RELATÓRIO IMUNOFLURECENCIA INDIRETA

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IMUNOFLUORESCÊNCIA 
INDIRETA 
 
Disciplina: Imunologia 
 
Alunos: Caio Monteiro 
 Gustavo Júnior 
 João de Napole 
 
Professores: Rodrigo Bisaggio 
 Joanna Oliveira 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
O imunodiagnóstico é um ramo de diagnósticos laboratoriais o qual utiliza 
propriedades do sistema imune para a identificação de antígenos (Ag). O procedimento o 
qual foi realizado e será discutido nos próximos tópicos é a imunofluorescência indireta (IFI). 
Para que haja um melhor entendimento do procedimento, faz-se necessário a compreensão 
da base teórica por trás do procedimento, portanto neste tópico irá ser abordado o 
funcionamento da IFI. 
A imunofluorescência indireta é uma técnica de microscopia pela qual uma amostra 
biológica é marcada com biomoléculas. Essas biomoléculas são os anticorpos e eles 
possuem alta especificidade e afinidade por uma determinada molécula, sendo esta 
molécula chamada de antígeno. 
Na IFI os anticorpos são conjugados a moléculas fluorescentes, denominadas 
fluoróforos. Quando expostos a uma certa faixa de frequência do espectro ultravioleta, os 
fluoróforos passam a emitir uma frequência do espectro visível de seres humanos, sendo 
essa frequência analisada através do auxílio de microscópio. Portanto, a imagem a qual irá 
ser visualizada através do microscópio serão apenas de Ag que estão ligados a esse 
anticorpo. 
No momento pelo qual o ser humano é exposto a corpos não pertencentes do 
organismo e este corpo estranho é reconhecido como não próprio (sendo este denominado 
antígeno ou Ag), o sistema imune inicia um processo de eliminação do Ag não próprio para 
que este não traga nenhum malefício a homeostasia do organismo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Imagem I: ilustração da estrutura de uma 
imunoglobulina. 
 
 
 
Logo após o reconhecimento antigênico, o Ag é transportado a estruturas as 
quais contêm os linfócitos. Quando ativado, o linfócito B libera proteínas que 
combaterão o antígeno. As proteínas que são liberadas são chamadas de 
imunoglobulinas (Ig), possuindo diferentes funções, dependendo da classe 
pertencente. Após serem liberadas, essas moléculas proteicas começam a circular 
pela corrente sanguínea e/ou permanecem nas mucosas, essas imunoglobulinas 
são chamadas de anticorpos (Ac). As classes de imunoglobulinas são ao todo 5, 
sendo elas a IgA, IgG, IgD, IgE e IgM. Cada classe de imunoglobulina possui 
 
afinidade para diferentes tipos de antígenos. A imagem abaixo representa a 
estrutura de um anticorpo. 
A partir da análise da imagem 1 é possível visualizar que anticorpos possuem 
quatro cadeias, sendo elas duas denominadas pesadas, as cadeias na parte interior 
da molécula, e 2 denominadas leves, são as cadeias na parte exterior da molécula. 
No decorrer das cadeias existem domínios denominados de domínios de Ig, estes 
podem ser visualizados como dobramentos da cadeia. 
A parte representada em laranja na imagem 1 representa o conjunto de 
domínios os quais possuem diferentes sequências de aminoácidos para diferentes 
Ag’s. Logo, essa região é a aquela que irá ligar-se de forma altamente específica 
aos Ag’s. 
Utilizando esse conhecimento para a IFI, é possível realizar essa ligação ​in 
vitro, ​o que irá possibilitar que o processo como um todo seja possível. Porém, para 
que ocorra esse processo, é necessário que haja a obtenção do anticorpo o qual 
possuirá especificidade para o Ag alvo. O processo pelo qual é realizada a obtenção 
desse Ac é através da inoculação, isto é, isolamento do anticorpo, em um animal 
que não possua esse Ag naturalmente. Após produção de anticorpos através dos 
linfócitos B, os Ac estarão circulando na corrente sanguínea e, portanto, uma 
amostra do sangue desse animal será coletada. Após a coleta do sangue do animal, 
essa amostra irá ser centrifugada para que haja obtenção do soro sanguíneo, local 
o qual encontram-se os Ac’s. 
Ao final da obtenção dos anticorpos, estes serão conjugados com um 
fluoróforos. Devido ao fato que esta técnica é de imunofluorescência indireta, é 
necessário repetir o processo anterior, porém utilizando o anticorpo obtido como o 
antígeno. Deste modo, o anticorpo primeiramente obtido torna-se o anticorpo 
primário e o Ac obtido por último passa a ser chamado de anticorpo secundário. 
 
 
2. OBJETIVOS 
 
Esta aula prática de imunologia teve como principal objetivo a realização de um dos 
possíveis métodos de imunodiagnóstico. Visando a possível identificação do antígeno pelos 
anticorpos, assim concluindo, caso haja anticorpos para o antígeno, que o animal qual o 
soro foi analisado já entrou em contato anteriormente com o antígeno. 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
a. MATERIAIS 
 
i. VIDRARIAS E UTENSÍLIOS 
● Esmalte incolor; 
● Lâmina; 
● Três lamínulas 
 
● Tubo cônico tipo falcon com suporte para lâminas; 
● Placa de Petri; 
● Frasco de descarte; 
● Papel alumínio; 
● Papel toalha; 
● Tubos de ensaio; 
● Ponteiras para micropipeta de 20​μL; 
● Algodão; 
● Becheres. 
 
ii. SOLUÇÕES 
● Água deionizada; 
● Soro de cão; 
● Solução com ​Leshmania braziliensis; 
● Soro de animal com Anticorpo para ​α-IgG de cão; 
● Solução Tampão Fosfato (PBS); 
● Solução tamponada de glicerina ( 20% PBS/80% glicerina); 
● Fluoróforo (Isotiocianato de Fluoresceína, FITC). 
 
iii. EQUIPAMENTOS 
● Estante de tubos; 
● Micropipeta 20​μL; 
● Microscópio fluorescente confocal. 
 
b. MÉTODOS 
 
Anteriormente a prática propriamente dita, houve a higienização da lâmina a qual 
ocorreu lavando-a com detergente e enxaguando com água da torneira, e então finalizou 
com álcool e papel toalha para secar. Após a limpeza pode-se assim iniciar a prática de 
fato, fez-se três círculos na lâmina com 5-10mm, quais têm a função de delimitar uma área 
para quando for adicionado a solução com o antígeno, próxima etapa, não acontecer de 
escorrer pela lâmina. Assim, dispôs-se 20​μL da solução com o antígeno em cada círculo e 
esperou-se até que secasse, sem o solvente o antígeno adere a superfície da lâmina 
facilitando, posteriormente, o reconhecimento pelo anticorpo. 
Com o objetivo de obter um melhor diagnóstico foram utilizadas diferentes 
concentrações de soro de cachorro, visando uma interação mais forte na concentração mais 
baixa, e interações medianas na concentração mais alta. Isso ocorre visto que o anticorpo 
terá uma afinidade maior ao antígeno, logo, caso haja impurezas que se liguem ao 
anticorpo, em concentrações menores de anticorpo a preferência será do antígeno de 
Leishmania braziliensis. 
Para preparar tais diluições foram usados fatores de diluição 1:100 e 1:1000. 
Primeiramente retirou-se uma alíquota de 30​μL do soro do cão e avolumou para 3mL de 
PBS. Para a segunda diluição, usou-se uma alíquota de 300μL da primeira diluição e 
novamente avolumou-se para 3mL. As diluições foram separadas em dois tubos cada e 
dividido entre as bancadas. 
 
Assim, foram adicionados 20μL de cada solução em dois poços distintos e no 
terceiro 20μL de PBS, o último poço tinha como objetivo manter simultaneamente ao 
experimento um controle. Dispôs-se a lâmina na bancadaem uma câmara de incubação por 
30 minutos, que foi preparada com uma placa de petri que possuía dois algodões molhados, 
com o intuito de durante a incubação não permitir que secasse o líquido nas lâminas, a 
placa de petri foi colocada por cima da lâmina. 
Após a incubação, momento o qual ocorre o reconhecimento e ligação do anticorpo 
ao antígeno, houve a lavagem em solução salina. Posicionou três lâminas dentro do tubo 
falcon com suporte e portanto emergiu-as na solução, por dois minutos, duas vezes. 
A fim de retirar a solução salina após a lavagem, utilizou-se um pedaço de papel o 
qual foi delicadamente aproximado as gotículas e assim absorvendo-as. 
Logo, foi adicionado 20μL do anticorpo secundário, previamente diluído, nos três 
poços. Diluição a qual aconteceu no fator de 1:500, pipetando 2μL com uma micropipeta 
P20 e assim adicionando 1000μL, por mais que o somatório final ultrapassasse 1 mL, foi 
considerado a aproximação a fim de facilitar o processo. Foi permitido então o acréscimo de 
20μL do fluoróforo em cada poço e portanto a incubação por 40 minutos 
Com a finalidade de lavar, foi utilizado novamente o tubo falcon e o PBS por alguns 
minutos duas vezes. Secou-se cautelosamente a lâmina, assim como descrito 
anteriormente, para ter a correta aderência da lamínula. 
Como última etapa, preparou-se uma solução de 80% glicerol e 20% PBS para 
aplicar onde havia o esmalte, com objetivo de haver corretamente a adesão da lamínula, 
que foi disposta logo em seguida. 
Após o preparo da lâmina, a levou para o microscópio de fluorescência que foi 
devidamente ajustado para realizar a leitura desejada. 
 
 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
Os 3 poços preparados foram submetidos à microscopia de fluorescência. Um não 
teve resposta; o que não tinha soro de cão. Este poço, ao contrário dos dois restantes, não 
tinha a presença do fluoróforo. Estes outros poços tinham soro de cão na diluição de 
1:100(1) e 1:1000(2) cada. Nestes a presença do fluoróforo foi evidenciada justamente pois 
ele se mostra evidente quando em solução com o soro de cão. 
O antígeno específico e o alfa-anticorpo deveriam ter apresentado resposta nos dois 
poços. Destaque para o poço 1, que tinha uma diluição menor da solução de soro + PBS e 
portanto deveria ter uma intensidade de resposta maior. O poço 2 tinha exatamente as 
mesmas características do poço 1, diferindo somente na concentração de soro, que era 10 
vezes mais diluído. É interessante mencionar que o uso de PBS ao invés do que 
intuitivamente se pensaria em água se dá pelo fato do tampão evitar a lise das células do 
antígeno. 
Pela presença do soro de cão nos poços 1 e 2, esperava-se encontrar atividade 
fluorescente dos anticorpos para o soro. Como explicado no item 1, os anticorpos do soro 
se ligariam ao antígeno, que posteriormente seriam ligados por anticorpos secundários. As 
lavagens com PBS não deveriam tirar os alfa-anticorpos. 
O fluoróforo usado, fluoresceína(FITC), tem a característica de absorver 
comprimento de onda no azul e emitir no verde. Ao acoplar a FITC ao alfa-anticorpo, 
 
esperava-se que, posteriormente na microscopia, fôssemos conseguir enxergar ​Leshmania 
braziliensis. 
Contudo a visualização não foi possível e isso pode ser devido a diversos erros 
procedimentais. A lavagem pode ter sido feita de forma incorreta, o processo de secagem 
pode ter sido insuficiente, o que leva a perda de anticorpo nos poços, e o processo de 
incubação pode ter sido curto. Ainda que improvável, erros grosseiros como errar o 
procedimento de diluição e utilizar um frasco errado que não continha ​Leshmania 
braziliensis ​pode ter sido a causa da não visualização do protozoário. 
 
5. BIBLIOGRAFIA 
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