UNIDADE 3

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UNIDADE 3.
Testes de identificação das principais bactérias de interesse clínico
OBJETIVOS DA UNIDADE
· 
Compreender os testes para identificação das espécies de estreptococos, enterococos e estafilococos;
· 
Apresentar as características e metodologias para diferenciação das espécies de estafilococos;
· 
Descrever as características e os testes para correta identificação de membros da família Enterobacteriaceae
Estreptococos
–
// Estreptococos B-hemolíticos
// Estreptococos B-hemolíticos
Enterococos
–// Testes para identificação das espécies de enterococos
Estafilococos
–// Testes para identificação das espécies de estafilococo
// Identificação adicional e métodos rápidos
Enterobacteriaceae
–// Testes para identificação de membros da família Enterobacteriaceae
Estreptococos
Os estreptococos (Figura 1) são bactérias imóveis, microaerofílicas, esféricas e Gram-positivas (cocos). Geralmente, ocorrem como cadeias ou pares, e são anaeróbios facultativos ou estritos. Os estreptococos apresentam um teste de catalase negativo, enquanto os estafilococos são positivos para a catalase. A divisão celular das espécies de estreptococos envolve dois eventos biossintéticos separados: o alongamento da parede celular periférica e a síntese da parede septal.
Por serem incapazes de sintetizar citocromos, os estreptococos não podem realizar a fosforilação oxidativa. Eles são capazes de fermentar açúcares, são muito tolerantes a ácidos e estão entre as bactérias produtoras de ácido láctico, que é sempre seu produto final. Existem muitas fontes naturais de estreptococos, incluindo humanos e diversos animais, frequentemente colonizando as superfícies mucosas da boca, o trato intestinal, a nasofaringe e a orofaringe. Fontes de alimentos com alto risco de contaminação por estreptococos incluem leite e laticínios, ovos, lagosta cozida no vapor, presunto moído, salada de batata, pudim de arroz e salada de camarão. 
A presença de estreptococos na água potável indica contaminação fecal e, na maioria dos casos de intoxicação alimentar, a comida foi deixada em temperatura ambiente por várias horas entre o preparo e o consumo. Assim, sabe-se que a contaminação dos alimentos é geralmente o resultado de falta de higiene, manuseio por pessoas infectadas ou o uso de leite cru (não pasteurizado).
Embora possam ser patógenos potentes, alguns estreptococos são comercialmente importantes para a produção de queijo e iogurte, incluindo S. lactis, S. cremoris, S. diacetylactis e S. thermophilus, sendo esse último o mais conhecido. De acordo com a classificação científica dos estreptococos, eles pertencem ao reino Eubacterias, filo Firmicutes, classe Bacilli, ordem Lactobacillales, família Streptococcaceae e gênero Streptococcus.
A maneira mais conveniente de começar a identificar os estreptococos é determinar a hemólise da bactéria em placas de ágar sangue (Figura 2). Uma vez que os estreptococos são divididos em categorias β-hemolíticas e não β-hemolíticas, a diferenciação em espécies, grupos e categorias pode ser feita. A identificação da maioria das cepas β-hemolíticas é realizada pela determinação das características antigênicas da cultura, enquanto a identificação das cepas não β-hemolíticas é realizada pela determinação das características antigênicas e fisiológicas da cultura.
ESTREPTOCOCOS β-HEMOLÍTICOS
Os estreptococos β-hemolíticos podem ser classificados em seis grupos, estipulados pela cientista Rebecca Lancefield, em 1933
O primeiro grupo é constituído pelos Streptococcus do grupo A, também conhecidos como Streptococcus pyogenes. Sua identificação é confirmada pela demonstração da presença do antígeno do grupo A nas células estreptocócicas. Vale ressaltar que todos os S. pyogenes possuem antígeno do grupo A, mas nem todos os estreptococos com antígeno do grupo A são S. pyogenes, pois algumas cepas de S. anginosus e S. dysgalactiae subsp. equisimilis também podem ter antígeno do grupo A. 
As cepas não pyogenes crescem mais lentamente e formam colônias menores do que as cepas de S. pyogenes. Se as colônias β-hemolíticas parecerem pequenas e o crescimento for retardado, ou se for necessário dióxido de carbono para o crescimento, ou, ainda, se a cepa do grupo A for PYR negativa, o microbiologista deve suspeitar que a cepa possa ser S. anginous ou S. dysgalactiae subsp. equisimilis, independentemente da reação do grupo. Quando isso ocorre, a cepa deve ser testada para a reação de Voges-Proskauer (VP), conforme Quadro 1, que mostram os testes sorológicos e fisiológicos usados para identificar quase todos os estreptococos ß-hemolíticos isolados de infecções humanas.
Quadro 1. Identificação dos estreptococos β-hemolíticos. Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p. 334. (Adaptado).
Os estreptococos do grupo B de Lancefield também são conhecidos como Streptococcus agalactiae. Como os estreptococos do grupo A, a identificação é confirmada pela demonstração de que as células estreptocócicas contêm o antígeno do grupo B. Uma vez que o antígeno do grupo B não é identificado com nenhuma outra cepa estreptocócica, os termos do grupo B de Lancefield e S. agalactiae são sinônimos.
Os estreptococos β-hemolíticos que contêm o antígeno do grupo C são encontrados em várias espécies diferentes e no grupo de bactérias de S. anginous. Por outro lado, os estreptococos β-hemolíticos com antígeno do grupo G não tiveram um nome taxonômico oficial. Alguns pesquisadores sugeriram que essas cepas fossem chamadas de S. canis, mas isso não obteve aprovação oficial em uso prático. Assim, os estreptococos β-hemolíticos com antígeno do grupo G devem ser relatados simplesmente como estreptococos do grupo G de Lancefield.
Por fim, S. anginosus é usado para relatar cepas de estreptococos que podem ou não ter antígenos de grupo A, C, F ou G, apesar de a maioria dessas cepas ter antígeno do grupo F. Tecnicamente, algumas podem ser S. intermedius ou S. constellatus, mas todas essas cepas são VP positivas e são as únicas cepas β-hemolíticas com essa característica. A maioria delas requer dióxido de carbono adicional para o crescimento em placas de ágar sangue, sendo que, frequentemente, esse crescimento não é aparente até 48 horas de incubação.
Existem outros estreptococos β-hemolíticos que raramente são encontrados em infecções humanas. Algumas das cepas estão associadas a infecções em suínos e apresentam antígenos de grupos específicos. Cepas β-hemolíticas com antígeno do grupo L têm sido associadas a fontes aviárias (frango) e sugere-se que essas cepas sejam chamadas de S. dysgalactiae. As cepas β-hemolíticas com antígeno do grupo M não são bem estudadas e não existe um nome taxonômico sugerido para elas.
Uma cepa β-hemolítica com um antígeno de grupo não nomeado (sugere-se a letra X), isolada de golfinhos de água doce e, ocasionalmente, em infecções humanas, é chamada de S. iniae. Essa bactéria pode ser apresentada como estreptococos do grupo A, pois é capaz de reagir com o anticorpo do grupo A no ensaio de aglutinação em lâmina de látex, sendo também PYR positivo, mas não é sensível à bacitracina. Dessa forma, sempre que uma bactéria positiva do grupo A de aglutinação de látex for submetida ao teste e apresentar-se como não sensível à bacitracina, a reação do grupo deve ser confirmada, usando o procedimento de extração de Lancefield.
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ESTREPTOCOCOS NÃO β-HEMOLÍTICOS E NÃO HEMOLÍTICOS
Os estreptococos não β-hemolíticos podem ser divididos em seis espécies e dois grupos, com testes bacteriológicos simples. Em alguns casos, em que apenas as cepas de S. pneumoniae (Figura 3) são suspeitas, somente a optoquina e os testes de bile-solubilidade precisam ser determinados. Culturas de vigilância pneumocócica, culturas de investigação epidemiológica pneumocócica e isolados de locais não estéreis (escarro) são culturas examinadas apenas para pneumococos. 
Se os testes de suscetibilidade à optoquina e solubilidade biliar forem negativos, o relatório pode simplesmente não indicar a presença de pneumococos. Desse modo, os estreptococos não β-hemolíticos podemser identificados em nível de espécie ou grupo (Quadro 2). As culturas de S. pneumoniae são α-hemolíticas, em meio de ágar sangue e podem ser identificadas e diferenciadas das espécies de S. viridans por sua suscetibilidade à optoquina (com halo de inibição) e solubilidade biliar. 
Quadro 2. Identificação de cocos Gram-positivos em cadeias não β-hemolíticas. Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p. 336. (Adaptado).
CONTEXTUALIZANDO
A evolução genômica, a transmissão e a patogênese do S. pneumoniae são impulsionadas principalmente pelo transporte nasofaríngeo. Variantes de cepas altamente divergentes surgem durante os episódios de colonização, por meio de recombinação homóloga intra-hospedeiro em tempo real, enquanto o resto é cotransmitido ou adquirido, independentemente, durante vários episódios de colonização. A evolução paralela gênica e intergênica, por sua vez, ocorre particularmente em genes de resistência a antibióticos, evasão imune e adesão epitelial, que contribuem para a virulência e a capacidade patogênica da espécie.
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Enterococos
Os enterococos são cocos gram-positivos que ocorrem em pares isolados e cadeias curtas. As células são, algumas vezes, cocobacilares, quando o Gram é preparado a partir do crescimento do microrganismo na placa de ágar (Figura 4), e mais ovais e em cadeias, quando o Gram é preparado a partir do caldo de tioglicolato. Sabe-se que os enterococos são facultativamente anaeróbicos e o crescimento ideal ocorre a 35 °C, enquanto, para a maioria das cepas, o crescimento se dá entre 10 ºC a 45 ºC.
Vale considerar que todas as cepas crescem em caldo contendo 6,5% de NaCl e hidrolisam esculina na presença de 40% de sais biliares (meio bile-esculina). A motilidade é observada em algumas espécies e, assim, sabe-se que enterococos hidrolisam a pirrolidonil-β-naftilamida (PYR), com exceção de E. cecorum, E. columbae e E. saccharolyticus. Contudo, a maioria das cepas produz leucina aminopeptidase (LAP) e algumas, pertencentes aos enterococos do Grupo I, apresentam testes LAP negativos. 
Os enterococos não contêm enzimas citocromo, sendo catalase negativos. Além disso, quase todas as cepas são homofermentivas, o gás não é produzido e o ácido lático é o produto final da fermentação da glicose. A maioria das cepas produz um antígeno de ácido glicerol teicoico, associado à parede celular, que é identificado como o antígeno do grupo D de estreptococos. A detecção do antígeno do grupo D, às vezes, é difícil e depende do procedimento de extração e da qualidade do antissoro usado.
TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE ENTEROCOCOS
Uma vez estabelecido que o coco é Gram-positivo, e é negativo para catalase, sendo, portanto, enterococos, os testes listados no Quadro 3 podem ser usados para identificar a espécie. As espécies dividem-se em cinco grupos, com base nas reações de formação de ácido em caldos de manitol, sorbitol, sorbose e hidrólise de arginina, sendo que:
o Grupo I consiste em E. avium, E. malodoratus, E. raffinosus, E. pseudoavium, E. saccharolyticus, E. gilvus e E. pallens. Essas espécies formam ácido em todos os três dos caldos de carboidratos, mas não hidrolisam a arginina;
o Grupo II consiste em E. faecalis, E. faecium, E. casseliflavus, E. mundtii e E. gallinarum, e E. haemoperoxidus. Essas espécies formam ácido no caldo de manitol, hidrolisam a arginina, mas não formam ácido no caldo de sorbose, e dão reações variáveis no caldo de sorbitol;
o Grupo III consiste em E. durans, E. hirae, E. dispar, E. porcinus, E. ratti, E. faecium e variante de E. faecalis e E. villorum. Essas espécies hidrolisam arginina, mas não formam ácido em caldos de manitol, sorbitol ou sorbose;
o Grupo IV contém E. sulfureus, E. asini, E. cecorum e E. phoeniculicola. Essas espécies são negativas para sorbose e não hidrolisam a arginina; e
o Grupo V consiste em E. casseliflavus, E. gallinarum, E. faecalis e E. columbae, E. hermanniensis, E. moraviensis e E. canis.
Quadro 3. Características fenotípicas utilizadas para a identificação de algumas espécies de Enterococos. Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012. (Adaptado).
Desse modo, o teste de pigmentação auxilia na identificação de E. casseliflavus, E. mundtii, E. pullins, E. gilvus e E. sulfureus. Esses enterococos produzem um pigmento amarelo que pode ser detectado em vários meios diferentes. O teste de utilização do piruvato auxilia na diferenciação de E. faecalis e E. faecium, e também é usado para ajudar a diferenciar entre as cepas variantes de E. faecalis e E. hirae. Por fim, o teste de tolerância ao telurito auxilia na diferenciação de E. faecalis e E. faecium, considerando que E. haemoperoxidus é variável na reação de manitol e pode estar no grupo II ou III.
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Estafilococos
Seção 4 de 5
As bactérias do gênero Staphylococcus são patógenos do homem e de outros mamíferos. Tradicionalmente, eles eram divididos em dois grupos, com base em sua capacidade de coagular o plasma sanguíneo (a reação da coagulase): os estafilococos coagulase-positivos, que constituem a espécie mais patogênica de S. aureus; e os estafilococos coagulase-negativos (SNCs), que são agora conhecidos por compreender mais de 30 outras espécies. Vale lembrar que os SNCs são comensais comuns da pele, embora algumas espécies possam causar infecções.
Os estafilococos são cocos Gram-positivos, imóveis, não esporulados e de tamanhos variados, ocorrendo isoladamente, em pares e em aglomerados irregulares. As colônias são opacas e podem ser brancas ou creme e, ocasionalmente, amarelas ou laranja (Figura 5). A temperatura ótima de crescimento é entre 30 °C e 37 °C. Eles possuem um metabolismo fermentativo e são anaeróbios facultativos, com exceção de S. saccharolyticus e S.aureus subsp. anaerobius que, inicialmente, crescem anaerobicamente, mas podem se tornar mais aerotolerantes em subculturas.
Figura 5. Características das colônias de Staphylococcus spp. Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p. 361.
As espécies de Staphylococcus são geralmente catalase positiva (Figura 6) e oxidase negativa, com exceção do grupo S. sciuri (S. sciuri, S. lentus e S. vitulinus) e S. fleuretti. Esse também é um fator distintivo dos estreptococos do gênero, que são catalase negativos e têm uma composição de parede celular diferente dos estafilococos. Algumas espécies são suscetíveis à lise pelo lisostafina, mas não pela lisozima, e podem crescer em cloreto de sódio a 6,5%. Há também aquelas que produzem toxinas extracelulares.
Figura 6. Esquema de identificação de Staphylococcus spp. Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p. 363, (Adaptado).
Os estafilococos podem ser identificados pela produção de uma desoxirribonuclease termoestável (DNAse) e são muito comuns na natureza, sendo seu principal habitat a pele e as membranas mucosas dos mamíferos. Os estafilococos são cocos com cerca de 0,5 a 1,0 µm de diâmetro. Os aglomerados surgem porque os estafilococos se dividem em dois planos. No entanto, a configuração dos cocos ajuda a distinguir micrococos e estafilococos dos estreptococos, que geralmente crescem em cadeias. As observações devem ser feitas em culturas cultivadas em caldo, pois os estreptococos cultivados em meio sólido podem aparecer como aglomerados. Assim, vários campos devem ser examinados antes de decidir se aglomerados ou cadeias estão presentes.
TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE ESTAFILOCOCOS
O teste da catalase é importante para distinguir estafilococos de estreptococos (catalase-negativos). Ele é realizado adicionando-se gotas de peróxido de hidrogênio a 3% sobre uma amostra de ágar ou caldo de cultura. Vale ressaltar que as culturas catalase-positivas borbulham de uma vez e o teste não deve ser feito em ágar sangue, já que o próprio sangue produz bolhas.
O teste da DNAse é um ensaio laboratorial que avalia se o microrganismo tem a capacidade de ocasionar a degradação do DNA. Dessa forma, as colônias são semeadas em ágar DNA e, posteriormente ao período de incubação, utiliza-se solução de HCl a 37%, para revelar a presença ou não do halo. Sabe-se que o S.aureus apresenta positividade para esse teste. O teste de resistência à novobiocina, por outro lado, é um teste é feito para distinguir S. saprophyticus, resistente à novobiocina, de S. epidermidis, que é sensível.
A presença de estafilococos em uma lesão pode ser inicialmente suspeitada após o exame de uma coloração direta de Gram. No entanto, um pequeno número de bactérias no sangue impede o exame microscópico e exige cultura primeiro. O organismo sofre isolamento, espalhando material da amostra clínica (ou de uma hemocultura) em meio sólido, como ágar sangue, ágar triptona de soja ou ágar de infusão cérebro-coração (BHI). As amostras com probabilidade de estarem contaminadas com outros microrganismos podem ser semeadas em ágar de manitol, contendo cloreto de sódio a 7,5%, que permite o crescimento dos estafilococos halo-tolerantes. 
Idealmente, uma coloração de Gram da colônia deve ser realizada, além de testes para produção de catalase e coagulase, permitindo que o S. aureus coagulase-positivo seja identificado rapidamente. Outro teste muito útil para S. aureus é a produção de desoxirribonuclease termoestável. Assim, S. aureus pode ser confirmado testando colônias para aglutinação com partículas de látex, revestidas com imunoglobulina G e fibrinogênio, que se ligam à proteína A e ao fator de aglutinação, respectivamente, na superfície da célula bacteriana. 
O teste de látex mais recente incorpora anticorpos monoclonais para o polissacarídeo capsular dos sorotipos 5 e 8, a fim de reduzir o número de falsos negativos. Contudo, alguns isolados clínicos recentes de S. aureus não apresentam produção de coagulase e/ou fator de aglutinação, o que pode dificultar a identificação. Além disso, a associação de S. epidermidis (e, em menor extensão, de outros estafilococos coagulase-negativos) com infecções nosocomiais, associadas a dispositivos internos, significa que o isolamento dessas bactérias do sangue é provavelmente importante, e não devido à contaminação casual, particularmente se hemoculturas sucessivas são positivas. 
Atualmente, a identificação de S. epidermidis e outras espécies de Staphylococcus é realizada por meio de kits comerciais de identificação de biotipos, como API Staph Ident, API Staph-Trac, Vitek GPI Card e Microscan Pos Combo, que compreendem tiras pré-formadas, contendo substratos de teste. Além disso, a biologia molecular tem sido muito empregada para a identificação de Staphylococcus spp.
Os estafilococos coagulase negativa (SCN) são comensais normais da pele, narinas anteriores e canais auditivos de humanos. Eles são considerados não patogênicos e raramente causam infecções graves. No entanto, como resultado da combinação do aumento do uso de dispositivos intravasculares e um aumento no número de pacientes imunocomprometidos hospitalizados, os SCNs surgiram como uma das principais causas de infecções nosocomiais da corrente sanguínea.
Eles são patógenos oportunistas que carecem de muitos dos fatores de virulência associados ao S. aureus. Sabe-se que existem mais de 30 espécies de SCNs, assim, a taxonomia se divide em grupos, com base em sequências de rRNA. S. epidermidis e S. saprophyticus são as espécies mais frequentemente associadas à infecção, mas S. capitis, S. cohnii, S. haemolyticus, S.hominis, S. lugdunensis, S. sciuri, S. schleiferi subespécie schleiferi, S. simulans, S. saccharolyticus (anteriormente conhecido como Peptococcus saccharolyticus) e S. warneri também foram implicados. Muitas dessas espécies também são termoestáveis com nuclease negativa.
A multirresistência a antibióticos também ocorre em algumas cepas de S. epidermidis. Os grupos S. saprophyticus, S. cohnii e S. sciuri são geralmente resistentes à novobiocina, assim como S. hominis subsp. novobiosepticus. S. pasteuri pode ser fenotipicamente distinto de todos os outros estafilococos sensíveis à novobiocina, por meio da ribotipagem, exceto S. warneri, do qual só pode ser diferenciado por genotipagem.
Nos Staphylococcus epidermidis tem aproximadamente entre 0,5 e 1,5 µm de diâmetro, e está organizado em cachos semelhantes a uvas. Eles são anaeróbios facultativos que podem crescer por respiração aeróbica ou por fermentação, porém algumas cepas podem não fermentar. Eles formam colônias branco-acinzentadas, elevadas, circulares, lisas, brilhantes, de translúcidas a levemente opacas, coesivas com aproximadamente 1 a 2 mm de diâmetro após incubação durante a noite, e não são hemolíticas em ágar sangue. Eles crescem bem em concentrações de NaCl de até 7,5%, fracamente a 10% e não crescem a 15%. Eles são suscetíveis, ou ligeiramente resistentes, à lisostafina e são resistentes à lisozima. S. epidermidis é sensível à novobiocina, distinguindo-o do S. saprophyticus, que também é coagulase negativo, mas resistente à novobiocina.
O Staphylococcus saprophyticus são positivos para testes de catalase e urease, mas negativos para testes de motilidade, coagulase, redução de nitrato e oxidase. Eles crescem bem em ágar NaCl 10%, contudo apenas 11 a 89% das cepas toleram NaCl 15%. As colônias aparecem como elevadas a ligeiramente convexas, circulares, geralmente inteiras, com 4,0 a 9,0 mm de diâmetro, lisas, brilhantes e geralmente opacas. O pigmento da colônia é variável. Entretanto, a maioria das cepas não é pigmentada, ou pode ter uma leve tonalidade amarela, que aumenta de intensidade com a idade.
Há duas subespécies de S. saprophyticus: S. saprophyticus subsp. bovis e S. saprophyticus subsp. saprophyticus. O último é mais comumente encontrado em UTIs humanas. S. saprophyticus subsp. saprophyticus se distingue por ser nitrato redutase e pirrolidonil arilamidase negativo, enquanto S. saprophyticus subsp. bovis é nitrato redutase e pirolidonil arymamidase positiva. É importante considerar que S. saprophyticus é resistente ao antibiótico novobiocina, uma característica que é usada na identificação laboratorial para distingui-lo de S. epidermidis, que também é coagulase negativo, mas sensível à novobiocina.
IDENTIFICAÇÃO ADICIONAL E MÉTODOS RÁPIDOS
Ocasionalmente, S. aureus é recuperado de casos de suspeita de doença mediada por toxinas, como, por exemplo, síndrome da pele escaldada estafilocócica, síndrome do choque tóxico, toxina PVL, pneumonia necrosante, impetigo bolhoso e intoxicação alimentar. Uma variedade de métodos de tipagem rápida atuais foi desenvolvida para isolados de amostras clínicas, que incluem técnicas moleculares, como eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), sequenciamento do gene 16S rRNA, polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição por PCR (PCR-RFLP), tipagem de spa, análise de repetição em série de número variável de múltiplos locus (MLVA) e múltiplos locus tipagem de sequência (MLST). 
Todas essas abordagens permitem a subtipagem de cepas com precisão, poder discriminatório e reprodutibilidade diferentes. Para uma investigação molecular mais aprofundada, a análise de Microarray e o polimorfismo de nucleotídeo único (PNUs), que procuram substituir PFGE e MLVA, e até mesmo o sequenciamento de genoma completo (SGC) podem ser opções, já que novas tecnologias (por exemplo, o sequenciamento de Ion Torrent) permitem resultados de SGC dentro de alguns dias. Entretanto, alguns desses métodos permanecem acessíveis apenas aos laboratórios de referência e são difíceis de implementar para a identificação bacteriana de rotina em um laboratório clínico.
As sequências do gene rRNA 16S têm sido úteis, em estudos filogenéticos em nível de gênero, mas seu uso tem sido questionado em estudos em nível de espécie de Staphylococcus. Isso decorre do fato de que espécies intimamente relacionadas podem ter sequências de rRNA 16S idênticas ou divergentes, que podem existir dentro de um único organismo. S. caprae e S. capitis não podem ser distintos por suas sequências do gene rRNA 16S. Da mesma forma, algumas cepas de Staphylococcus têm as mesmas sequências do gene rRNA 16S em regiões variáveis (V1, V3, V7 e V9), com sequências idênticas ocorrendo, por exemplo, em S. vitulinus, S. saccharolyticus, S. capitissubsp urealyticus e S. caprae.
Devido ao número limitado de características estáveis que podem ser usadas para a discriminação de espécies, muitas permanecem difíceis de distinguir e são identificadas incorretamente, por testes fenotípicos. No entanto, a análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (PCR-RFLP), relatada para uso na identificação de estafilococos, tem se mostrado uma ferramenta adequada para a correta identificação de quase todas as espécies e subespécies de Staphylococcus prevalentes, independentemente de sua caracterização fenotípica.
Esse método requer apenas PCR e uma ou duas enzimas, sendo tecnicamente menos exigente do que a maioria de outras abordagens moleculares. É mais fácil de usar, menos dispendioso e menos dependente de equipamentos do que o sequenciamento, que também é capaz de discriminar subespécies das espécies S. capitis, S. carnosus, S. cohnii e S. hominis.
A eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) detecta variação genética entre cepas, usando endonucleases de restrição, seguido pela separação dos grandes fragmentos genômicos resultantes em um gel de agarose. É conhecido por ser altamente discriminatório e uma técnica frequentemente usada para investigações de surtos. No entanto, a estabilidade do PFGE pode ser insuficiente para uma aplicação confiável em estudos epidemiológicos de longo prazo. 
Devido à sua natureza demorada (30 horas ou mais para executar), sua necessidade de equipamentos especiais e a interpretação de seus resultados, muitas vezes subjetivos, a PFGE não é amplamente utilizada fora dos laboratórios de referência. Esses problemas tornam a troca de informações de tipagem de cepas difícil e complicam a criação de um banco de dados de tipagem de S. aureus e Staphylococcus aureus resistentes à Meticilina (MRSA). 
CURIOSIDADE
A eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) é afetada por fatores como a composição e a concentração de agarose, a solução tamponante, a tensão da corrente elétrica (voltagem), o tempo de pulso e o tempo de corrida eletroforética. Outros fatores, como o grau de uniformidade, a força relativa dos campos elétricos, o ângulo entre os campos elétricos que se alternam (de acordo com o aparelho empregado), a temperatura de corrida e, ainda, a integridade do DNA, também podem afetar o limite de resolução da técnica (MAGALHÃES et al., 2005).
Atualmente, a PFGE continua sendo a técnica mais discriminatória para tipagem de S. aureus e permite a constituição de bancos de dados compartilhados apenas em nível nacional, não sendo adequada para estudos populacionais. Mais recentemente, o PFGE tem sido usado para tipagem epidemiológica de MRSA.
A análise de repetição tandem de número de variável de múltiplos locus (MLVNTR) é um método usado para realizar a tipagem molecular de microrganismos específicos. Ele utiliza a variação que ocorre naturalmente no número de sequências de DNA repetidas em tandem, encontradas em muitos loci diferentes, no genoma de uma variedade de organismos. Os perfis de tipagem molecular são usados para estudar as vias de transmissão, para avaliar as fontes de infecção e para avaliar o impacto da intervenção humana, como a vacinação e o uso de antibióticos na composição das populações bacterianas, sendo usado com sucesso para a genotipagem de S. aureus.
O sequenciamento de spa parece ser uma ferramenta de tipagem rápida, altamente eficaz para S. aureus, que, apesar de algum custo de especificidade, tem vantagens significativas em termos de velocidade, facilidade de uso, facilidade de interpretação e padronização entre laboratórios. Ele fornece uma discriminação adequada para investigação de surtos, sendo uma vantagem adicional a de que as informações de tipagem adequadas são obtidas de um único locus, ao contrário da tipagem de sequência multi-locus, que requer a combinação de informações alélicas de muitos genes. 
Foi documentado que as sequências de repetição de spa por si mesmas definem um excelente poder de resolução entre as cepas de S. aureus. A tipagem spa atribui corretamente as cepas estafilocócicas aos grupos filogenéticos apropriados e tem um desempenho melhor do que a eletroforese enzimática multi-locus e a PFGE, além de facilitar a detecção de macros e microvariações. No entanto, o spa tem algumas desvantagens, como ser insuficientemente discriminatório em regiões onde um determinado clone/pequeno número de clones são endêmicos, não sendo recomendado para laboratórios de hospitais locais menores e, atualmente, ainda não sendo usado universalmente.
A tipagem de sequência multi-locus (MLST) mede as variações da sequência de DNA em um conjunto de genes de manutenção, diretamente, e caracteriza as cepas por seus perfis alélicos exclusivos. O princípio do MLST é simples: a técnica envolve amplificação por PCR, seguida de sequenciamento de DNA. As diferenças de nucleotídeos entre as cepas podem ser verificadas em um número variável de genes, dependendo do grau de discriminação desejado. Isso tem sido usado para fornecer um método confiável de caracterizar clones de MRSA, bem como investigar a epidemiologia e a filogenia de S. lugdunensis, além de ser usado para analisar a evolução de S. epidermidis.
A tecnologia de microarray de DNA pode fornecer informações detalhadas e clinicamente relevantes sobre o isolado clínico, detectando a presença ou ausência de um grande número de genes associados a vírus simultaneamente, em um único ensaio. Entretanto, seu valor clínico foi limitado por uma metodologia complicada, inadequada para o uso rotineiro em laboratórios de microbiologia diagnóstica. Isso tem sido usado para diferenciar com sucesso S. aureus sensível à meticilina, resistente à meticilina, adquirido na comunidade e resistente à vancomicina, e para detectar simultaneamente determinantes de virulência clinicamente relevantes.
Por fim, o sequenciamento de genoma completo (SGC) é um processo laboratorial que determina a sequência completa de DNA do genoma de um organismo em um único momento. Existem várias técnicas de alto rendimento que estão disponíveis e são usadas para sequenciar um genoma inteiro, como pirosequenciamento, tecnologia de nanopore, etc. Esse método de sequenciamento é uma grande promessa para a identificação rápida, precisa e abrangente das vias de transmissão bacteriana em ambientes hospitalares e comunitários, com reduções concomitantes em infecções, morbidade e custos.
Isso tem sido útil na detecção de S. aureus resistente à meticilina em um surto, além de ser usado para destacar diferenças extensivas no conteúdo do genoma entre os grupos S. intermedius, S. pseudintermedius e S. delphini, que habita nichos de hospedeiro distintos, bem como fornece novos caminhos para a pesquisa em patogênese e adaptação do hospedeiro bacteriano.
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Enterobacteriaceae
A família Enterobacteriaceae contém um grande número de gêneros que são relacionados uns aos outros, de forma bioquímica e genética. Muitas das bactérias tradicionais ou mais familiares são encontradas nessa família, como Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Proteus, Yersinia, etc. As características comuns entre todos os membros da família Enterobacteriaceae são que eles:
A família Enterobacteriaceae contém um grande número de gêneros que são relacionados uns aos outros, de forma bioquímica e genética. Muitas das bactérias tradicionais ou mais familiares são encontradas nessa família, como Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Proteus, Yersinia, etc. As características comuns entre todos os membros da família Enterobacteriaceae são que eles:
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são Gram negativos, aparecendo como bastonetes curtos;
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são anaeróbios facultativos não esporulados;
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são catalase positiva;
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têm necessidades nutricionais simples;
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possuem motilidade, se presente, por meio de flagelos peritricosos (laterais), exceto no caso de Shigella e Klebsiella, que são imóveis;
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têm citocromo C oxidase negativo (entérico sempre negativo, separando bactérias entéricas de bactériaspositivas para oxidase dos gêneros Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio, Achromobacter, Flavibacterium e Cardiobacterium, que podem ter morfologia semelhante);
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reduzem o nitrato a nitrito (distingue as bactérias entéricas das bactérias que reduzem o nitrato a gás nitrogênio, como Pseudomonas e muitas outras bactérias positivas para oxidase);
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contêm um antígeno característico, denominado antígeno comum enterobacteriano;
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produzem ácido a partir da glicose;
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possuem capacidade de fermentar lactose, que distingue bactérias entéricas de bactérias aeróbias obrigatórias; e
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não necessitam de sódio para o crescimento, que também não lhe é estimulante.
O ágar MacConkey (Figura 7) é usado para isolar e diferenciar organismos da família Enterobacteriaceae (colônias de cor rosa de fermentadores de lactose-coliformes e colônias de cores claras de fermentadores sem lactose). São membros desses dois grupos os Enterobacteriaceae fermentadores de lactose, como Citrobacter, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, e os Enterobacteriaceae não fermentadores de lactose, como Shigella, Yersinia, Proteus e Salmonella.
TESTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE MEMBROS DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE
Membros da família Enterobacteriaceae são identificados com base em suas propriedades bioquímicas, sendo os testes bioquímicos mais comumente usados para identificá-los: o teste de utilização de citrato; o teste indol; o teste de motilidade; o teste de vermelho de metila (vm); o teste Voges-Proskauer (vp); o teste de agar triplo açúcar ferro (tsi); e o teste de urease.
O teste de utilização de citrato é comumente empregado como parte de um grupo de testes: os testes IMViC (Indol, vermelho de metila, VP e Citrato), que distinguem os membros da família Enterobacteriaceae com base em seus subprodutos metabólicos. A utilização de citrato pode ser usada para distinguir entre coliformes, como Klebsiella aerogenes, que ocorre naturalmente no solo e em ambientes aquáticos, e coliformes fecais, como Escherichia coli, cuja presença seria indicativa de contaminação fecal. 
O teste de utilização de citrato é usado para determinar a capacidade das bactérias de utilizar citrato de sódio, como sua única fonte de carbono, e dihidrogenofosfato de amônio inorgânico, como a única fonte fixa de nitrogênio. Quando um ácido orgânico, como o citrato, é usado como fonte de carbono e energia, carbonatos e bicarbonatos alcalinos são produzidos. Além disso, o hidróxido de amônio é produzido quando os sais de amônio são usados como única fonte de nitrogênio. 
A utilização de citrato exógeno requer a presença de proteínas de transporte de citrato (permeases). Após a absorção pela célula, o citrato é clivado pelo citrato liase em oxaloacetato e acetato. O oxaloacetato é então metabolizado em piruvato e CO2. O dióxido de carbono, que é liberado, irá subsequentemente reagir com a água e o íon sódio no meio para produzir carbonato de sódio, um composto alcalino que aumentará o pH. Além disso, o hidróxido de amônio é produzido quando os sais de amônio do meio são usados como única fonte de nitrogênio.
O crescimento geralmente resulta no indicador azul de bromotimol, passando de verde para azul. O indicador de pH do azul de bromotimol é um verde-floresta profundo em pH neutro. Com um aumento no pH médio para acima de 7,6, o verde transforma-se em azul, devido à alcalinização (Figura 8). Assim, deve-se inocular ao ágar citrato uma colônia que tem de 18 a 24 horas, incubando-a de 35 °C a 37 °C, por 18 a 24 horas. Contudo, alguns organismos podem requerer até sete dias de incubação, devido à sua taxa limitada de crescimento em meio citrato. Assim, os resultados podem ser:
Citrato positivo
O crescimento será visível na superfície oblíqua e o meio será azul intenso. Os carbonatos e bicarbonatos alcalinos, produzidos como subprodutos do catabolismo do citrato, elevam o pH do meio para acima de 7.6, fazendo com que o azul de bromotimol mude da cor verde original para azul. As bactérias citrato positivo incluem: Klebsiella pneumoniae, espécies de Enterobacter (a minoria das cepas dá resultado negativo), Citrobacter freundii, Salmonella (exceto Typhi e Paratyphi A), Serratia marcescens, Proteus mirabilis (a minoria das cepas dá resultado negativo) e Providencia.
 Citrado negativo Vestígios ou nenhum crescimento serão visíveis. Nenhuma mudança de cor ocorrerá, o meio permanecerá com a cor verde floresta profunda do ágar não inoculado. As bactérias citrato negativo incluem Escherichia coli, Shigella spp., Salmonella typhi, Salmonella Paratyphi A, Morganella morganii e Yersinia enterocolitica.
O teste de indol é usado para determinar a capacidade de um organismo de dividir o aminoácido triptofano para formar o composto indol. O triptofano é hidrolisado pela triptofanase para produzir três produtos finais possíveis, sendo um deles o indol. A produção de indol é detectada pelo reagente de Kovac ou Ehrlich, contendo o 4(p)-dimetilamino benzaldeído, que reage com o indol para produzir um composto de cor vermelha. Assim, o teste de indol é um teste bioquímico para diferenciar Enterobacteriaceae de outros gêneros e conta com dois métodos:
· Um método de tubo convencional, que requer incubação durante a noite e identifica organismos produtores de indol fracos; a
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Um teste local de indol, que detecta organismos produtores de indol rápidos.
No método de tubo convencional, devemos inocular as colônias isoladas do microrganismo em caldo de triptofano e incubar a 37 °C por 24 a 28 horas, ao ar ambiente, e adicionar 0,5 ml de reagente de Kovac ao caldo de cultura. Os resultados esperados podem ser vistos na Figura 9:
O teste local de indol é usado para determinar a presença da enzima triptofanase, responsável por quebrar o triptofano para liberar indol, que, quando reage com o cinamaldeído, produz um composto azul esverdeado. A ausência de enzima resulta na não produção de cor (isto é, indol negativo). Para realização do teste, devemos saturar um pedaço de papel de filtro com o reagente paradimetil aminocinamaldeído a 1% e, usando um bastão de madeira ou alça bacteriológica para remover uma pequena porção de uma colônia bacteriana da superfície do ágar, esfregar a amostra no papel de filtro. 
Deve ser observado que o inóculo bacteriano não deve ser retirado do Ágar MacConkey, porque a cor das colônias de fermentação de lactose, nesse meio, pode interferir na interpretação do teste. Resultados esperados:
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Desenvolvimento de uma cor azul em 30 segundos (maioria dos organismos indol positivos); 
Sem desenvolvimento de cor ou levemente rosado.
O teste local de indol, juntamente com o resultado da coloração de Gram e as características da colônia, pode ajudar na rápida identificação de isolados. Por exemplo, uma colônia de fermentação de lactose seca (rosa) em ágar MacConkey, que também é positiva para indol local e negativa para oxidase, pode ser relatada presumivelmente como E.coli. Organismos que se aglomeram em ágar sangue de carneiro a 5%, que exibem um odor característico e são negativos para oxidase, podem ser presumivelmente identificados como Proteus spp. 
Com mais testes por indol local, os isolados positivos podem ser relatados como Proteus vulgaris e os negativos como Proteus mirabilis. A maioria das cepas de E.coli, P. vulgaris, M. morganii e Providenica são indol positivos. Klebsiella oxytoca é indol positiva, enquanto Klebsiella pneumoniae é indol negativa. Por fim, Citrobacter Koseri é indol positivo, enquanto Citrobacter freundii é indol negativo.
No teste de motilidade, as bactérias móveis se movem com estruturas chamadas flagelos (algumas bactérias excepcionais se movem com a ajuda de filamentos axiais, que não podem ser vistos no microscópio). Em meio de ágar semissólido, as bactérias móveis resultam em um crescimento difuso, que se espalha e é facilmente reconhecido a olho nu. 
Para esse teste, devemos preparar um meio de ágar semissólido em um tubo de ensaio e inocular, com uma alça, colônias do microrganismono centro do tubo, até cerca de metade da profundidade do meio. Em seguida, devemos incubar, em condições que favoreçam a mobilidade (37 °C), e examinar em intervalos, como, após 6 horas, após um dia e após dois (depende do tempo de geração da bactéria). Por fim, seguramos o tubo contra a luz e observamos a linha central, para determinarmos a motilidade (Figura 10).
No laboratório, o teste de motilidade em meio semissólido é comumente utilizado para a identificação de bactérias gram-negativas da família Enterobacteriaceae. Ele é feito em conjunto com outros testes bioquímicos, usando meios especiais, como: 
SIM O meio sulfeto de indol motilidade (SIM), que é um ágar semissólido usado para determinar a produção de sulfeto de hidrogênio (H₂S), a formação de indol e a motilidade.
Miu-O teste de motilidade indol urease (MIU), que é usado para determinar a motilidade, a formação de indol e a produção de urease (teste de urease).
O teste de motilidade também é usado para a diferenciação de espécies de cocos gram-positivos, enterococos. Assim, Enterococcus faecium e E. faecalis são imóveis, enquanto E. gallinarum e E. casseliflavus/E. flavescens geralmente são móveis.
O teste de vermelho de metila (VM) determina se o micróbio realiza a fermentação de ácidos mistos, quando recebe glicose. Tipos e proporções de produtos de fermentação produzidos pela fermentação anaeróbica de glicose são uma das principais características taxonômicas que ajudam a diferenciar vários gêneros de bactérias entéricas. Quanto aos resultados, temos: 
Positivo quando o meio de cultura fica vermelho após a adição de vermelho de metila, devido a um pH igual ou inferior a 4,4 da fermentação da glicose.
Resultado negativo
–quando o meio de cultura permanece amarelo, o que ocorre quando menos ácido é produzido (o pH é mais alto) a partir da fermentação da glicose.
O desenvolvimento de uma cor vermelha estável na superfície do meio indica produção de ácido suficiente para baixar o pH para 4,4, constituindo um teste positivo. Como outros organismos podem produzir quantidades menores de ácido a partir do substrato de teste, uma cor laranja, intermediária entre o amarelo e o vermelho, pode se desenvolver. Isso não indica um teste positivo. Assim, podemos elencar como exemplo de VM positivo o Escherichia coli e, de VM negativo, o Klebsiella aerogenes.
O teste Voges-Proskauer (VP) é assim chamado devido a um epônimo duplo, em homenagem a dois microbiologistas que trabalharam no início do século XX. Eles primeiro observaram a reação de cor vermelha, produzida por meios de cultura apropriados, após o tratamento com hidróxido de potássio. Posteriormente, foi descoberto que o produto ativo no meio, formado pelo metabolismo bacteriano, é o acetil metil carbinol, um produto da via do butilenoglicol. 
Organismos, como os membros do grupo Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia, produzem acetoína como o principal produto final do metabolismo da glicose e formam quantidades menores de ácidos mistos. Na presença de oxigênio atmosférico e hidróxido de potássio a 40%, a acetoína é convertida em diacetil e o alfa-naftol serve como catalisador para formar um complexo vermelho. 
Um teste positivo é representado pelo desenvolvimento de uma cor vermelha, 15 minutos ou mais após a adição dos reagentes, indicando a presença de diacetil, o produto da oxidação da acetoína. O teste não deve ser lido depois de permanecer por mais de uma hora, porque as culturas Voges-Proskauer negativas podem produzir uma cor semelhante ao cobre, resultando potencialmente em uma interpretação falsa positiva. Desse modo, VP positivos da família Enterobacteriaceae incluem espécies de Klebsiella, Hafnia e Serratia.
O teste de Agar Triplo Açúcar Ferro (TSI) é um teste que contém três açúcares (lactose, sacarose e glicose), ferro e ágar, como agente de solidificação (TSI é um meio semissólido com inclinação e extremidade). A adição de sacarose no ágar TSI permite a detecção precoce de bactérias coliformes, que fermentam a sacarose mais rapidamente do que a lactose. A adição de sacarose também ajuda na identificação de certas bactérias gram-negativas, que podem fermentar a sacarose, mas não a lactose. Assim, para a interpretação do TSI, devemos considerar que:
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se a lactose (ou sacarose) é fermentada, uma grande quantidade de ácido será produzida, o que torna o indicador vermelho de fenol amarelo, tanto na base quanto na inclinação. Alguns organismos geram gases, que produzem bolhas/rachaduras no meio; e
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se a lactose (ou sacarose) é fermentada, uma grande quantidade de ácido será produzida, o que torna o indicador vermelho de fenol amarelo, tanto na base quanto na inclinação. Alguns organismos geram gases, que produzem bolhas/rachaduras no meio; e
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se a lactose não é fermentada, mas a pequena quantidade de glicose é, o fundo do tubo deficiente em oxigênio será amarelo (o fundo do tubo tem comparativamente mais glicose do que a inclinação), mas, na inclinação, o ácido produzido será oxidado a dióxido de carbono e água pelo organismo e a inclinação será vermelha (pH alcalino ou neutro).
Se nem a lactose/sacarose nem a glicose forem fermentadas, tanto a base quanto a inclinação ficarão vermelhas. A inclinação pode se tornar um vermelho-púrpura mais profundo (mais alcalino) como resultado da produção de amônia a partir da desaminação oxidativa de aminoácidos. Se H2S é produzido, a cor preta de sulfeto ferroso é vista.
Por fim, o teste da uréase funciona devido ao fato de a ureia ser uma diamida do ácido carbônico, sendo hidrolisada, com liberação de amônia e dióxido de carbono. Muitos organismos, especialmente aqueles que infectam o trato urinário, têm uma enzima uréase, que é capaz de dividir a ureia na presença de água, para liberar amônia e dióxido de carbono. A amônia se combina com o dióxido de carbono e a água para formar carbonato de amônio, que torna o meio alcalino, transformando o indicador fenol de vermelho de sua cor laranja amarelo original para rosa brilhante. 
Os organismos que hidrolisam rapidamente (Proteus spp., Morganella morganii e algumas cepas de Providencia stuartii) produzirão fortes reações positivas em uma ou seis horas após a incubação. Os organismos positivos retardados (por exemplo, Klebsiella spp. e espécies de Enterobacter) irão produzir reações positivas fracas na inclinação, dentro de seis horas de incubação, que serão intensas durante a incubação posterior. O meio de cultura permanecerá com uma cor amarelada se o organismo for negativo para uréase, como, por exemplo, no caso de Escherichia coli (Figura 11).
Em laboratórios de diagnóstico de rotina, o resultado do teste de uréase é lido em 24 horas. Se o organismo produz a enzima uréase, a cor da inclinação muda de laranja claro para rosa e, se o organismo não produzir uréase, a inclinação e o topo do ágar permanecem laranja claro (o meio retém a cor original). Desse modo, o teste da uréase ajuda na identificação de espécies de Proteus (uréase positiva) e na diferenciação de outros membros da família Enterobacteriaceae, não fermentadores de lactose. O teste ainda é usado para a evidência presuntiva da presença de Helicobacter pylori em material de biópsia de tecido, colocando uma parte do material de biópsia de tecido triturado diretamente no caldo de uréase.
SINTETIZANDO
Nesta unidade, exploramos os testes de identificação das principais bactérias de interesse clínico, bem como os parâmetros comumente utilizados para a correta e completa identificação dos resultados e diagnósticos. Conhecemos os estreptococos e suas classificações hemolíticas, entre estreptococos β-hemolíticos (com seus grupos) e estreptococos não β-hemolíticos e não hemolíticos (entendendo, no processo, os pneumococos), identificando como categorizá-los e identificá-los, evitando a contaminação de alimentos. 
Em seguida, exploramos os enterococos, separando-os em cinco grupos com base na formação de ácidos, e os testes usados para identificá-los. Da mesma forma, os estafilococos foram analisados com base em suaprodução de desoxirribonuclease termoestável (DNAse), sendo dividios entre Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus saprophyticus, e seguindo com os testes usados para identificá-los, como o teste da catalase, o teste da DNAse e o teste de látex. Também podemos observar o uso de outros testes, mais rápidos, para fazer essa identificação. Assim, vimos as sequências do gene rRNA 16S, a análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (PCR-RFLP), a eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), a análise de repetição tandem de número de variável de múltiplos locus (MLVNTR), o sequenciamento de spa, a tipagem de sequência multi-locus (MLST), a tecnologia de microarray de DNA e o sequenciamento de genoma completo (SGC).
Por fim, a família Enterobacteriaceae foi investigada, apontando suas características tradicionais e os testes bioquímicos utilizados para identificar seus membros, como o teste de utilização de citrato, o teste de indol (que pode ser dividido em um método de tubo convencional e um teste local de indol), o teste de motilidade, o teste de vermelho de metila (VM), o teste Voges-Proskauer (VP), o teste de Agar Triplo Açúcar Ferro (TSI) e o teste da uréase.
	
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