Relatório - prática 1 (espectrofotometria)

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DANIELA MARIANO 
JULIANY BARRETO KISBERI 
KAREN RODRIGUES FERREIRA 
MARIA JÚLIA DA SILVEIRA ALVES MOREIRA 
RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA 1: 
ESPECTROFOTOMETRIA 
SÃO PAULO 
2020 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO 
EPM – ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DANIELA MARIANO 
JULIANY BARRETO KISBERI 
KAREN RODRIGUES FERREIRA 
MARIA JÚLIA DA SILVEIRA ALVES MOREIRA 
 
RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA 1: 
ESPECTROFOTOMETRIA 
 
Relatório da aula prática 1 – 
Espectrofotometria 
Universidade Federal de São Paulo 
Disciplina: Química Orgânica 
Biomedicina – turma 54 
Professores: Aparecida Sadae Tanaka, 
Alexandre Keiji Tashima, Patricia Alessandra 
Bersanetti 
SÃO PAULO 
2020 
 
 
 
SUMÁRIO 
OBJETIVO................................................................................................................................ 4 
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 4 
PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 5 
METODOLOGIA ................................................................................................................... 5 
MATERIAIS UTILIZADOS .................................................................................................. 5 
PROCEDIMENTO ................................................................................................................. 5 
DADOS OBTIDOS ................................................................................................................... 6 
DISCUSSÃO DE DADOS ...................................................................................................... 10 
CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 11 
ANEXO .................................................................................................................................... 12 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 13 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
OBJETIVO 
 
Quantificar a concentração da amostra desconhecida e das soluções diluídas de azul de bromo-
fenol por meio do espectrofotômetro de UV-Vis; determinar o máximo de absorção da solução 
de violeta de azul de bromofenol; verificar e consolidar os conceitos do princípio da lei de 
Lambert-Beer e da diluição. 
 
INTRODUÇÃO 
 
O sal de sódio do azul de bromofenol (3′,3′′,5′,5′′ - tetrabromofenolsulfonftaleína de sódio), de 
especificação Sigma-Aldrich e código B5525, é um corante de pH acima de 4,6; atua como 
indicador de pH que vira entre o pH 3,0 e 4,6 de amarelo-azul para violeta, respectivamente. 
Esse composto permite a visualização da corrida eletroforética de fragmentos de DNA ou 
proteínas, para monitorar a migração de moléculas em eletroforese em gel de algum reagente 
de alta densidade (como sacarose ou glicerol), uma vez que ele que migra com mais facilidade 
indicando a localização da frente da eletroforese. 
 
Esse corante facilita a aplicação da amostra no gel (acrescentam cor na amostra) e auxiliam no 
monitoramento da corrida, já que apresentam velocidade conhecida durante a migração na 
matriz em direção ao pólo positivo. 
 
A espectroscopia é o estudo da interação entre a matéria e a radiação eletromagnética — energia 
radiante que apresenta tanto as propriedades de partículas quanto as de ondas. Um grande 
número de diferentes técnicas espectrofotométricas é utilizado para identificar substâncias. A 
espectroscopia no UV/Vis fornece informação sobre as substâncias com ligações duplas 
conjugadas, as quais são presentes na ligação entre enxofre e oxigênio (S=O) e carbono e 
oxigênio (C=O), além dos anéis aromáticos do sal de sódio do azul de bromofenol. A luz 
ultravioleta e a luz visível possuem apenas energia suficiente para provocar uma transição 
eletrônica — a promoção de um elétron de um orbital para outro de maior energia. Dependendo 
da energia necessária para a transição eletrônica, a molécula absorverá a luz ultravioleta ou a 
luz visível. Se ela absorve a luz ultravioleta, um espectro de UV é obtido; se ela absorve luz 
visível, um espectro visível é obtido. A luz ultravioleta é a radiação eletromagnética com 
comprimentos de onda entre 180 e 400 nm (nanômetros); a luz visível possui comprimentos de 
onda entre 400 e 780 nm. 
 
A análise espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis, usando reagentes cromogênicos, 
como o sal de sódio do azul de bromofenol, é tradicionalmente realizada utilizando-se um 
reagente específico (DNA ou proteínas), separando-se o elemento de interesse de seus 
interferentes. 
 
O aparelho espectrofotômetro UV-Vis determina a absorbância da amostra: sal de sódio do azul 
de bromofenol. Neste experimento, tal dado tem o intuito de ser utilizado para identificação e 
determinação quantitativa do sal por meio de uma curva entre concentração (mol/L) e 
absorbância, a qual também gera a estimação da absorvidade molar (uma propriedade intrínseca 
das substâncias, como o sal de sódio do azul de bromofenol). Usa-se o princípio da lei de 
Lambert-Beer fundamentando-se no resultado da absorvidade de cada das soluções de diluição 
 
5 
 
seriada a partir de uma concentração conhecida (10,0 mM) para calcular a concentração molar 
do sal. 
 
PARTE EXPERIMENTAL 
 
1. METODOLOGIA 
Espectrofotometria. 
 
2. MATERIAIS UTILIZADOS 
▪ Azul de bromofenol (na forma de sal de sódio) – concentração de 10 mM; 
▪ Balança analítica; 
▪ Micropipetas automáticas; 
▪ Cubetas de plástico; 
▪ Agitador vortex; 
▪ Água ultrapura; 
▪ Espectrofotômetro. 
 
3. PROCEDIMENTO 
Antes de dar início ao experimento, é necessário zerar a balança com o tubo que será 
utilizado na pesagem e somente em seguida pesar o azul de bromofenol na balança 
analítica. Após tal pesagem, conclui-se que a amostra tem um peso equivalente a 0,0107 g 
de azul de bromofenol. 
 
Para obter uma amostra de 10 mM, utiliza-se uma micropipeta, para coletar 1 mL de azul 
de bromofenol - a pipetagem é feita em duas etapas, primeiro a quantidade desejada é 
pipetada e em seguida a gota em excesso é dispensada -, para isso só a ponta deve entrar 
em contato com o líquido, enquanto o êmbolo é elevado vagarosamente. Em seguida, é 
adicionada ao conteúdo pipetado água até atingir a concentração de 10 mM desejada - 
solução padrão. O tubo com a solução é então levado ao vortex para ser agitado e 
misturar-se. 
 
Em prol de obter uma solução de 200 M, a amostra é diluída 50 vezes e é novamente 
levada para o vortex. Essa solução obtida será utilizada para obter outras 6 soluções, de 20 
M, 15 M, 10 M, 5 M, 2,5 M e X M (concentração desconhecida, a ser calculada 
no decorrer do relatório). 
 
As soluções diluídas são então levadas para o espectrofotômetro - em cubetas de plástico -
, que fará a medição das respectivas absorbâncias, nesse processo é utilizada uma cubeta 
com água - solução referência ou “branco” - e uma cubeta com a solução que deseja saber 
a absorbância, que serão colocadas em diferentes compartimentos do espectrofotômetro. 
 
6 
 
 
Por fim, é utilizado um scanner de comprimento de ondas, para estabelecer um gráfico da 
absorbância do azul de bromofenol em função do comprimento de onda desse e suas 
melhores faixas de absorção e reflexão. 
 
 
DADOS OBTIDOS 
 
Cálculo da concentração da solução X: 
 
I. A partir dos dados fornecidos na aula prática acerca da absorbância da solução de água 
e de soluções de diferentes concentrações de azul de bromofenol (2,5 M, 5,0 M, 10 
M, 15 M e 20 M), foi possível obter um gráfico de absorbância em função daconcentração (Gráfico 1) . Esse gráfico tem uma linha de tendência equivalente à uma 
reta, levando à conclusão que a equação aproximada de absorbância por concentração é 
A = 0,0614 c - 0,0042 – onde A é absorbância e c equivale à concentração da amostra, 
em M; 
 
Gráfico 1: absorbância da solução de azul de bromofenol em função de sua 
concentração 
Fonte: acervo pessoal 
0
0,117
0,322
0,627
0,922
1,211
A = 0,0614c - 0,0042
R² = 0,9983
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 5 10 15 20 25
A
B
SO
R
B
Â
N
C
IA
CONCENTRAÇÃO (M)
 
7 
 
II. Sabendo que a absorbância da amostra X vale 0,779, temos que: 
0,779 = 0,0614 c – 0,0042 c = 12,756 M 
 
Cálculo do volume de água a ser adicionada na amostra de 1 mL de bromofenol puro, para 
formar uma solução de 10 mM: 
 
0,0107 g --- x mol azul de bromofenol 
691,94 g --- 1 mol azul de bromofenol x = 1,546.10-5 mol 
 
 10.10−3 mol --- 1 L solução 
1,546.10-5 mol --- V L de solução V = 1,546 mL 
 
Vágua = V – Vbromofenol puro Vágua = 546 L 
 
Cálculo do volume da solução de 10 mM necessário para fazer uma solução de 200 M de azul 
de bromofenol: 
 
10 mM
F
 = 200M F = 50 
 
VSI = 
VSF
F
 = 
1,5 mL
50
 VSI= 30 L 
 
VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 30 L + VÁGUA VÁGUA = 1,47 mL 
 
Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma 
solução de 20 M de azul de bromofenol: 
 
200 M
F
 = 20M F = 10 
 
VSI = 
VSF
F
 = 
1,5 mL
10
 VSI= 150 L 
 
VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 150 L + VÁGUA VÁGUA = 1,35 mL 
 
8 
 
 
Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma 
solução de 15 M de azul de bromofenol: 
 
200 M
F
 = 15M F = 
40
3
 
 
VSI = 
VSF
F
 = 
1,5 mL
40
3⁄
 VSI= 112,5 L 
 
VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 112,5 L + VÁGUA VÁGUA = 1,387 mL 
 
Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma 
solução de 10 M de azul de bromofenol: 
 
200 M
F
 = 10M F = 20 
 
VSI = 
VSF
F
 = 
1,5 mL
20
 VSI= 75 L 
 
VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 75 L + VÁGUA VÁGUA = 1,425 mL 
 
Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma 
solução de 5 M de azul de bromofenol: 
 
200 M
F
 = 5M F = 40 
 
VSI = 
VSF
F
 = 
1,5 mL
40
 VSI= 37,5 L 
 
VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 37,5 L + VÁGUA VÁGUA = 1,462 mL 
 
 
9 
 
Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma 
solução de 2,5 M de azul de bromofenol: 
 
200 M
F
 = 2,5M F = 80 
 
VSI = 
VSF
F
 = 
1,5 mL
80
 VSI= 18,75 L 
 
VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 18,75 L + VÁGUA VÁGUA = 1,481 mL 
 
Cálculo do volume da solução de 200 M de azul de bromofenol necessário para fazer uma 
solução de 12,756 M de azul de bromofenol: 
 
200 M
F
 = 12,756M F = 15,679 
 
VSI = 
VSF
F
 = 
1,5 mL
15,679
 VSI= 95,67 L 
 
VSF = VSI + VÁGUA 1,5 mL = 95,67 L + VÁGUA VÁGUA = 1,404 mL 
 
OBSERVAÇÃO: 
▪ F: fator de diluição; 
▪ VSF: volume da solução final; 
▪ VSI: volume necessário da solução inicial; 
▪ VÁGUA: volume de água que deve ser adicionado. 
 
Obtenção do gráfico de absorbância em função do comprimento de onda do azul de bromofenol, 
que seria obtido em uma experimentação presencial e que faz parte dos objetivos do relatório 
da aula prática – maior absorbância para comprimentos de onda de 590 nm, melhor absorção 
do amarelo e reflexão da faixa do violeta e azul: 
 
10 
 
Gráfico 2: varredura de comprimento de onda (Wavelength scan) 
COMPRIMENTO DE ONDA (nm) 
Fonte: Online Lab 
 
DISCUSSÃO DOS DADOS 
O 3′,3′′,5′,5′′ - tetrabromofenolsulfonftaleína de sódio pode ser utilizado no experimento, pois 
as características do anel aromático do composto (figura 1) possibilitam o efeito de absorção de 
radiação eletromagnética da faixa do visível - emitida pelo equipamento espectrofotômetro -, 
graças aos orbitais p da ligação dupla conjugada. Nesse contexto, os elétrons transitam do 
orbital de menor energia (ligação π) para o de maior energia (ligação π não ligante). 
 
Partindo de uma solução padrão de 10 mM - solução padrão, ou seja, uma solução de 
concentração conhecida e muito utilizada para análises volumétricas -, obtida a partir de 1 mL 
de azul de bromofenol puro e 546 L de água (o cálculo do volume de água foi estabelecido 
por duas regras de três sequenciais), foi feita a diluição para chegar à concentração de 200 M 
e, a partir dessa, é realizada a diluição seriada para chegar nas soluções de concentração: 20 
μM, 15 μM, 10μM, 5 μM, 2,5 μM e a solução X (c=12,756 M – concentração encontrada por 
meio da equação da linha de tendência do gráfico 1, montado com base nos dados fornecidos 
na aula prática). A diluição seriada é um importante método pois permite fazer diversas 
diluições usando uma pequena quantidade de água quando comparada a uma diluição direta 
que usaria uma quantidade muito maior e obter soluções extremamente diluídas com muita 
precisão. Para descobrir o volume necessário de água para se obter tais concentrações foi 
encontrado o fator de diluição (F), referente à cada solução desejada, e, por meio desse, 
calculou-se quanto da solução de concentração 200 M e quanto de água seriam necessárias 
para formar soluções de 1,5 mL das concentrações supracitadas - para isso foi usada a fórmula 
Vsf/Vsi = F. 
 
Em tal equipamento fotométrico, além das cubetas de plástico contendo a amostra diluída, 
também é adicionado em outro compartimento uma solução referente (ou “branco”) de água 
destilada, pois é essencial para a construção gráfica da absorbância vs concentração utilizando 
A
B
S
O
R
B
Â
N
C
IA
 
 
11 
 
a os princípios da lei de Lambert-Beer, uma vez que essa referência demonstra a comprovação 
entre uma solução com ou sem a amostra. 
 
Ao traçar a linha de tendência no gráfico (Gráfico 1) e calcular a equação da reta e o seu 
coeficiente de determinação resultando desse princípio, descobrimos que o coeficiente de 
determinação (R2) foi próximo de 1, isso demonstra que o experimento teve uma boa 
aproximação, sem grandes desvios, como esperado. 
 
Devido às propriedades físico-químicas do corante analisado, nessa prática também foi 
estabelecida a relação entre a absorbância em decorrência do comprimento de onda do azul de 
bromofenol (Gráfico 2), que mostrou-se máxima para 590 nm (coloração amarelada), e 
transmitância de 450 nm (coloração azulada). 
 
CONCLUSÃO 
 
Utilizando o espectrofotômetro foi possível determinar que a absorbância da solução AB-X é 
igual a 0,779 e, a partir da equação resultante do gráfico de absorbância pela concentração 
(Gráfio 1), gerado com base nos dados fornecidos durante a prática, foi possível determinar que 
a concentração dessa da amostra do sal de sódio do azul de bromofenol é igual a 12,756 M. 
 
A partir dos valores obtidos da diluição seriada, do espectrofotômetro e da construção do 
gráfico com os resultados pode-se concluir que o objetivo do experimento foi alcançado, pois 
foi possível calcular a concentração da amostra AB-X, o volume necessário de água necessáriopara formar uma solução padrão de 10 mM a partir de 1 mL de azul de bromofenol puro, os 
volumes empregados para resultar em uma solução de 200 M a partir da solução padrão de 10 
mM e quantidade volumétricas precisas para originar soluções de 20 M, 15 M, 12,756 M, 
10 M, 5 M e 2,5 M, tendo como base a solução de 200 M. 
 
Ao analisar os dados fornecidos em conjunto com os dados obtidos, pode-se concluir que 
conforme a concentração da solução de azul de bromofenol aumenta maior é a absorbância, o 
que mostra que a Lei de Lambert-Beer é válida na prática. 
 
Além do que já foi apontado, tal experimento ainda mostrou que a absorbância máxima do azul 
de bromofenol se dá quando seu comprimento de onda é 590 nm (Gráfico 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
ANEXO 
 
Figura 1: composição molecular do azul de bromofenol (sal de sódio) 
Fonte: MERCK 
 
 
 
 
13 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
• CORRÊA, E. A ANÁLISE DE DNA POR ELETROFORESE. Disponível 
em:<http://www.ciencianews.com.br/index.php/ciencia/biologia-molecular/biologia-
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em:<https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=B
R&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https
%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophe
nol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3D
pt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct>. Acesso em 15 de agosto de 2020 às 
18h43min; 
• MERCK. Bromophenol Blue sodium salt. Disponível 
em:<https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/114405?lang=pt&region=BR
>. Acesso em 15 de agosto de 2020 às 19h39min; 
• SALDANHA, T. Análise multicomponente simultânea por espectrofotometria de 
absorção molecular UV-VIS. Disponível 
em:<https://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-
40421999000600012&script=sci_arttext&tlng=pt>. Acesso em 15 de agosto de 2020 às 
18h52min; 
▪ BRUICE, P. Química Orgânica - 4ª Edição - Volume 1. Disponível 
em:<https://docero.com.br/doc/10s05>. Acesso em 15 de agosto de 2020 às 19h01min; 
▪ ONLINE LAB. The Fading of Bromophenol Blue. Disponível em: 
<https://sites.google.com/a/wellesley.edu/chem-105-online-lab-manual/labs/12-the-
fading-of-bromophenol-blue>. Acesso em 24 de agosto de 2020 às 12h59min. 
 
http://www.ciencianews.com.br/index.php/ciencia/biologia-molecular/biologia-molecular-tecnicas-moleculares/
http://www.ciencianews.com.br/index.php/ciencia/biologia-molecular/biologia-molecular-tecnicas-moleculares/
https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=BR&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophenol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3Dpt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct
https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=BR&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophenol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3Dpt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct
https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=BR&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophenol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3Dpt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct
https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=BR&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophenol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3Dpt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct
https://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=BR&language=pt&productNumber=B5525&brand=SIGMA&PageToGoToURL=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fsearch%3Fterm%3Dbromophenol%2Bblue%26interface%3DAll%26N%3D0%26mode%3Dpartialmax%26lang%3Dpt%26region%3DBR%26focus%3Dproduct
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/114405?lang=pt&region=BR
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/114405?lang=pt&region=BR
https://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40421999000600012&script=sci_arttext&tlng=pt
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https://docero.com.br/doc/10s05
https://sites.google.com/a/wellesley.edu/chem-105-online-lab-manual/labs/12-the-fading-of-bromophenol-blue
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