7 Proteínas

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
CENTRO DE CIÊNCIAS QUÍMICAS, 
FARMACÊUTICAS E DE ALIMENTOS
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA (1650024)
PROTEÍNAS – IMAGENS
Prof. Luciano do Amarante
Características de composição de algumas proteínas
Proteínas
Números de 
aminoácidos
Número de cadeias 
polipetídicas
Insulina (bovina) 51 2
Lisozima (clara do ovo) 129 1
Mioglobina (equina) 153 1
Hemoglobina (humana) 574 4
Aspartato 
transcarbamoilase (E. 
coli) 2700 12
RNA polimerase (E. coli) 4100 5
Apoliproteína B 
(Humana) 4536 1
FUNÇÕES BIOLÓGICAS DESEMPENHADAS
(Alguns exemplos).
PROTEÍNAS ENZIMÁTICAS (Catálise)
Reação catalisada pela enzima glutamina sintetase:
Glutamato + ATP + NH3 → Glutamina + ADP + fosfato
Estrutura em Raio-X de glutamina sintetase.
Substrato Complexo 
enzima-substrato
Produtos
Enzima 
maltase
PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS
Estrutura quaternária da hemoglobina (a) e 
eritrócitos (b).
PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS
Ex.: Leg-hemoglobina
PROTEÍNAS CONTRÁTEIS OU DE MOVIMENTO
Actina e miosina.
PROTEÍNAS ESTRUTURAIS
Ex.: Colágeno
A tríplice hélice do colágeno.
Electromicrografia de fibrilas 
de colágeno da pele.
A estrutura de uma queratina.
A organização microscópica do cabelo.
Ex.: Queratinas
PROTEÍNAS DE DEFESA
Ex.: Imunoglobulinas.
Anticorpo Complexo antígeno-anticorpo
Antígeno
PROTEÍNAS NUTRIENTES E DE RESERVA
Ex.: - Ovoalbumina (ovo)
- Caseína (leite)
- Proteínas de sementes. Ex.: Zeína (milho); gliadina (trigo), legumina (grão de 
bico),...
Estrutura da legumina. Holoproteína e suas subunidades ácidas e básicas dissociadas por
tratamentos sequenciais com tampão contendo altas concentrações salinas e -mercaptoetanol (-ME).
PROTEÍNAS REGULATÓRIAS
- Regulam atividade celular ou fisiológica.
PROTEÍNAS TÓXICAS
Estrutura da ricina
Cristais de insulina
CLASSIFICAÇÃO:
QUANTO À COMPOSIÇÃO QUÍMICA 
A) PROTEÍNAS SIMPLES
B) PROTEÍNAS CONJUGADAS
Hemoproteínas
Ex.: citocromos
Ex.: Leg-hemoglobina
Hemoproteínas
Glicoproteínas
Glicoproteína de membrana Estensina de parede celular 
altamente glicosilada
Ex.: Dinitrogenase 
Modelos de proteínas Fe-S da cadeia respiratória 
mitocondrial 
Metaloproteínas
QUANTO À FORMA (CARACTERÍSTICAS FÍSICAS)
A) GLOBULARES
QUANTO À FORMA (CARACTERÍSTICAS FÍSICAS)
A) GLOBULARES
B) FIBROSAS
HIERARQUIA DA ESTRUTURA PROTEICA
Cristais de proteína. a) Azurita de Pseudomonas aeruginosa ,b) flavodoxina de Desulfovibrio 
vulgaris, c) rubredoxina de Clostridium pasterianum, d) azidomete mio-hemeritatina do verme 
marinho Siphonosoma funafuti, e) hemoglobina de lampréia e f) bacterioclorofila uma proteína 
de Prosthecochloris aestuarii. 
Fotografia de difração de raio-X de
um cristal de mioglobina de esperma
de baleia.
Mapas de densidade eletrônica de
proteínas.
Um mapa de densidade de elétrons. O contorno tridimensional da densidade dos elétrons (em laranja) é
mostrada com a superposição de um modelo atômico do segmento correspondente do polipeptídeo (em
branco). Esta estrutura é uma parte do rinovírus humano (o agente da gripe comum).
Representação da estrutura de raio X de
mioglobina de esperma de baleia. A proteína
e seu grupo heme são desenhados no
modelo de bastão.
Representação da estrutura de raio X de
mioglobina de esperma de baleia: Um
diagrama no qual a proteína é
representada por seu esqueleto C
gerado em computador.
Representação da estrutura de raios-
X da mioglobina do esperma de
baleia: Um desenho gerado em
coputador.
Estrutura Primária
A figura mostra a ligação peptídica envolvendo o grupo carboxílico 
de um aminoácido com o grupamento amino de outro aminoácido, 
deixando livre a extremidade aminoterminal (aminoácido 1) e uma 
extremidade carboxiterminal (no aminoácido 2)
Unidade ou 
grupo peptídicoLigação peptídica 
(amida substituída)
Uma cadeia polipeptídica inteiramente estendida mostrando a planaridade 
de cada um de seus grupos peptídicos
Cadeia principal
Cadeia lateral
Carboxil terminal
Amino terminal
Cadeia polipeptídica
arranjo flexível de unidades planas 
conectadas por uma articulação: o C 
Expressão gênica
Transcrição
Tradução
Proteína
(cadeia de aminoácidos)
A sequência de aminoácido da porção C-terminal da
região tríplice hélice da cadeia de colágeno bovino
1(I). A tríplice hélice do colágeno.
Seqüências de aminoácidos dos citocromos c de 38 espécies
Seqüências de aminoácidos dos citocromos c de 38 espécies
Seqüência de aminoácidos no citocromo c humano (proteína homóloga). Substituições de 
aminoácidos em outras espécies listadas abaixo dos resíduos individuais.
Aminoácidos invariantes: sombreados em amarelo.
Substituições conservadoras: sombreadas em azul.
Substituições não conservadoras: não sombreadas.
A comparação da sequência de aminoácidos de proteínas homólogas permitiu concluir que
as partes conservadas durante a evolução dos organismos, provavelmente são as mais
importantes para manutenção da estrutura e consequentemente da função de determinada
proteína. Isto é, são as regiões que especificam a atividade biológica da mesma.
Árvore filogenética do citocromo c.
Estrutura primária da lisozima HEW.
Estrutura Secundária
Estrutura de uma cadeia polipetídica em -hélice, estabilizada 
por pontes de H intracadeia
a) -hélice
Grupo lateral
C 
 - hélices: enrolamento da cadeia ao redor de um eixo
*As pontes de H estabelecidas entre átomos que participam das 
ligações peptídicas estabilizam a estrutura helicoidal e são paralelas 
ao eixo da cadeia
*As cadeias laterais são projetadas para fora da hélice
Representação de preenchimento estereoespacial de um 
segmento de alfa-hélice de mioglobina de esperma de baleia, 
determinado por análise por raios-X do cristal.
-hélice da queratina
Duas cadeias 
enoveladas
Protofilamentos
Protofibrilas
Células
Filamento 
intermediário
Protofibrila
Protofilamento
Duas cadeias 
enoveladas
-Hélice
Secção tranversal de um fio de cabelo
Pontes dissulfeto entre -hélices
-hélices adjacentes
Interligações de cistina (dois resíduos de cisteína ligados 
pelos grupos sulfidrílicos) entre -hélices adjacentes da
-queratina. Nas queratinas “duras” como aquelas do 
casco da tartaruga, as interligações por resíduos de 
cistina são muito numerosas.
-Hélices em proteínas globulares
b) Folhas
-pregueadas:
Organização de duas 
cadeias 
polipeptídicas em 
folha -pregueada, 
estabilizadas por 
pontes de H 
intercadeias
*Folhas  pregueadas: interação lateral de unidades peptídicas por pontes 
de hidogênio:
- Na mesma cadeia
-Entre cadeias diferentes
*Pontes de H entre átomos que participam das ligações peptídicas, 
são perpendiculares ao eixo da cadeia 
Disposição antiparalela das cadeias 
polipeptídicas
Visão superior
Visão lateral
Visão superior
Visão lateral
Disposição paralela das 
cadeias polipeptídicas
Cadeia lateral
de Ala
Cadeia lateral
de Gly
Secreção de fibroína em aranhas
-Estrutura em proteínas globulares.
Forças que mantêm a estrutura terciária se 
deve à interação entre as cadeias laterais dos 
aminoácidos.
➢ interaçoes hidrofobicas
➢ pontes de H
➢ forças de Van der Waals
➢ ligações iônicas
➢ pontes dissulfeto (S-S)
Estrutura Terciária
Mioglobina de esperma de baleia: Um diagrama no qual a 
proteína é representada por seu esqueleto C gerado em
computador.
Estrutura de raio-X daenzima com 247 resíduos de aminoácidos, 
triose fosfato isomerase (TIM), isolada de músculo de frango.
Exemplos de estrutura 
terciária de proteínas –
observe que o 
esqueleto peptídico 
está arranjado em 
estrutura secundária 
(folha -pregueada 
e/ou -hélice)
Interações que mantêm a estrutura terciária de proteínas –
(1) hidrofóbica (2) ponte de H (3) eletrostática
-Amilase salivar humana (Ptialina)
Estrutura quaternária da hemoglobina.
Forças que mantêm a 
estrutura quaternária se 
deve à interação entre as 
cadeias laterais dos 
aminoácidos de duas ou 
mais cadeias polipeptídicas:
➢ interaçoes hidrofobicas
➢ forças de Van der Waals
➢ pontes de H
➢ ligações iônicas
Estrutura Quaternária
Estrutura da desoxihemoglobina.
Estrutura da RUBISCO, enzima responsável pela fixação de CO2 no Ciclo de Calvin, rota biossintética
responsável pela síntese de açúcares durante a fotossíntese. A enzima consiste de oito subunidades
grandes (56 KDa) e oito subunidades pequenas (14 KDa). As subunidades pequenas estão
representadas em vermelho e as subunidades grandes estão coloridas em azul e verde.
Estrutura da ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase (RUBISCO) de folhas de
espinafre. Possui oito subunidades grandes (azul) e oito subuninidades
pequenas (cinza), altamente empacotadas em uma estrutura de PM= 550.000. Em
amarelo estão demonstrados os aminoácidos do sítio ativo. (a) Vista superior
(b) Vista lateral
A hierarquia da estrutura proteica
Estrutura 
primária
Estrutura 
secundária
Estrutura 
terciária
Estrutura 
quaternária
Resíduos de 
aminoácidos
-Hélice Cadeia 
polipeptídica
Subunidades
associadas
A) Estrutura primária: ligação
peptídica
(B e C) Estrutura secundária: -
hélice (B) e -estrutura (C) (grupos
R não mostrados)
(D) Estrutura terciária
(E) Estrutura quaternária
B
A
C
D
E
Alterações Estruturais em Proteínas
A) Substituição de Aminoácidos
Ex.: Anemia falciforme.
RNA
DNA
Thr
Pro Glu
Lys
Thr Lys
Pro
Glu
Glu
Val
A mudança em uma única base leva a uma doença chamada anemia falciforme
RNA
DNA
mutado
Hemácia normalsubstituição
Hemácia alterada
Electromicrografia de fibras desoxihemoglobina 
vazando de um eritrócito rompido .
Estrutura da fibra da desoxi-
hemoglobina. (a) O arranjamento 
das desoxihemoglobinas na fibra.
(b) O mutante contendo Val 6 2
fixa-se próximo a um bolsão 
hidrofóbico formado principalmente 
por Phe 85 e Leu 88 de uma 
subunidade 1 adjacente.
a
b
Estado nativo,
cataliticamente ativo
Adição de uréia 
e
mercaptoetanol
Remoção de uréia 
e
mercaptoetanol
Estado nativo,
cataliticamente ativo. 
Pontes dissulfeto 
corretamente refeitas
Estado desenovelado, 
inativo. Pontes dissulfeto 
reduzidas formando 
resíduos de Cys
B) Ação de Agentes Desnaturantes
Proteína nativa (Em
conformação
cataliticamente ativa)
DESNATURAÇÃO
Proteína desnaturada (Em
conformação sem atividade
biológica)
RENATURAÇÃO
Ponto isoéletrico (pI) de algumas proteínas e sua composição em aminoácidos ácidos e 
básicos
Aminoácidos (%)
Ácidos Básicos
Proporção
Ácidos/
Básicos
Proteínas pI Asp Glu Arg His Lys
Pepsina 1,0 16,6 11,3 1,0 0,5 0,4 15
Albumina 4,8 10,4 17,4 6,2 3,5 12,3 1,3
Mioglobina 7,0 4,7 8,3 1,9 7,5 12,8 0,6
Citocromo c 10,6 3,6 5,9 2,2 2,5 15,2 0,5
pH  pI pH  pI pH  pI
pI
Solubilidade de uma proteína do tipo globulina próximo ao seu ponto
isoelétrico (pI).
Solubilidade de proteínas em função do pH do meio
Esquema com os passos gerais envolvidos na caracterização de uma proteína
Purificação de Proteínas 
Grande carga líquida positiva
Carga líquida positiva
Carga líquida negativa
Grande carga líquida negativa
Esferas contendo 
polímeros com grupos 
funcionais carregados 
negativamente
Mistura de proteínas é 
adicionada à coluna 
contendo trocadores de 
cátions
As proteínas se movem através da 
coluna em taxas determinadas pela sua 
carga líquida no pH em uso. Com os 
trocadores de cátions, as proteínas com 
carga líquida mais negativa se 
movimentam mais rapidamente e eluem 
primeiro. Cromatografia de troca iônica
Esferas de polímero 
porosos
A mistura protéica é adicionada à 
coluna contendo o polímero 
entrecruzado em forma de rede
As moléculas de proteína são 
separadas segundo seus 
tamanhos; as moléculas 
maiores passam mais 
livremente e aparecem nas 
primeiras frações
Cromatografia de exclusão por 
tamanho
Mistura de 
proteínas
Proteína que 
interessa
Ligante
Ligante unido à 
esfera de 
polímero
Solução 
do ligante
A mistura protéica é 
adicionada à coluna 
que contém um 
polímero ao qual 
está unido um 
ligante específico 
para a proteína que 
interessa
As proteínas 
indesejadas 
são retiradas 
por lavagem 
da coluna
A proteína que 
interessa é 
eluída pelo 
emprego de 
lavagem com 
uma solução 
de ligante
Cromatografia de 
afinidade
Sentido 
da 
migração
Amostra
a)
b)
Eletroforese
a) amostras diferentes são 
colocadas nos poços ou depressões 
no topo do gel de poliacrilamida. As 
proteínas movem-se para o interior 
do gel quando um campo elétrico é 
aplicado.
b) as proteínas podem ser 
visualizadas depois da eletroforese 
pelo tratamento do gel com um 
corante. Cada banda no gel 
representa uma proteína diferente 
(ou uma subunidade protéica).
Aparato de eletroforese.
Inibidor da tripsina da soja
Lisozima
Anidrase carbônica
Ovoalbumina
Soroalbumina bovina
Glicogênio fosforilase b
-galactosidase
Miosina
Padrões
Mr
Proteína 
desconhecida Migração relativa
Proteína 
desconhecida
a) proteínas de peso molecular conhecido são submetidas à eletroforese (pista 1). Estas proteínas padronizadoras podem
ser empregadas para se determinar o Mr de uma proteína desconhecida (pista 2). b) um gráfico, no qual o logaritmo dos
pesos moleculares (Mr) das proteínas marcadoras é analisado em função da migração relativa de cada proteína durante a
eletroforese, permite que seja determinado o peso molecular da proteína desconhecida.
Uma solução 
de anfólito é 
incorporada ao 
gel
Um gradiente 
estável do pH é 
estabelecido no 
gel através da 
aplicação de um 
campo elétrico
A solução 
protéica é 
adicionada e 
o campo 
elétrico 
reaplicado
A coloração das 
proteínas 
mostra que elas 
estão 
distribuídas ao 
longo do 
gradiente de pH
Focalização isoelétrica – essa técnica separa as proteínas de acordo com seus pontos 
isoelétricos.
Eletroforese bidimensional: primeiro as
proteínas são separadas por focalização
isoelétrica. Depois o gel é colocado
horizontalmente sobre uma outra placa de
gel de poliacrilamida contendo SDS e as
proteínas separadas por eletroforese.
Nesse processo, as separações no sentido
horizontal refletem diferenças de pI e no
sentido vertical diferenças de peso
molecular
Focalização isoelétrica
pI decrescente
Primeira 
dimensão
Gel de focalização 
isoelétrica é 
colocado em gel 
de poliacrilamida 
com SDS
Segunda 
dimensão
Eletroforese 
em gel de 
poliacrilamida 
com SDS
Mr decrescente
pI decrescente