ApostilaImuno-histoquEDmicaaplicadaE0NeurociEAncia

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Apostila
Centro Educacional
Sete de Setembro
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Imuno-Histoquímica
Aplicada à
Neurociência
Sumário
 Breve histórico
Imunologia: relembrando alguns conceitos
Imuno-histoquímica: preparo da amostra 
Imuno-histoquímica: considerações prévias
Imuno-histoquímica: diferentes métodos 
Em 1942, Coons e colaboradores deram início à história desta técnica que
até hoje é amplamente utilizada, com aplicações que vão das pesquisas
científicas e diagnósticos de doenças à agricultura. Em sua primeira
utilização, o método da fluorescência direto foi empregado para a
detecção de pneumococos em um tecido infectado (Coons et al., 1942).
Ao longo dos anos, variações nos protocolos foram sendo feitas e sua
associação com outras metodologias, como a hibridização in situ,
aumentaram a sofisticação e sensibilidade da técnica. Como reflexo, o
crescimento exponencial de sua utilização. Contudo, somente a partir da
década de 1970 é que o uso da imuno-histoquímica (IHQ) foi
impulsionado, em decorrência da descoberta da interação entre avidina-
biotina e com o uso de kits por laboratórios de pesquisa e de diagnóstico. 
Embora sua utilização para diagnósticos e pesquisa seja feita para todos os
sistemas do organismo, nesta apostila será dado enfoque para sua
aplicação no tecido nervoso. Nesse caso, a IHQ é empregada para localizar,
in situ, células (neurônios ou componentes gliais) produtoras de peptídeos
e proteínas específicas. As células marcadas são denominadas
“imunorreativas”.
Assim, é possível analisar se na amostra de interesse tem a produção de
um receptor específico, ou se a célula está produzindo uma proteína que
indica ativação do neurônio (transcrição gênica). 
01
Breve histórico
Açúcares de cadeias longas (polissacarídeos): puros ou associados a
outras moléculas – bons imunógenos
Exemplo: glicopolissacarídeos
Ácidos nucleicos: sozinhos não são bons imunógenos, mas podem se
tornar quando associados a proteínas, por exemplo.
Exemplo: material genético viral
Figura 1. Membrana plasmática com seus constituintes. Em uma reação, de
IHQ para diagnósticos, por exemplo, moléculas como as glicoproteínas ou
os açúcares podem ser reconhecidos como antígenos. Em uma situação de
transplante de tecidos, em que um tecido exógeno é introduzido no
organismo, esses mesmos elementos presentes na membrana plasmática
também podem ser reconhecidos como antígenos, gerando uma resposta
imune, que muitas vezes coincide com a rejeição deste tecido
transplantado. Imagem: Alberts et al., Molecular Biology of the Cell. 5th
Edition, 2008
Figura 2. Unidade viral e seus constituintes. Tanto as glicoproteínas como o
ácido nucléico (RNA viral) podem ser detectados como antígenos, quando
em contato com o organismo, eliciando uma resposta imune. 
Uma parte importante do Ag, embora seja a menor parte dele, é conhecida
como epítopo ou determinante antigênico. Essa é a região específica do Ag
(geralmente localizada na superfície da molécula) que representa o sítio de
ligação entre o Ag e os receptores celulares ou os anticorpos. O epítopo é o
responsável pela ligação Ag-Ac, sendo a parte do Ag capaz de gerar uma
resposta imune. É possível que um mesmo Ag possua vários epítopos, que
podem ser iguais ou diferentes. 
2.2.2. Anticorpo (Ac)
Anticorpo (Ac), também denominados imunoglobulinas (Ig), são
glicoproteínas do tipo gamaglobulinas (as mais abundantes). O anticorpo é
uma imunoglobulina específica, utilizada para marcar o antígeno de
interesse. 
Estruturalmente, os anticorpos se caracterizam pela associação entre
cadeias de peptídeos leves e pesadas (Figura 1), constituindo uma
disposição em forma de ‘Y’. As cadeias leves se ligam às pesadas através de
pontes Dissulfeto (Marques, 2005).
Cada cadeia (leve e pesada) apresentam duas porções: uma constante e
uma variável, que mudam de um Ac para outro e representam a região de
ligação com o Ag. 
Figura 3.Representação da estrutura de um anticorpo, contendo duas
cadeias de peptídeos leves (menores) e duas cadeias de peptídeos pesadas
(maiores).
Imagem: https://mundoeducacao.uol.com.br/biologia/anticorpos.htm
2.2.2.1. Tipos de Ac
 
 São cinco classes de anticorpos, ou imunoglobulinas (Ig), a saber: IgG, IgA,
IgM, IgD e IgE (Figura 4).
Figura 4. Representações das cinco classes de imunoglobulinas.
 Imagem: https://mundoeducacao.uol.com.br/biologia/anticorpos.htm
IgG: a mais abundante, constituindo cerca de 75% das Ig circulantes. Sua
principal função é fornecer a imunidade primária ao feto (ela atravessa a
barreira placentária, alcançando o feto e conferindo a primeira imunidade).
IgA: encontrada em secreções (saliva, lágrima, fluidos nasais) e em mucosas
(nasal, gastrointestinal) e leite materno. 
IgM: também é abundante no organismo, caracterizando-se como a
imunoglobulina que promove a resposta imune inicial, ou seja, são as
primeiras a se ligar aos patógenos. São as Ig de fase aguda. 
IgD: são encontradas em grandes quantidades na membrana de linfócitos B
imaturos, tendo como uma de suas funções a ativação e diferenciação das
células do sistema imune. 
IgE: é encontrada em baixas concentrações no soro e sua principal função é
eliciar a resposta imune em reações alérgicas (estimulação da liberação de
histaminas – principal mediador de reações alérgicas).
2.2.2.1. Como são produzidos os Ac
 A produção dos Ac inicia com o contato do Ag com células específicas
(linfócitos B) presentes do tecido linfoide. A partir deste contato, os
linfócitos B se diferenciam e são ativados iniciando o processo
denominado seleção clonal, no qual, são formadas séries de células
idênticas (clones) aquelas que as originaram. 
Dos clones formados a partir das divisões celulares de linfócitos B, algumas
se tornam células responsáveis pela produção e secreção dos Ac,
denominadas células efetoras, também conhecidas como plasmócitos. 
Outros clones, tornam-se células de memória, que podem se tornar efetoras
caso o organismo entre em contato novamente com o mesmo Ag.
Células efetoras e de memória, embora tenham a mesma origem,
diferenciam-se quanto ao tempo de vida que possuem: as primeiras
apresentam uma vida curta, quanto as últimas possuem vida mais
prolongada. 
Figura 5. Representação do processo de produção de anticorpos a partir do
contato do organismo com antígeno. 
IMPORTANTE: o processo de seleção clonal também ocorre em linfócitos T,
assim como a ativação celular (concomitantemente com a ativação de
linfócitos B). Alguns clones de linfócitos T são denominadas como células
auxiliares. Essa denominação decorre de sua função: produzir mediadores
que ativarão linfócitos B, potencializando a produção de Ac por essas
células. 
2.2.2.2. Classificação do Ac conforme sua produção
Os Ac podem ainda ser classificados conforme sua produção em Ac
monoclonais e Ac policlonais. 
AC MONOCLONAL
Foram produzidos pela primeira vez em 1975 por Georges Köhler e César
Milstein a partir de hibridomas (Abbas; Lichtman; and Pillai, 2007).. Os
hibridomas são linhagens celulares específicas, produzidas a partir da fusão
de células de mieloma (tumores de plasmócitos) com células de linfócitos
previamente estimulados por antígenos específicos. 
Os hibridomas possuem capacidade de se multiplicarem indefinidamente
em placas de cultura, produzindo milhares de anticorpos idênticos, com as
mesmas afinidades e especificidades (monoclonais) (Marques, 2005). 
Portanto, Ac monoclonais são produzidos a partir de um único tipo celular
(mesmo linfócito B produz milhares de anticorpos idênticos). 
Vantagens: produzidos em larga escala, apresentam grande
especificidade (ligam-se a um único epítopo)
Desvantagens: são menos sensíveis (é necessário uma grande
quantidade deste Ac para uma boa marcação, uma vez que só há uma
possibilidade de sítio de ligação), custo de produção elevado
Figura 6. Produção de anticorpos monoclonais a partir de hibridomas. Os
hibridomas são linhagens celulares específicas, produzidas a partir da fusão
de células de mieloma e linfócitosB previamente ativados por um antígeno
específico (retirados do baço de um camundongo, por exemplo). Os
hibridomas se proliferam indefinidamente em placas de cultura e produzem
milhares de anticorpos idênticos. Imagem: Moreira, 2014. 
AC POLICLONAL
 Diferentemente, os Ac policlonais são produzidos por diferentes linfócitos
B, caracterizando uma combinação, uma mistura de imunoglobulinas que
apresentam diferentes epítopos e que reagirão contra um antígeno
específico. 
Vantagens: são mais sensíveis, devido a ligação em diferentes epítopos
(fazem várias ligações simultaneamente), baixo custo de produção
Desvantagens: menos específicos
Figura 7. Representação das diferenças estruturais entre Ac monoclonais e
policlonais.
Monocional Policional
2.2. Reação antígeno-anticorpo
As reações antígeno-anticorpo se assemelham às reações entre enzimas e
substratos, ou seja, são altamente específicas e reversíveis (Harmening,
2002).
Como mencionado em seção anterior, os antígenos se ligam aos anticorpos
pelo epítopo, região altamente específica, através de ligações do tipo não-
covalentes, por isso, reversíveis (Harmening, 2002).
03
Imuno-histoquímica: preparo da amostra
Em Neurociências, a IHQ pode ser utilizada para marcação de proteínas em
neurônios específicos (proteínas indicadoras de atividade celular =
transcrição gênica; proteínas estruturais presentes no exoesqueleto;
proteínas de membrana, como receptores e transportadores) ou mesmo
células da glia como astrócitos e oligodendrócitos. 
O sucesso da reação, isto é, a boa marcação das proteínas de interesse,
dependerá a princípio do cuidado e preparação do tecido a ser analisado,
etapa mais importante do processo, composta por uma série de passos
interdependentes. 
3.1. Preparação do tecido
3.1.1. Cirurgia de perfusão
A preparação do tecido começa com o procedimento de perfusão
transcardíaca (Figura 8), o que permitirá acesso ao tecido nervoso de modo
a prepara-lo para posteriormente as análises por IHQ. 
Lembrando que, em pesquisa básica em Neurociência, utilizando-se
modelos experimentais, a aplicação desses procedimentos deve,
necessariamente, ser aprovada por uma Comissão de Ética no Uso de
Animais (CEUA) das instituições. 
 
Inicialmente, os animais experimentais (roedores comumente utilizados
em pesquisa – ratos, camundongo) são ANESTESIADOS, com fármacos
preconizados pelas CEUAs de cada instituição. É estritamente necessária a
anestesia prévia e a confirmação da ausência de reflexos para o início dos
procedimentos.
Neste momento, faz-se uma abertura na região torácica de modo a expor o
coração (que necessariamente precisa estar com a frequência de
batimentos relativamente normal). Em seguida, campeia-se com uma pinça
kelly a aorta descendente (que passa anteriormente à coluna espinhal e
atrás do fígado) – o objetivo é interromper o fluxo sanguíneo da grande
circulação, uma vez que o principal tecido a ser fixado está na parte de
cima do corpo (e também é uma forma de economizar nas soluções
utilizadas). Em seguida, uma agulha é introduzida no ventrículo esquerdo e
direcionada à aorta pulmonar (almejando a pequena circulação). Neste
momento inicia-se a passagem dos líquidos, cuja saída do corpo é
garantida com uma pequena secção no átrio direito. 
Figura 8. Representação da cirurgia de perfusão. Na imagem, não é
mostrado o clampeamento da artéria descendente.
Imagem: https://www.jove.com/t/3564/whole-animal-perfusion-fixation-
for-rodents?language=Portuguese
3.1.2. Fixação do tecido
 
A fixação do tecido nervoso garante a correlação entre a estrutura e a
identidade química (antigenicidade) do tecido. Nesta etapa é como se uma
fotografia fosse tirada a nível celular-molecular, preservando/ paralisando
cada reação dentro das células. 
Inicialmente, a amostra é “lavada” com solução salina fisiológica (0,9%,
com pH 7,0), com o intuito de retirar quaisquer resquícios de outros fluidos,
como sangue. É importante que o sangue presente na amostra seja
totalmente retirado, pois ele pode prejudicar tanto a ligação Ag-Ac como
ser um confundidor na análise da marcação. 
Após a “lavagem”, a amostra é fixada em solução de paraformaldeído (PFA
4%). Essa solução irá desidratar o tecido. A retirada de água do tecido é
igualmente importante, tanto pela própria preservação do tecido,
impedindo sua degradação; como por evitar que, durante o congelamento
(uma forma de armazenar as amostras até seu processamento), formem-se
moléculas de gelo dentro das células. O gelo poderia romper as membranas
celulares e comprometer toda a estrutura das células. 
A perfusão pode ser realizada com a ajuda de uma bomba peristáltica que,
como vantagem, apresenta a possibilidade de controlar tanto o volume e a
velocidade dos líquidos; ou pelo método da gravidade, com o auxílio de
provetas (apresenta baixo custo, mas não possibilita o controle da
passagem dos líquidos).
Figura 9. Representação do processo de fixação. Fixative = solução
fixadora (PFA 4%), Buffer = solução salina 0,9%. 
Imagem: https://www.jove.com/t/3564/whole-animal-perfusion-fixation-
for-rodents?language=Portuguese
3.1.3. Pós-fixação
 
É comum que seja feita a etapa de pós-fixação, que varia entre os
protocolos experimentais, mas que representa uma outra etapa para
garantir o bom preparo e qualidade da amostra. 
Nesta etapa, o tecido é novamente tratado, sendo armazenado em novas
soluções de PFA, variando as concentrações dessas soluções, o tempo em
que são armazenados nela e se a armazenagem é ou não com o tecido
extraído. 
Em uma última etapa do processo de pós-fixação, o tecido nervoso é
armazenado em solução de sacarose 30% por uma semana (ou até afundar).
A sacarose permeará o tecido, promovendo a preservação do tecido. 
Figura 10. Dissecção do tecido nervoso para a etapa de pós-fixação: a = decapitação, b =
corte longitudinal, c = secção coronal da medula; d = remoção da pele e membranas craniais;
e = remoção do crânio; f = exposição do encéfalo para sua extração e transferência para
novas soluções de PFA 4% e sacarose 30%.
Imagem: https://www.jove.com/t/3564/whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents?
language=Portuguese
 
3.1.4. Armazenanamento
Após toda a etapa de preparo do tecido, ele é armazenado até o momento
de sua análise. Duas principais formas de armazenagem são utilizadas: o
congelamento e o emblocamento. 
O método de congelamento apresenta algumas desvantagens, embora
bastante utilizado: alto custo (utiliza-se muitos materiais, os quais
apresentam elevado custo), uma vez congelado precisa se manter em
temperatura -80º C (se retirado desta temperatura, em pouco tempo
descongela, o que pode comprometer a amostra).
Emblocamento 
Neste método, a amostra é emblocada em parafina, sem a necessidade de
outros materiais. Além do menor custo, grande vantagem de emblocar a
amostra é a possibilidade de seu armazenamento em temperatura ambiente
por tempo indeterminado.
Congelamento
Esste método consiste em congelar a amostra a uma temperatura de – 80º
C, com o auxílio de gelo seco. Para tanto a amostra é colocada em
recipiente (como copinhos feitos com papel alumínio), preenchido com
meio de inclusão (Tissue-Tek®). Em seguida são colocados em um béquer
contendo algum líquido hidrocarboneto, como o n-hexano, resfriado em
gelo seco. A amostra é mantida até seu congelamento e depois armazenada
em freezer -80º C. 
3.1.5. Processamento
A próxima etapa, após o preparo do tecido, é o processamento da amostra
para sua análise. Há diferentes métodos de processamento, de acordo com
o objetivo da pesquisa e as proteínas de interesse. 
No geral, o tecido é cortado em fatias muito finas, na ordem de
micrômetros, com o auxílio de equipamentos como o criostato (utilizado
para corte de amostras em temperatura abaixo do ponto de congelamento)
e o micrótomo (utilizado para processamento de amostras emblocadas em
parafinas que, por estarem muito duras, precisam ser cortadas em fatias
muito finas). 
Figura 11. Equipamentos para processamento de amostras. A = micrótomo,possibilita cortes de amostras emblocadas em parafina; B = criostato,
possibilita corte de amostras congeladas. Imagens: Freepik
 Após o processamento, o tecido pode ser novamente armazenado de
duas formas, antes da realização da IHQ: as fatias podem ser colocadas
diretamente sobre lâminas de microscopia, onde a reação de IHQ será
realizada (os anticorpos serão colocados diretamente sobre o tecido –
método mais oneroso) ou as fatias podem ser colocadas em lâminas
contendo poços, em que cada poço contém solução anticongelante (anti-
freezing) sobre a qual serão colocadas as fatias do tecido (cerca de 8-9 por
poço) e onde será colocado o Ac em solução. Esse segundo método é
denominado free-floating (as fatias ficam “flutuando” em líquido contendo
o Ac) e é mais barato. Após a reação, as fatias são transferidas dos poços
para lâminas de microscopia.
Figura 12. Representação da análise de imuno-histoquímica do tipo
imunofluorescência em tecido nervoso de camundongo, desde a etapa do
tecido extraído, processamento, ensaio imunológico, montagem de lâmina,
análise em microscópio de fluorescência e visualização da marcação.
Imagem: adaptado Rosa et al., 2022. 
3.1.6. Análises
Terminada as reações de IHQ, as lâminas prontas são analisadas em
microscópio podendo ser óptico, de fluorescência ou confocal (esses
últimos para reações que envolvem marcadores fluorescentes). A análise
das marcações são realizadas com a ajuda de atlas de neuroanatomia
(Figura 13)
Figura 13. Imagem dos atlas de neuroanatomia de camundongo (esquerda)
e rato (direita) do Paxinos, que auxiliam a análise de lâminas histológicas
04
Imuno-histoquímica: considerações prévias
4.1.2. Reatividade
E importante conferir também a indicação de espécie em que o anticorpo
de interesse funciona. Por exemplo: para uma reação de tecido de
camundongo, deve-se escolher um anticorpo que reage em amostras de
camundongo. Portanto, a espécie em que o anticorpo é produzido deve ser
diferente da espécie na qual se pretende detectar o antígeno, de modo a
evitar reação cruzada. 
Além da diferença entre as espécies na qual se produziu o Ac e na qual ele
será utilizado afim de detectar um antígeno de interesse, é necessário
conferir para qual tipo de reação o Ac de interesse é recomendado. Por
exemplo: para determinada reação pretende-se utilizar um anticorpo,
entretanto, em uma empresa específica o Ac que condiz com a questão
anterior não é indicado para reações de IHQ, mas somente para outros
ensaios moleculares.
4.1.3. Armazenamento 
 Outro ponto de extrema importância é a forma de armazenamento do Ac,
que deve ser seguida conforme instruções dos fabricantes. Ou seja, deve-se
conferir com o fabricante se o Ac de interesse deve ser armazenado em
geladeira, freezer, se precisa ser aliquotado (em casos em que não se pode
descongelar e congelar). O armazenamento em temperatura diferente pode
comprometer as características físico-químicas da substância e,
consequentemente, a reação.
4.1.4. Concentração do Ac
Uma reação bem sucedida é aquela cujas proteínas são detectadas, são
bem marcadas. Para tanto, o Ac deve estar em concentrações ótimas. Seu
excesso, embora possa trazer marcações fortes, representa um maior gasto
(uma vez que, neste caso, é utilizada uma maior quantidade da molécula)
além da possibilidade de background (= sujeira), atrapalhando a análise
correta da lâmina. Por outro lado, a falta de Ac implica em uma marcação
fraca, com baixa qualidade e, as vezes, a falta de marcação correta; o que
também compromete a reação e a análise dos resultados. 
Para resolver esta questão, faz-se uma curva com diferentes concentrações
do Ac, a partir do que é sugerido pelo fabricante. O objetivo dessa curva de
titulação é encontrar qual concentração oferece a melhor marcação do
antígeno (especialmente quando se trata de uma concentração baixa,
favorecendo a economia de reagentes!).
 Para esclarecimentos das questões apresentadas neste capítulo, utiliza-se
o datasheet do Ac, ou seja, uma espécie de bula do Ac. O datasheet
acompanha o Ac e por meio dele essas dúvidas são respondidas. Além
disso, consultar trabalhos já publicados que utilizaram o Ac de interesse e
consultar outros pesquisadores auxilia nas decisões acerca da escolha do
anticorpo.
Figura 14. Imagem de um
datasheet de um anticorpo. Nele
estão contidas todas as
informações e dados do Ac, como
forma de armazenamento,
aplicações (para quais reações é
indicado), concentrações
indicadas para uso em cada tipo
de ensaio para o qual é indicado,
qual a natureza (de acordo com
sua produção), entre outras
informações. 
05
Imuno-histoquímica: diferentes métodos 
5.1. Métodos de IHQ
I- Método direto: utilizado em larga escala para fins diagnósticos, como em
biópsias. Neste método, o Ac reage diretamente com o Ag, caracterizando
este como um método rápido. Entretanto, a desvantagem é que há pouca
amplificação de sinal.
II- Método indireto: neste método há a formação de um complexo, na
região do sítio antigênico (ou seja, na região do epítopo, onde há a ligação
entre Ag-Ac), no qual o anticorpo utilizado está marcado com uma molécula
fluorescente ou com um cromógeno (molécula que produz uma substância
colorida após a reação com a peroxidase). Os métodos indiretos são mais
sensíveis, uma vez que os Ac secundários (aqueles conjugados com
moléculas fluorescentes ou cromógenas) podem reagir com diferentes
sítios antigênicos dos Ac primários. Consequentemente há maior
amplificação do sinal da reação. 
Figura 15. Representação dos métodos direto e indireto da IHQ. Imagem:
adaptada de https://www.ptglab.co.jp/news/blog/want-to-upgrade-your-
immunofluorescence-workflow-go-direct/
5.2. Tipo de métodos indiretos
5.2.1. Imunofluorescência com Ac secundário conjugado com fluoróforo.
 
É o método indireto mais simples. Inicialmente o tecido é incubado em um
Ac primário, não marcado, específico para o peptídeo de interesse presente
na amostra. Em seguida, incuba-se o tecido com Ac secundário, conjugado
com uma molécula fluorescente. O Ac secundário DEVE ter compatível com
a espécie em que o Ac primário foi produzido, afinal, é contra essas
imunoglobulinas que ele é direcionado. Por exemplo: se o Ac primário foi
produzido em coelho, então, o secundário deve ser anti-coelho e, portanto,
deve ser produzido em outra espécie de animal, como cabra: Ac secundário
anti-coelho produzido em cabra. 
Nesse caso, com a reação bem sucedida, os neurônios imunorreativos se
tornarão fluorescentes, sendo possível sua visualização pelo microscópio de
fluorescência. 
Figura 16. Fotomicrografia representativa da imunorreatividade de
neurônios produtores de neuropeptídeo Y (marcação em verde) e células
expressando Fos (marcação em vermelho) na região da amígdala
basolateral de ratos adultos (aumento 20 x).
5.2.2. Imunofluorescência com avidina conjugada com fluoróforo.
 
Neste método, também há exposição do antígeno a um Ac primário
específico, com formação do complexo Ag-Ac. Em uma segunda etapa, o
tecido é exposto a um Ac secundário biotinilado. 
A biotina (conjugada com o Ac secundário) é uma vitamina do complexo B,
hidrossolúvel e com baixo peso molecular. Por outro lado, a avidina
(estreptavidina) é uma glicoproteína com elevado peso molecular, que
possui altíssima afinidade pela biotina, sendo extremamente maior do que
outras ligações entre Ag-Ac, propiciando, assim, a formação de um
complexo irreversível. 
A avidina possui 4 sítios de ligação para a biotina. Como a maioria dos Ac é
conjugada a biotina, a conjugação de Ac biotinilados a avidina, origina um
grande complexo macromolecular, que amplifica o sinal da reação Ag-Ac. 
Figura 17. Representação método indireto complexo avidina-biotina (ABC)
Destaque para a ligação avidina-biotina. 
5.2.3. Método da imuno-peroxidase utilizando o complexo avidina-biotina
(ABC) (Hsu et al., 1981)
 Assim como os métodos anteriores, neste, o tecido também será exposto a
um Ac primário específico, não marcado, e em seguida a um Ac secundário
biotinilado. A seguir,este complexo será amplificado por meio da
conjugação com um macrocomplexo formado previamente pela união entre
moléculas de avidina-biotina com a peroxidase de raiz-forte (horseradish
peroxidase – HRP)
A peroxidase é uma enzima que oxida seus substratos, com o auxílio do
peróxido de hidrogênio (H2O2 – molécula receptora de elétrons).
Na reação em questão, quando se adiciona ao complexo Ac primário + Ac
secundário + biotina-avidina + HPR + H2O2 + 3’-3-tetracloreto de
diaminobenzidina (DAB) tem-se como resultado um produto polimérico
insolúvel de coloração escura (marrom) sobre o sítio antigênico.
Consequentemente, os neurônios imunorreativos ficarão com coloração
acastanhada. Caso a reação ocorra, ainda, na presença de níquel, o produto
final terá coloração acinzentada-preta.
OBSERVAÇÃO 1: o 3’-3-tetracloreto de diaminobenzidina (DAB) é
adicionado à reação por ser o substrato de oxidação da peroxidase. 
Figura 18. Fotomicrografia representativa de neurônios ocitocinérgicos
imunorreativos na região paraventricular do hipotálamo (aumento 10x),
marcados pelo método da imunoperoxidase usando kit ABC. Imagem:
Ceschim et al., 2021. 
5.2.4. Método da peroxidase-antiperoxidase – PAP (Sternberger et al.,
1970)
Este método caracteriza-se como o precursor do método ABC. Neste
método, o Ac primário é exposto a um Ac secundário conjugado ao HRP,
cuja reação inclui a peroxidase, um cromógeno e o peróxido de hidrogênio. 
Aparentemente, ambos os métodos são iguais. Entretanto, diferem quanto a
especificidade de sinal, em que o PAP é menos específico e resulta em uma
marcação menos intensa. 
No método PAP o resultado, após a ação da peroxidase com o cromógeno
(DAB) também é um polímero insolúvel de coloração acastanhada,
portanto, os neurônios imunorreativos serão marcados em marrom. 
Figura 19. Representação do método indireto peroxidase-antiperoxidase
(PAP). Em comparação ao método ABC, mostrado na Figura 17, o PAP
apresenta menor amplificação de sinal, já que o complexo peroxidase-
antiperoxidase é menor do que o avidina-biotina. 
5.2.5. Método da fosfatase alcalina
 
Neste método, quando o tecido já exposto ao Ac primário é apresentado ao
Ac secundário, este, está conjugado à fosfatase alcalina. O substrato desta
enzima é o 5-bromo-4-cloro-3-indol-fosfato (BCIT), cuja coloração marcada
é índigo-púrpura, frente a liberação de íons hidrogênio. 
É possível associar outro substrato, no caso, o azul de nitrotetrazólio (NBT). 
A associação entre BCIT e NBT intensificará a coloração da marcação,
estabilizando-a por mais tempo.
5.3. Considerações finais do capítulo
Quando comparamos os métodos indiretos como o da peroxidase e o de
fluorescência, é comum considerar que o segundo método é menos
trabalhoso, portanto mais rápido. Entretanto, o método da peroxidase ainda
configura um dos mais utilizados. Isso porque a marcação decorrente da
formação do complexo macromolecular (Ag-Ac-avidina-biotina-peroxidase)
implica em maior amplificação da reação e, por conseguinte, facilita a
visualização da marcação. 
Estabelecendo a compatibilidade entre espécies em que os anticorpos são
produzidos e as espécies em que reagirão, é possível a realização de duplas
e triplas marcações, que permitem a detecção simultânea de mais de uma
proteína de interesse. Isso significa uma análise mais robusta e fidedigna
do fenômeno neurobiológico que está sendo investigado, ou seja, uma
análise mais sofisticada do tecido analisado. 
O método da peroxidase, embora apresente mais etapas para sua
realização, é um método relativamente mais simples do que o de
fluorescência, que apresenta menor custo de realização, não exige
equipamentos sofisticados (é possível realiza-lo com equipamentos
rotineiros do laboratório de microscopia, ou seja, um microscópio óptico
simples), apresenta elevada especificidade na ligação Ag-Ac e uma
marcação bastante precisa. 
Entretanto, o método da peroxidase apresenta algumas desvantagens que
precisam ser consideradas, a saber: como os Ac comercializados advém de
diversas empresas, apresentam diversidade quanto ao preço e
especificidade ao antígeno. Se o protocolo for realizado corretamente,
essas questões dependerão unicamente do Ac primário escolhido. 
A técnica de IHQ permite quantificar quais e quantas células estão
imunorreativas, mas não permite a análise da intensidade da marcação.
Havendo essa necessidade, deve-se associar ou utilizar outros métodos
como a hibridização in situ, para avaliação da marcação com preservação
anatômica, ou o Western blot - WB, se a intenção for a quantificação em
valores absolutos dessa intensidade (o WB apresenta a quantidade do
antígeno de interesse, por meio de seu peso molecular). 
Resumindo
Nesta apostila vimos uma técnica que tem sido amplamente utilizada tanto
para exames diagnósticos como para a pesquisa científica, especialmente
na área das Neurociências: a imuno-histoquímica.
Essa técnica, cuja base teórica e princípios envolvem aspectos da
imunologia, transformou o modo de análise e entendimento de diversos
fenômenos biológicos. Na área das pesquisas, essa técnica permitiu que
proteínas diversas fossem detectadas, sozinhas ou simultaneamente com
outras, no próprio tecido preservado, trazendo uma visão mais fidedigna
desses fenômenos em interesse.
Embora muito utilizada, a técnica e seus variados modos de realização
apresentam vantagens e desvantagens, que devem ser avaliados conforme
cada pergunta de pesquisa. Além disso, o refinamento de todos os
processos envolvidos na realização desta técnica, demandam não só o
conhecimento apurado de sua teoria, mas também e, principalmente, um
treinamento intenso para o profissional que pretende utilizá-la. 
De todo modo, a imuno-histoquímica representou uma revolução para a
ciência e permitiu que novas técnicas e tecnologias fossem descobertas,
criadas e refinadas a partir de sua criação. Portanto, é uma excelente
ferramenta para diversos segmentos.
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