhecida a partir de uma curva padrão 
de concentração conhecida 
o 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng 
35 
Quantificação Absoluta 
Curva Padrão 
• Otimização e Validação dos primers 
• “Standard” x Amostras Testes 
• Amplificação 
• Determinar a quantidade de “alvo” 
• Parâmetros para conversão de concentração 
o ng/µl → moléculas/µl 
36 
Quantificação Relativa 
• Método da Curva Padrão 
o Exige menor quantidade de otimização e validação 
• Método CT Comparativo 
o Semelhante ao método da CP, porém utiliza-se fórmulas 
aritméticas 
o Experimento de validação – eficiência da amplificação do alvo e 
do controle deverão ser ≈ iguais 
o Aumenta rendimento (número de poços na placa) 
o Elimina erro de diluição das amostras 
37Quantificação Relativa 
• Genes Alvo 
o Genes de interesse 
 
• Genes Endógeno – Referência 
o Gene de expressão estável sob diferentes situações testadas 
o Normalização de dados – Correção das variações entre amostras 
 
38 
Quantificação Relativa 
Método CT Comparativo – Método 2-ΔΔCt 
• Eficiência das amplificações 90 – 110% 
• Software já calcula 
• Comparação dos valores CT amostras/controle 
normalizados por genes endógenos 
 ΔΔCT= ΔCTamostra - ΔCTreferência 
 
39 
Quantificação Relativa 
Gene expression fold-change values derived from qPCR data. The changes in expression of four 
genes: glucose-6-phosphate isomerase (GPI); granulysin (GNLY); granzyme B (GZMB); and granzyme H 
(GZMH) in MCF-affected tissues were normalised to ribosomal protein S9 (RPS9) and plotted with 
respect to equivalent tissues from control animals. Results of kidney transcript assays are in the light 
columns while results of lymph node assays are in the dark columns 
Russell et al 2012. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus 
Research v169, p.246 – 254. 40 
Bibliografia 
• Creating Standard Curves with Genomic DNA or Plasmid DNA Templates for Use in 
Quantitative PCR 
http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf 
• EcoTM Real-Time PCR System User Guide http://www.illumina.com/ecoqpcr 
• Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time 
Quantitative PCR. Disponível em: http://www.gu.se/digitalAssets/1125/1125331_ABI_-
_Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf Acesso em 08 de abril de 
2013. 
• Higuchi R et al (1993). Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification 
reactions. Biotechnology Nature Publishing Company 11, 1026-1030. 
• Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression data using 
realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) ) method. Methods 25, 402-408. 
• Oliveira TMS (2010). PCR em tempo real: métodos e aplicações. Dissertação de 
Mestrado. Universidade de Aveiro 
• Russell et al (2012) Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine 
herpesvirus 1. Virus Research v169, p.246 – 254. 
 
41 
http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf
http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf
http://www.illumina.com/ecoqpcr
http://www.illumina.com/ecoqpcr
http://www.gu.se/digitalAssets/1125/1125331_ABI_-_Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf
http://www.gu.se/digitalAssets/1125/1125331_ABI_-_Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf
http://www.gu.se/digitalAssets/1125/1125331_ABI_-_Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf
http://www.gu.se/digitalAssets/1125/1125331_ABI_-_Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf
ANÁLISE TRANSCRICIONAL DO 
PATÓGENO Enterococcus faecalis 
VANCOMICINA RESISTENTE 
DOUTORANDA: TIANE MARTIN DE MOURA (BOLSISTA CAPES) 
ORIENTADORA: PROFA. DRA. ANA PAULA GUEDES FRAZZON 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM 
MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE 
42 
http://www.ufrgs.br/ufrgs/
Justificativa e Objetivos 
A espécie E. faecalis 
• Comensal potencialmente patogênica 
• Desenvolve estratégias para detectar, responder e se adaptar a 
ambientes hostis – oportunista 
• Relevância clínica – infecções x tratamento 
o Verificar o comportamento de uma cepa EVR em ambiente simulado 
frente à vancomicina 
o Analisar a regulação in vitro de alguns genes relacionados a virulência 
o Avaliar o conjunto de transcritos gerados 
 
43 
 
In Vitro Evaluation of Biofilm Formation and Expression of Virulence-Related 
Genes in Vancomycin Resistant Enterococcus Faecalis Isolated from Urinary 
Tract Infection 
 
 
 
44 
Objetivo 
• Avaliar a resposta apresentada por uma cepa de E. 
faecalis Vancomicina Resistente em um ambiente 
simulado acrescido de urina (simulação de ITU) frente à 
Vancomicina 
• Expressão de genes relacionados a virulência 
45 
Resultados e Discussão 
qPCR 
Expressão de genes de relacionados à virulência de VRE em caldo 2xYT/Urina tratados com vancomicina em 
comparação ao controle (sem vancomicina) (* p ≤ 0,05). 
46 
0
20
40
60
80
100
bopA* bopC* vanA*
F
o
ld
 C
h
a
n
g
e
s 
tuf
Conclusão 
• A presença de vancomicina é capaz de estimular a regulação 
de genes importantes na formação de biofilme 
• A vancomicina induz a auto-expressão do vanA 
• Administração de vancomicina pode estar contribuindo para o 
aumento da virulência em isolados clínicos portanto, é 
extremamente necessário ter cautela na prescrição deste 
antimicrobiano 
 47 
Obrigada! 
tianedemoura@gmail.com