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RESUMO M1 MICROBIOLOGIA Estudo dos microrganismos que podem ser vistos apenas com auxílio de microscópios, contribuem para o equilíbrio do meio ambiente. Encontrados em todos os ecossistemas: • Oceano e água doce: base da cadeia alimentar • Solo: fixadores de N e na decomposição de matéria orgânica • Metabolismo humano: auxiliam na síntese de vitaminas do complexo B e vitamina K Nomenclatura • Sistema criado por Carlous Linneaus (1735) Staphylococcus aureus Gênero Espécie Escritos sempre em itálico ou sublinhados. DIFERENÇAS DAS CÉLULAS PROCARIOTAS E EUCARIOTAS TIPOS DE MICRORGANISMOS Bactérias Organismos unicelulares Procariotas Parede celular formada de peptideoglicano Archaea Arquibactérias Vida livre Quando tem parede celular não é formada de peptideoglicano Metanogênicas – metano como resultado do metabolismo Halofílicas – amigas do sal – ambientes com alta salinidade Termofílicas – altas temperaturas Conhecidas como “extremófilos” Não são patogênicas ao homem Fungos Eucariotas uni ou multicelulares Reprodução assexuada ou sexuada Parede celular composta de quitina Ex: • Leveduras • Bolores Absorção de soluções de nutrientes obtidas da matéria orgânica Patógenos oportunistas – micoses Protozoários Unicelulares eucariotas Movimentam-se por emissão de pseudópodos ou através de flagelos, cílios, membranas flutuantes Vida livre Parasitas humanos Algas Unicelulares eucariotas fotossintéticos Vida livre Ambientes aquáticos Vírus Acelulares Envelope externo lipídico Núcleo contendo DNA ou RNA Necessitam de outra célula para replicação. Classificação – Carl Woese – 1978 Bactéria: as paredes celulares contêm um complexo carboidrato- proteína chamado de peptideoglicano. Archaea: as paredes celulares, se presentes, não possuem peptideoglicano. Eukarya, que inclui os seguintes grupos: Protista: fungos gelatinosos, protozoários e algas. Fungi: leveduras unicelulares, bolores multicelulares e cogumelos. Plantae: que inclui musgos, samambaias, coníferas e plantas com flores. Animalia: que inclui esponjas, vermes, insetos e vertebrados. Histórico Microbiologia como ciência – 200 anos DNA de Mycobacterium tuberculosis isolado em uma múmia egípcia de 3000 anos 1665 – Robert Hooke – descrição da célula Anton van Leeuwenhoek – 1673 – 1723 Descrição dos “animálculos” Teoria da Geração espontânea ou biogênese Prevaleceu até 1861 Louis Pasteur Princípios da Assepsia Pasteurização – método que utiliza o calor para destruir bactérias que possam deteriorar alimentos A relação entre a deterioração de alimentos e microrganismos auxiliou na descoberta da relação de patogenias e microrganismos. Idade de ouro da microbiologia • 1857 a 1914 Nascimento da quimioterapia moderna Busca por uma “bala mágica” – destruir o patógeno sem afetar o hospedeiro Paul Erlich 1910 - salvarsan – derivado arsênico efetivo contra a sífilis 1930 – drogas sintéticas derivadas de corantes industriais e síntese das sulfonamidas 1928 – descoberta da penicilina por Alexander Fleming Testada clinicamente e produzida na década de 1940 Uso indiscriminado dos antimicrobianos tem levado a seleção de cepas bacterianas resistentes. Bactérias multirresistentes Staphylococcus MRSA Enterococcus resistentes a Vancomicina KPC – Klebisiella produtora de Carbapenemases Ecologia microbiana C, N, O, S e P são essenciais para a manutenção da vida e abundantes, mas não necessariamente nas formas que possam ser utilizados pelos organismos. Microrganismos convertem esses elementos em formas que podem ser utilizadas por plantas e animais. Bactérias e fungos, têm um papel essencial no retorno do dióxido de carbono para a atmosfera quando decompõem resíduos orgânicos, plantas e animais mortos. Algas, cianobactérias e plantas superiores utilizam o dióxido de carbono durante a fotossíntese para produzir carboidratos para animais, fungos e bactérias. • Tratamento de esgoto • Limpeza de derramamentos de petróleo • Controle biológico de pragas na agricultura Biotecnologia Com o auxílio de técnicas de DNA recombinante, as bactérias podem produzir substâncias importantes como proteínas, vacinas e enzimas. Na terapia gênica, os vírus são usados para transportar substitutos para os genes defeituosos ou ausentes em células humanas. Bactérias geneticamente modificadas são utilizadas na agricultura para proteger as plantas contra insetos e contra o frio, e para prolongar o tempo de prateleira de um produto. Microbiota Normal ou Flora Espécies bacterianas residentes em nosso organismo e que não causam doenças Impedem o desenvolvimento de bactérias patogênicas Síntese de vitaminas (complexo B e vitamina K) Biofilme Agregação complexa de microrganismos • Doença infecciosa Patógeno invade um hospedeiro suscetível e nele efetua pelo menos uma parte de seu ciclo vital Doenças infecciosas emergentes • Ebola • Zika • Chickungunya • Dengue • HIV • Febre amarela • Covid • Vírus Marburg MORFOLOGIA BACTERIANA E TÉCNICAS DE VISUALIZAÇÃO. Unidade padrão é o metro (m) Em microbiologia utilizamos unidades como o: µm = 0,000001 m (10-6m) nm = 0,000000001 m (10-9m) Microscopia ótica O microscópio óptico composto (MO) moderno possui uma série de lentes e utiliza a luz visível como fonte de iluminação Assim podemos examinar amostras muito pequenas, bem como parte de seus detalhes. Uma série de lentes finamente polidas forma uma imagem claramente focada, que é muitas vezes maior que a amostra em si. Essa ampliação é obtida quando os raios de luz de um iluminador, a fonte de luz, passam através de um condensador, que possui lentes que direcionam os raios de luz através da amostra. A seguir, os raios de luz passam para as lentes objetivas, as lentes mais próximas da amostra. A imagem da amostra é novamente ampliada pela lente ocular. Podemos calcular a ampliação total de uma amostra multiplicando a ampliação da lente objetiva pela ampliação da lente ocular. A resolução é a capacidade das lentes de diferenciar detalhes e estruturas. Especificamente, refere-se à capacidade das lentes de diferenciar entre dois pontos separados a uma determinada distância. MICROSCOPIA Refração O índice de refração é a medida da capacidade de curvatura da luz em um meio. Para se obter uma imagem clara e finamente detalhada em um microscópio óptico composto, as amostras devem ser preparadas para contrastarem nitidamente com o seu meio. Para preservar a direção dos raios de luz na maior ampliação, óleo de imersão é colocado entre a lâmina de vidro e a lente objetiva de imersão. MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO Sob condições normais de funcionamento, o campo de visão em um microscópio óptico composto é claramente iluminado. Ao focalizar a luz, o condensador produz uma iluminação de campo claro. MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO Utilizada para examinar microrganismos vivos que são invisíveis ao microscópio óptico comum. Em vez do condensador normal, um microscópio de campo escuro utiliza um condensador de campo escuro, que contém um disco opaco. O disco bloqueia a luz que poderia entrar na lente objetiva diretamente. Somente a luz que é refletida para fora (devolvida) da amostra entra na lente objetiva. Uma vez que não há luz de fundo direta, a amostra aparece iluminada contra um fundo preto – o campo escuro. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE Princípio: Baseia-se na natureza das ondas dos raios de luz e no fato de que os raios luminosos podem estar em fase ou fora de fase. Se o pico deonda dos raios luminosos de uma fonte coincide com o pico de onda da outra fonte, os raios interagem para produzir reforço (brilho relativo). Entretanto, se o pico de onda de uma fonte luminosa coincide com a parte inferior da onda de outra fonte de luz, os raios interagem para produzir interferência (escuridão relativa). Não é necessária a coloração para visualizar as estruturas Um conjunto de raios luminosos sai diretamente da fonte de luz. O outro conjunto é derivado da luz que é refletida ou difratada de uma estrutura particular na amostra. “Difração”: é a dispersão dos raios luminosos quando eles “tocam” a borda de uma amostra. Os raios difratados são curvados para longe dos raios de luz paralelos que passam mais distante da amostra. Quando os dois conjuntos de raios de luz – diretos e refletidos ou refratados – são reunidos, formam uma imagem da amostra na lente ocular, contendo áreas que são relativamente claras (em fase) e vários tons de cinza até a cor preta. MICROSCOPIA DE CONTRASTE COM INTERFERÊNCIA DIFERENCIAL (CID) Utiliza as diferenças nos índices de refração. Entretanto, um microscópio CID utiliza dois feixes de luz em vez de um. Prismas separam cada feixe de luz, adicionando cores contrastantes à amostra. A resolução de um microscópio CID é maior que a de um microscópio de contraste de fase padrão. A imagem também apresenta cores brilhantes e parece quase tridimensional MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA É a capacidade das substâncias de absorver curtos comprimentos de ondas de luz (ultravioleta) e produzir luz em um comprimento de onda maior (visível). Podem ter emissão espontânea ou quando a bactéria é marcada com anticorpos e fluorocromos. MICROSCOPIA CONFOCAL Técnica na microscopia óptica utilizada para reconstruir imagens tridimensionais. Assim como na microscopia de fluorescência, as amostras são coradas com fluorocromos para que emitam, ou devolvam, a luz. Contudo, em vez da iluminação do campo todo, na microscopia confocal um plano de uma pequena região da amostra é iluminado com uma luz de pequeno comprimento de onda (azul), que passa a luz devolvida através de uma abertura alinhada com a região iluminada. MICROSCOPIA ELETRÔNICA Objetos < 0,2 µm Feixe de elétrons ao invés de feixe luminosos Lente eletromagnética para focalizar o feixe de elétrons. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO Um feixe de elétrons finamente focalizado de um canhão de elétrons passa através de um corte ultrafino da amostra, especialmente preparado. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA Um feixe de elétrons finamente focalizado varre a superfície do objeto em estudo, desprendendo elétrons que são captados pela lente eletromagnética. As imagens formadas são tridimensionais. • Técnicas de preparo de amostras: As amostras devem ser depositadas em lâmina de vidro, limpas e desengorduradas O esfregaço deve ser fino o bastante para que permita a passagem do feixe luminoso Esfregaços muito espessos não permitem a visualização das estruturas podendo interferir na coloração e identificação Os esfregaços deverão secar a temperatura ambiente Após fixar rapidamente em chama (bico de gás). • Corantes: São sais compostos por um íon positivo e um íon negativo, um dos quais é colorido e conhecido como cromóforo. A cor dos assim chamados corantes básicos está no íon positivo; em corantes ácidos, está no íon negativo. As bactérias são levemente carregadas negativamente em pH 7. Desse modo, o íon positivo colorido em um corante básico é aderido à célula bacteriana carregada negativamente. Ex: cristal violeta, o azul de metileno, o verde de malaquita e a safranina, TIPOS DE COLORAÇÃO Simples Utiliza um único corante que é aplicado sobre o esfregaço, aguarde- se o tempo de fixação, lava-se a lâmina e faz-se a observação Ex: azul de metileno, cabolfucsina, cristal violeta e Safranina Colorações diferenciais Reagem de modo distinto com diferentes tipos de bactérias, podendo assim ser usadas para diferenciá-las. Coloração de Gram Hans Christian Gram – 1884 Técnica: O esfregaço é recoberto com corante básico púrpura (cristal violeta ou violeta genciana) – 1 min. Escorre o corante, aplica-se uma solução de Lugol (tintura de iodo + iodeto de potássio) por 1min 30 seg Lava-se a lâmina com água corrente e aplica-se solução de álcool- acetona até descorar o esfregaço Aplica-se corante básico vermelho (safranina ou fucsina) 10 segundos Lava-se a lâmina. Coloração álcool-ácido resistente O corante básico se liga fortemente apenas a bactérias que possuem material céreo em suas paredes celulares. Técnica: O esfregaço é recoberto com fucsina e é esquentado várias vezes até o ponto de liberar vapor Após é aplicado um descorante álcool+ácido Em seguida é aplicada uma solução de azul de metileno como contraste. COLORAÇÕES ESPECIAIS Coloração negativa para cápsulas Tinta nanquim ou nigrosina. Coloração para endosporos Não podem ser corados pelos métodos comuns, como a coloração simples e a coloração de Gram, pois os corantes não penetram a parede do endosporo. Técnica de Schaeffer-Fulton. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE CÉLULAS EUCARIOTAS E PROCARIOTAS Tamanho, forma e arranjo das células bacterianas 0,2 a 2 µm diâmetro e 2 a 8 µm comprimento Apresentam-se na forma de: Cocos: redondos, ovais ou achatados Bacilos Espirais COCOS Podem permanecer unidos ao dividirem-se Diplococos – aos pares Tétrades – 4 cocos Sarcinas – 8 cocos Estafilococos – cacho de uva Estreptococos – em cordão, cadeia. BACILOS Dividem-se apenas no sentido de seu eixo mais curto Menor número de arranjos ESPIRAIS Bacilos curvos – vibriões Espirilos – forma de saca rolha e com estrutura rígida Espiroquetas – forma helicolidal e flexível Filamentos axiais – movimento. Estruturas externas a parede celular Glicocálice: polímero viscoso e gelatinoso que está situado externamente à parede celular e é composto de polissacarídeo, polipeptídio ou ambos. Sua composição química varia amplamente entre as espécies. Produzido dentro da célula e secretado para a superfície celular. Cápsula: se organizado e firmemente aderido à parede celular Camada viscosa: se desorganizado e fracamente aderido à parede celular Funções: Impedir a fagocitose • Bacillus anthracis • Streptococcus pneumoniae • Klebsiella pneumoniae – impede a fagocitose e promove a aderência ao trato respiratório Formação de biofilme: Substância polimérica extracelular (SPE). A SPE protege as células dentro do glicocálice, facilita a comunicação entre as células e permite a sobrevivência celular pela fixação a várias superfícies em seu ambiente natural. • Streptococcus mutans, causador de cárie dentária • Vibrio cholerae, fixação na parede intestinal Flagelos Apêndices filamentosos – movimento Tipos: • Atríqueas – sem flagelos • Peritríqueos Polares: • Monotríqueos • Anfitríqueos • Lofotríqueo Composição: um flagelo tem três partes básicas: A longa região mais externa o filamento tem diâmetro constante e contém a proteína globular flagelina (grosseiramente esférica), distribuída em várias cadeias que se entrelaçam e formam uma hélice em torno de um centro oco. Na maioria das bactérias, os filamentos não são cobertos por uma membrana ou bainha, como nas células eucarióticas. O filamento está aderido a um gancho ligeiramente mais largo, consistindo de uma proteína diferente. Corpo basal: Composto de uma pequena haste central inserida em uma série de anéis. As bactérias gram-negativas contêm dois pares de anéis; o par externo está ancorado a várias porções da parede celular,e o par interno está ancorado à membrana plasmática. Nas bactérias gram-positivas, somente o par interno está presente Corpo basal Cada flagelo procariótico é uma estrutura helicoidal semirrígida que move a célula pela rotação do corpo basal. A rotação de um flagelo pode ter sentido horário ou anti-horário em torno de seu eixo longo. O movimento de um flagelo procariótico resulta da rotação de seu corpo basal e é similar ao movimento da haste de um motor elétrico. À medida que os flagelos giram, formam um feixe que empurra o líquido circundante e propele a bactéria. A rotação flagelar depende da geração contínua de energia pela célula. O movimento permite a bactéria buscar um ambiente mais favorável Taxia – quimiotaxia; fototaxia Receptores dentro ou logo abaixo da parede celular Captam sinais químicos- O2, ribose, galactose Efeitos atraentes e repelentes Proteína flagelar H – útil para diferenciar diferentes populações dentro de uma espécie. Escherichia coli - 50 antígenos H ≠ Filamentos Axiais ou Endoflagelos As espiroquetas se movem por meio de filamentos axiais ou endoflagelos, feixes de fibrilas que se originam nas extremidades das células, sob uma bainha externa, e fazem uma espiral em torno da célula Esse movimento em forma de saca-rolha permite que a bactéria se movimente pelos fluidos corporais. Fímbrias e pili Muitas bactérias gram-negativas contêm apêndices semelhantes à pelos São mais curtos, retos e finos que os flagelos e que são usados mais para fixação e transferência de DNA que para mobilidade. Proteína denominada pilina, distribuída de modo helicoidal em torno de um eixo central Dois tipos, fímbrias e pili, possuindo funções muito diferentes. Fímbrias Podem ocorrer nos pólos ou espalhadas por toda a célula bacteriana Grande variação de número Tendência de se unir umas as outras ou a superfícies Formação de biofilme EX: infecção pela Neisseria gonorrohoeae, Escherichia coli uropatogênica Pili ( pilus) Normalmente são mais longos que as fímbrias, e há apenas um ou dois por célula. Estão envolvidos na mobilidade celular e na transferência de DNA. Translocação bacteriana, o pilus é estendido pela adição de unidades de pilina, faz contato com a superfície ou com outras células e então se retrai à medida que as unidades de pilina vão sendo desmontadas. Esse modelo é denominado modelo do gancho atracado da mobilidade de translocação e resulta em movimentos curtos, abruptos e intermitentes. • Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli Utilizados para agregar bactérias para transferência de DNA MEMBRANA CELULAR Principal função: permeabilidade seletiva Tem pouca resistência contra a lise celular Estrutura geral Bicamada fosfolipídica Proteínas da membrana: • Integrais: embebidas na estrutura da membrana • Periféricas: não estão embebidas na membrana, mas estão firmemente associadas a membrana Algumas dessas proteínas perife ́ricas de membrana sa ̃o lipoproteínas, mole ́culas que conte ̂m uma cauda lipi ́dica que faz a ancoragem a ̀ membrana. Normalmente, essas protei ́nas interagem com as protei ́nas integrais de membrana em importantes processos celulares, como metabolismo energe ́tico e transporte Funções da membrana plasmática Barreira de permeabilidade O citoplasma é uma solução de sais, açúcares, aminoácidos e nucleotídeos A porção hidrofóbica da membrana não permite a difusão dessas substâncias Moléculas polares e carregadas não conseguem se difundir e precisam ser carreadas Sítio de ancoragem de várias proteínas Proteínas transportadoras: transportam e acumulam solutos contra um gradiente de concentração Transporte ativo com custo energético Propriedades: • Efeito de saturação • Alta especificidade • Síntese regulada Sistemas de transporte Simples – apenas uma proteína transmembrânica Translocação de grupo – várias proteínas Sistema de transporte ABC consiste em tre ̂s componentes: • uma proteína de ligação ao substrato • um transportador integrado a ̀ membrana e • uma proteína que hidrolisa ATP Tipos de transporte Uniporte • Unidirecional Simporte • Cotransportadoras Antiporte • Transportam uma molécula pra dentro da célula enquanto transportam outra para fora Translocação de grupo Diferem do transporte simples: A substa ̂ncia transportada e ́ quimicamente modificada durante o processo de transporte, e um composto orga ̂nico rico em energia em vez da forc ̧a próton, motiva conduz o evento de transporte Proteínas periplasmáticas e sistema ABC • Bactérias Gram – Negativas, periplasma - região entre a membrana citoplasmática e a membrana externa • Proteínas periplasma ́ticas de ligac ̧a ̃o. Sistemas de transporte que conte ̂m protei ́nas periplasma ́ticas de ligac ̧a ̃o, bem como um transportador de membrana e proteínas que hidrolisam ATP, sa ̃o denominados sistemas de transporte ABC, sendo “ABC” um acro ̂nimo de ATPbinding- cassette (cassete de ligac ̧a ̃o a ATP).