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W BA 12 75 _V 1. 0 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 2 Maria de Sousa Carvalho Rossi Londrina Editora e Distribuidora Educacional S.A. 2023 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 1ª edição 3 2023 Editora e Distribuidora Educacional S.A. Avenida Paris, 675 – Parque Residencial João Piza CEP: 86041-100 — Londrina — PR Homepage: https://www.cogna.com.br/ Diretora Sr. de Pós-graduação & OPM Silvia Rodrigues Cima Bizatto Conselho Acadêmico Alessandra Cristina Fahl Ana Carolina Gulelmo Staut Camila Braga de Oliveira Higa Camila Turchetti Bacan Gabiatti Giani Vendramel de Oliveira Gislaine Denisale Ferreira Henrique Salustiano Silva Mariana Gerardi Mello Nirse Ruscheinsky Breternitz Priscila Pereira Silva Coordenador Camila Turchetti Bacan Gabiatti Revisor Marília Liotino dos Santos Editorial Beatriz Meloni Montefusco Carolina Yaly Márcia Regina Silva Paola Andressa Machado Leal Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)_____________________________________________________________________________ Rossi, Maria de Sousa Carvalho Microbiologia de alimentos/ Maria de Sousa Carvalho Rossi, – Londrina: Editora e Distribuidora Educacional S.A., 2023. 32 p. ISBN 978-65-5903-320-1 1. Microbiologia de alimentos. 2. Vigilância sanitária. 3. Segurança dos alimentos. I. Título. CDD 613.201579 _____________________________________________________________________________ Raquel Torres – CRB 8/10534 R831m © 2023 por Editora e Distribuidora Educacional S.A. Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta publicação poderá ser reproduzida ou transmitida de qualquer modo ou por qualquer outro meio, eletrônico ou mecânico, incluindo fotocópia, gravação ou qualquer outro tipo de sistema de armazenamento e transmissão de informação, sem prévia autorização, por escrito, da Editora e Distribuidora Educacional S.A. 4 SUMÁRIO Apresentação da disciplina __________________________________ 05 Classificação dos microrganismos nos alimentos ____________ 06 Fatores que interferem no desenvolvimento microbiano em alimentos ____________________________________________________ 18 Métodos de análises microbiológicas ________________________ 32 Alteração da qualidade de alimentos, critérios microbiológicos e legislações ___________________________________________________ 45 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 5 Apresentação da disciplina Olá, estudante! Convidamos você a conhecer de forma mais aprofundada o impacto da microbiologia de alimentos na sua vida e a importância do controle microbiológico na área de produção e manipulação de alimentos. Nesta disciplina, você conhecerá a classificação dos microrganismos nos alimentos e poderá compreender de que forma os microrganismos podem causar impactos positivos, por exemplo, na produção de determinados alimentos (pães, bebidas como vinho e cerveja, iogurtes); e negativos, como no caso da deterioração dos alimentos e doenças transmitidas por alimentos, por exemplo, botulismo e Salmonelose, em virtude da presença dos microrganismos. Além disso, poderá entender sobre os fatores que interferem no crescimento microbiano e como funciona a curva de crescimento dos microrganismos. Conhecerá os princípios aplicados nas técnicas de conservação e desinfecção nos alimentos, bem como os principais microrganismos que promovem a deterioração microbiana. Você estudará as análises microbiológicas, as principais metodologias utilizadas em laboratório e como analisar os resultados das análises microbiológicas, de acordo com os critérios estabelecidos pela legislação sanitária vigente. Ao final da disciplina, você conseguirá aplicar os conhecimentos no seu dia a dia, seja dentro de casa, evitando a contaminação dos alimentos, seja na sua atuação profissional, em estabelecimentos que produzem ou manipulam alimentos. Bons estudos! 6 Classificação dos microrganismos nos alimentos Autoria: Maria de Sousa Carvalho Rossi Leitura crítica: Marília Liotino dos Santos Objetivos • Conhecer a classificação dos microrganismos nos alimentos. • Compreender de que forma os microrganismos presentes nos alimentos podem ser benéficos ou maléficos para a saúde humana. • Identificar os principais microrganismos presentes nos alimentos. 7 1. Importância dos microrganismos nos alimentos Caro estudante, já parou para pensar que você entra em contato com microrganismos o tempo todo? Por exemplo, ao decidir, no café da manhã, comer um pão e tomar um iogurte com frutas, você inicia o dia consumindo bactérias láticas que são probióticos, essenciais para manter sua saúde intestinal. Microrganismos são seres vivos microscópicos, ou seja, invisíveis ao olho nu, e que estão presentes em todos os lugares: água, ar, terra e consequentemente nos alimentos, inclusive no nosso organismo. Dentro deste grupo estão as bactérias, os fungos (bolores e leveduras) e os vírus, seres acelulares que necessitam de outro metabolismo vivo para se multiplicar. Nestes grupos existem inúmeras gêneros e espécies que podem tanto nos ajudar quanto prejudicar nossa saúde. Por isso, é impossível ignorar a importância dos microrganismos na vida humana, porque pela existência deles é possível a produção de determinados alimentos, como vinhos, chocolate e salame, e a produção de medicamentos como a penicilina e vacinas, além de subprodutos para a indústria, como a produção de enzimas e vitaminas usadas nas indústrias alimentícia e farmacêutica. De maneira negativa, os microrganismos podem agir ocasionando doenças e deteriorando os alimentos. A presença dos microrganismos nos alimentos se dá de três diferentes formas, conforme ilustrado na Figura 1. 8 Figura 1 – Fonte de microrganismos nos alimentos Fonte: adaptada de Shutterstock.com. A contaminação natural ou contaminação de origem é um fator inerente à produção de alimentos, uma vez que o alimento, para ser produzido, precisa de água, ar e terra, ambientes que contêm microrganismos que residem naturalmente ali e que não podemos controlar. Por exemplo: frutas, legumes, verdura, leite, carnes in natura. Já a contaminação acidental é aquela que ocorre de forma não intencional, mas que adiciona microrganismos aos alimentos. É a contaminação por meio do manipulador de alimentos por falta de higiene pessoal, ou contaminação ambiental por falta de higiene das superfícies ou utensílios, ou, ainda, por atitudes equivocadas, por exemplo, lavar o frango antes de cozinhar – isso aumenta a microbiota natural do alimento por adicionar água ao frango e a água pode estar contaminada, além de aumentar a atividade de água do próprio alimento, potencializando a multiplicação dos microrganismos. Outra situação comum a contaminação cruzada, como quando se manipula um alimento cozido em uma tábua em que foi manipulado um alimento cru, ou ainda, manipular alimentos em superfícies sujas. 9 O fato é que quando ocorre qualquer um dos tipos de contaminação não podemos controlar os tipos de microrganismos que entram em contato com os alimentos, e algumas espécies são mais perigosas e podem ocasionar doenças graves. Para minimizar esse risco, é preciso adotar as boas práticas de fabricação (BPF), um conjunto de procedimentos para prevenir, eliminar ou reduzir microrganismos a um nível aceitável, e tornando o alimento inócuo, ou seja, sem risco à saúde humana. A inoculação é a forma intencional de adicionar um microrganismo em um alimento com o propósito específico de transformar a composição daquele alimento e modificar características sensoriais como cor, sabor, textura, odor e aparência. Isso é o que ocorre na fabricação de iogurte, em que são adicionadas bactérias láticas ao leite, e ao adicionarmos fermento biológico, que nada mais é do que a levedura Saccharomyces cerevisiae, na fabricação de pães, cervejas e vinhos, entre outros produtos. Os microrganismos são classificados em quatro grupos: deteriorantes, patogênicos, transformadores e produtoresmicrobiológicas servem como controle de qualidade na rotina dos estabelecimentos que produzem ou manipulam alimentos (FRANCO et al., 2015). No entanto, a quantidade de análises microbiológicas é imensa, e não seria possível fazer a análise de todos em um único alimento. Por isso, a depender do objetivo da análise e das características do alimento, há de se eleger os microrganismos ou metabólitos que vão indicar a presença do microrganismo de interesse a ser investigado. Existem critérios microbiológicos que vão ajudar a definir a aceitabilidade de um alimento ou lote, com base no número da microrganismos ou metabólitos, ou ainda a ausência ou presença de determinado microrganismo na amostra (PAIVA; MACHADO, 2019). E quem define os critérios microbiológicos que podem ser obrigatórios ou recomendados? É um órgão que trabalha com isso: a Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos (ICMSF), que atua desde 1962 em parceria com outros órgãos internacionais, como a Organização Mundial da Saúde (OMS), a Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura (FAO) e o Codex Alimentarius, desenvolvendo diretrizes e recomendações para a segurança dos alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 2008). A escolha dos microrganismos a serem analisados leva em consideração os perigos e riscos existentes no caso de descumprimento das boas práticas de fabricação. É feita uma análise de perigo e categorização para verificar o impacto na saúde pública (FRANCO et al., 2015). 54 A responsabilidade da definição dos critérios microbiológicos é de cada país. No caso do Brasil, a Anvisa e o MAPA usam as diretrizes fornecidas pelo ICMSF para definir os critérios que serão adotados para fins de fiscalização e controle de qualidade. Porém, caso um estabelecimento queira adotar padrões mais rígidos que os definidos pela legislação, esses padrões são considerados normas microbiológicas (PAIVA; MACHADO, 2019). As legislações relacionadas aos critérios microbiológicos dos alimentos podem ser encontradas na RDC nº 724, de 1º de julho de 2022, que trata dos padrões microbiológicos dos alimentos e sua aplicação, e na IN nº 161, de 1º de julho de 2022, que estabelece os padrões microbiológicos dos alimentos. Para casos mais específicos, há o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade (RTIQ) do produto alimentício no site da Anvisa ou do MAPA, a depender do órgão que fiscaliza a fabricação do alimento. Segundo Paiva e Machado (2019), os critérios microbiológicos são compostos pelos seguintes itens: • Determinação do microrganismo relevante a ser pesquisado, baseado no risco que oferece à saúde do consumidor. • Método analítico de detecção do microrganismo ou metabólito. • Plano de amostragem, que determina quantas amostras serão analisadas de um mesmo lote, o tamanho da amostra e a indicação de quantas amostras serão toleradas com qualidade intermediária. • Limites microbiológicos, que define os limites que serão considerados apropriados para o alimento. • Estabelecimento de especificações de conformidade, ou seja, padrões e normas que vão definir se o produto será aprovado ou reprovado. 55 Com relação ao plano de amostragem, existem alguns conceitos importantes para conseguirmos interpretar os critérios microbiológicos (BRASIL, 2021, p. 50): Amostra representativa: número de amostras exigidas pelo plano de amostragem, retiradas aleatoriamente de um mesmo lote (BRASIL, 2021, p. 50). Amostra indicativa: constituída por um número de unidades amostrais (n) inferior ao estabelecido no plano de amostragem representativo. Normalmente é aplicável em caso de fiscalização ou surtos de doenças transmitidas por alimentos (BRASIL, 2021, p. 50). Lote: quantidade de alimento produzido em uma mesma batelada sob as mesmas condições, assim, com a mesma composição e características físicas. Plano de amostragem de duas classes: existe um limite estabelecido e há somente duas formas de interpretar o resultado; caso o alimento esteja dentro do limite ele é aceitável, caso esteja fora, é inaceitável (BRASIL, 2021, p. 12). Plano de amostragem de três classes: neste caso existe uma qualidade intermediária aceitável ou inaceitável, em função dos limites m e M, além de um número máximo aceitável de amostras que podem estar entre estes dois limites: • m: limite que em um plano de três classes, separa o lote aceitável do produto ou lote com qualidade intermediária aceitável. • M: limite que em um plano de duas classes separa um produto aceitável de um inaceitável, e para o plano de três classes separa o produto de qualidade intermediária aceitável do inaceitável. Qualquer alimento acima do M é inaceitável. 56 • c: número máximo aceitável de unidades para amostras com qualidade intermediária, aplicável para plano de três classes (BRASIL, 2021, p. 12). Para ilustrar melhor a aplicabilidade destes dois conceitos apresentados, acompanhe o Quadro 1 de critérios microbiológicos conforme a IN n. 161/2022. Quadro 1 – Critérios microbiológicos de frutas e derivados Microrganismo n c m M Salmonella/25g 5 0 Ausência - Escherichia coli/g 5 2 102 103 Fonte: adaptado de Brasil (2022b). Podemos observar que para frutas e derivados indica-se pesquisar dois microrganismos: a Salmonella, cujo número de amostras coletadas seguindo o n deverá ser 5, o plano é de duas classes uma vez que c é igual a zero, e o limite neste caso é ausência, ou seja para o alimento ser aceitável não pode haver presença de Salmonella; e o microrganismo Escherichia coli, cujo número de amostras coletadas segundo n é 5, o plano é de três classes, uma vez que, na tabela, c é igual a dois – isso significa que das cinco amostras, duas podem ter qualidade intermediária, ou seja, podem conter número de microrganismos que estejam entre m 102 e M 103 que ainda assim serão consideradas amostras aceitáveis. O plano de duas classes é mais rigoroso em função dos microrganismos, que normalmente são patogênicos e causam um risco direto à saúde o consumidor. Já o plano de três classes permite uma qualidade intermediária, ou seja, uma tolerância para presença de microrganismos, desde que não afetem a saúde. 57 Considerações finais Avaliar a qualidade de um alimento exige o conhecimento aprofundado das características do alimento a ser analisado, para compreender quais os maiores perigos e riscos envolvidos no processo de fabricação e no produto. Saber compreender e interpretar as legislações é de suma importância para avaliar a qualidade do alimento de forma assertiva. Outro ponto importante é se manter informado, pois as legislações estão sempre sendo atualizadas e não podemos correr o risco de usar critérios revogados. Assim, sempre consulte o site da Anvisa e do MAPA quando for necessário. Referências BRASIL. Perguntas & Respostas: padrões microbiológicos. Gerência-Geral de alimentos. Gerência de avaliação de risco e eficácia de alimentos. 4. ed. Brasília, 2021. Disponível em: https://www.gov.br/anvisa/pt-br/centraisdeconteudo/ publicacoes/alimentos/perguntas-e-respostas-arquivos/padroes-microbiologicos. pdf. Acesso em: 16 abr. 2023. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional da Vigilância sanitária (ANVISA). RDC n. 724, de 1 de julho de 2022. Brasília, 2022a. Disponível em: http://antigo.anvisa. gov.br/documents/10181/6503717/%281%29RDC_724_2022_COMP.pdf/449d2851- 7585-4a64-94c0-e88fd13acbf8. Acesso em: 28 abr. 2023. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional da Vigilância sanitária (ANVISA). Instrução Normativa n. 161, de 1 de julho de 2022. Brasília, 2022b. Disponível em: http://antigo.anvisa.gov.br/documents/10181/6503717/%281%29IN_161_2022_ COMP.pdf/64b8368b-1f56-43c9-ab89-0674ef9a069f. Acesso em: 16 abr. 2023. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Deterioração microbiana de alimentos. In: SÃO JOSÉ, J. F. B.; ABRANCHES, M. V. Microbiologia e Higiene de AlimentosTeoria e prática. Rio de Janeiro: Rubio, 2019. FRANCO, B. D. et al. Microrganismos em Alimentos 8: utilização de dados para avaliação do controle de processo e aceitação de produto/International Commision on Microbiological Specifications for Foods. São Paulo: Blucher, 2015. 58 GERMANO, P. M.; GERMANO, M. I. S. Sistema de gestão: qualidade e segurança dos alimentos. Barueri: Manole, 2013. PAIVA, A. D; MACHADO, A. B. F. Critérios microbiológicos para avaliação de qualidade dos alimentos. In: SÃO JOSÉ, J. F. B.; ABRANCHES, M. V. Microbiologia e higiene de alimentos–Teoria e prática. Rio de Janeiro: Rubio, 2019. 59 Sumário Apresentação da disciplina 05 Objetivos Objetivosde toxinas. A seguir, vamos aprofundar nosso conhecimento a respeito de cada grupo. 1.1 Microrganismos deteriorantes Quem nunca abriu a geladeira e se deparou com um tomate embolorado, ou ainda esqueceu aquela fatia de presunto dentro de um pote e ao abrir estava com aquele aspecto esverdeado e pegajoso, ou ainda, quebrou um ovo e estava podre? Provavelmente você já deve ter passado por alguma dessas situações. E o que elas têm em comum? Todas essas alterações ocorreram em virtude da multiplicação de microrganismos que consumiram os nutrientes dos alimentos e produziram outras substâncias que alteraram as características sensoriais do alimento, tornando-os impróprios para o consumo. 10 A deterioração de origem microbiana pode iniciar mesmo antes dos vegetais serem colhidos; existem doenças que afetam a produção destes produtos. Exemplos são o cancro cítrico, que ocorre em laranjeiras, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, e a doença vassoura de bruxa, que acomete os cacaueiros, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa. De maneira geral, cada alimento, em virtude da sua composição nutricional e fatores como pH, atividade de água e estrutura biológica, entre outros, propiciarão o desenvolvimento de determinado tipo de microrganismo, uma vez que cada espécie tem uma exigência diferente para cada um destes fatores. Os microrganismos são capazes de metabolizar carboidratos, proteínas e lipídeos, promovendo a sua hidrólise pela ação enzimática. Essas enzimas são produzidas pelos próprios microrganismos, além de produzirem outros metabólitos que alteram a cor, o sabor, a textura e a aparência do alimento. Para exemplificar melhor, vejamos alguns exemplos (Quadro 1): Quadro 1 – Deterioração microbiana nos alimentos Alimento Microrganismo Alteração Alimentos enlatados Clostridium butyricum e Clostridium pasteu- rianum Deterioram alimentos ácidos enlatados produ- zindo gás CO2 e H2. Queijos Propionibacterium Produz pigmentos cau- sando a mudança de co- loração em queijos. Alimentos ricos em pro- teína Desulfotomaculum nigri- ficans Produção do gás sulfeto de hidrogênio (H2S) a partir de aminoácidos como metionina e cis- teína. Promove o cheiro característico de ovo e aparecimento da cor es- verdeada. 11 Alimentos ricos em lipí- deos Pseudomonas fragi Candida lipolytica Promove a rancidez hi- drolítica. Alimentos salgados e desidratados (ex.: baca- lhau) Sporendonema expizoun Aparecimento de pe- quenos tufos, ou pontos pretos ou castanhos na superfície. Carnes e derivados mantidos sob refrigera- ção Pseudomonas alcalige- nes Produção de limosidade superficial. Vegetais Erwinia carotovora Pseudomonas ssp P. marginalis Clostridium Bacillus Hidrolisam a pectina, promovendo amoleci- mento do vegetal e pro- duzindo odor desagradá- vel e aparência úmida. Fonte: adaptado de Franco e Landgraf (2008). 1.2 Microrganismos patogênicos Microrganismos patogênicos são aqueles que de alguma forma acometerão a saúde humana, podendo ocasionar doenças do tipo doença transmitida por alimento (DTA) ou doença de transmissão hídrica e alimentar (DTHA), que é a forma que o Ministério da Saúde define este tipo de doença. Doenças de Transmissão Hídrica e Alimentar é uma síndrome geralmente constituída de anorexia, náuseas, vômitos e/ou diarreia, acompanhada ou não de febre, relacionada à ingestão de alimentos ou água contaminados. Os sintomas digestivos não são as únicas manifestações, podendo ocorrer afecções extra intestinais em diferentes órgãos, como rins, fígado, sistema nervoso central, dentre outro. (BRASIL, 2022, [s. p.]) Existem mais de 250 tipos de DTHA, e no Brasil a Vigilância Epidemiológica faz o controle destas doenças por meio das notificações por categoria. As doenças: botulismo, brucelose humana, cólera, doença 12 de chagas por transmissão oral, doenças diarreicas agudas, febre tifoide, rotavirose, síndrome hemolítico-urêmica, surtos de doenças de transmissão hídrica e alimentar, toxoplasmose adquirida na gestação e congênita. Você já se perguntou alguma vez se aquela carne que passou a noite fora da geladeira e que no dia seguinte não tem alteração de cor, sabor e textura é segura para o consumo? Muitas vezes as pessoas decidem por consumir um alimento baseado somente nas suas características sensoriais, mas isso é um erro, porque microrganismos patogênicos nem sempre vão promover alterações sensoriais e o alimento pode estar contaminado, causando doenças do tipo infecção alimentar ou intoxicação alimentar. Entenda a diferença a seguir (Figura 2). Figura 2 – Diferença entre Infecção alimentar e Intoxicação alimentar Fonte: adaptada de Forsythe (2013). Para investigar o microrganismo patogênico que causou uma DTHA, é preciso considerar alguns fatores como o período de incubação e de duração da doença, a dose infectante, os sintomas da doença e o tipo de alimento consumido, porque os fatores variam de modo considerável de microrganismo para microrganismo. Vejamos alguns exemplos a seguir (Quadro 2). 13 Quadro 2 – Características de microrganismos patogênicos Microrganismo Dose infectante Alimentos Incubação/sintomas Salmonella spp 106->107 Carne bovina e de aves e seus derivados, pro- dutos de ovo, vegetais crus mal higienizados. 6 a 72 horas/dores abdomi- nais, diarreia, calafrios, febre, náuseas, vômitos, mal-estar. Campylobacter je- juni 103 Leite cru, fígado de boi, mariscos crus, água. 2 a 7 dias/dores abdominais, diarreia (frequentemente com muco e sangue), cefaleia, mialgia, febre, anorexia, náu- seas e vômitos. E. coli patogênica (cepas enterotoxi- gênicas ou invaso- ras) 106->107 Alimentos diversos e água. 5 a 48 horas/dores abdomi- nais, diarreia, vômito, náu- seas, cefaleia, mialgia. Bacillus cereus (enterotoxina) 104-108 Produtos de cereais, arroz, cremes e molhos, vegetais cozidos, pratos desidratados reconstituí- dos. 8 a 16 horas/náuseas, dores abdominais, diarreia. Staphylococcus aureus (toxina esta- filocócica) 105->106/g Presunto, produtos de origem bovina ou aves, alimentos mistos, pre- paração com recheio, cremes. 1 a 8 horas/náuseas, vômitos, dores abdominais, diarreia, prostração. Clostridium botu- linum (neurotoxina A, B, E e F) 103 Conservas caseiras e pouco ácidas, peixes embalados a vácuo, ovos de peixe fermentados, peixes e mamíferos marinhos não eviscerados. Os esporos encontram-se no solo e no intestino de animais. Duas horas a oito dias/sin- tomas neurológicos como visão turva, dilatação das pupilas, fraqueza muscular, dificuldade em falar, deglutir e respirar, vertigem. Sintomas gastrointestinais: náuseas, vômitos, dores abdominais. Os sintomas podem evoluir para óbito. Hepatite Abalanço hidroeletrolítico. • Enterotoxina citotônica e citotóxica: promovem alterações a nível intracelular. • Endotoxinas: são estruturas lipopolissacarídicas (LPS) termoestáveis, que fazem parte da membrana externa das bactérias Gram-negativas, como a Salmonella spp, que causa choques tóxicos, inflamações e febre. Provocam atividades citotóxicas nas células • Toxina distensora citoletal: afeta o ciclo regulatório da célula do hospedeiro, inibindo a mitose. 15 Exemplos de algumas bactérias que produzem toxinas: Shigella, E. coli O157:H7, Vibrio cholerae, Cl. Perfringens, B. cereus, St. aureus e o Strep. Pyogenes. Também C. jejuni, E. coli, Sh. dysenteriae, Haemophilus ducreyi e Actinobacillus actinomycetemcomitans. Quando as toxinas são produzidas por bolores são denominadas micotoxinas. As micotoxinas podem estar presentes nos alimentos de forma direta ou indireta: direta quando foi produzida no alimento, por exemplo, o fungo produziu a toxina em um milho; e indireta quando esse milho se torna ração do gado e aves e consumimos os seus derivados, como as carnes, o leite e os ovos. Os principais alimentos que contêm toxina são: cereais que podem conter aflatoxinas, tricotecenos, ocratoxina A, esterigmatocistina, rubratoxina A e B; no arroz, citreoviridina e fumonisina; no milho, aflatoxina, zearalenona e fumonisinas; no amendoim, amêndoas, castanhas, coco, sementes de algodão e leite, aflatoxinas. Algumas micotoxinas são de preocupação de saúde pública, como as aflatoxinas B11, B22, G11, G22 produzidas pelo Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, por provocar lesões cancerosas no fígado. A ocratoxina A, produzida pela A. ochraceus e pelo P. verrucosum, comprometem os rins; a zearalenona lesiona o trato urogenital, e os tricotecenos afetam as mucosas. 1.4 Microrganismos transformadores A transformação dos alimentos pelos microrganismos com o processo de fermentação está entre os métodos mais antigos de processamento de alimentos, e é praticado há milênios. Produtos de panificação, queijos, iogurtes, derivados de soja, conservas e embutidos são exemplos de alimentos que consumimos, e que passam por fermentação. 16 A fermentação traz inúmeras vantagens ao transformar um alimento: • Altera aroma e textura, que não podem ser obtidos por outros métodos. • Melhora as propriedades nutricionais e sensoriais, por utilizar temperaturas pH mais brandas. • Tem custo de investimento e operação relativamente baixos. • Apresenta tecnologia relativamente simples. • Ajuda no processo de conservação, por meio da produção de ácidos e outros metabólitos. É também pelo processo de fermentação que são produzidas enzimas que posteriormente serão purificadas e usadas na produção de outros alimentos, por exemplo, a quimosina produzida pelo Aspergillus niger, variedade awamori ou Rhizomucor miehei sem. Temos diferentes tipos de fermentação: lática, fermentação alcoólica e fermentação acética. A seguir, vamos ver alguns exemplos: Fermentação lática: feita por bactérias láticas do gênero Lactobacillus ssp, Streptococcus spp, Pediococcus e Leuconostoc spp. Com elas podemos produzir leites fermentados, queijos, iogurtes, conservas, salames, peixes fermentados, polvilho azedo. Fermentação alcóolica: feita pelos gêneros Saccharomyces cerevisiae, S. carbajali, espécies Mucor, espécies Rhizopus, a partir da qual são produzidos pães, molho de soja, vinhos, cervejas e outras bebidas alcoólicas. Fermentação acética: feita pelo gênero Acetobacter, por meio da qual são produzidos vinagres de diversas variedades. 17 Considerações finais Em geral, a presença de microrganismos deteriorantes, patogênicos e produtores de toxinas pode causar problemas significativos de saúde e econômicos. Já os microrganismos transformadores, que fermentam os alimentos, são benéficos, mas também podem se tornar deteriorantes se contaminarem um alimento, por exemplo, sucos de frutas e vinhos podem se tornar vinagre se forem contaminados por bactérias acéticas. Por isso, é importante que conhecer bem as características dos microrganismos presentes nos alimentos para poder adotar medidas preventivas e minimizar a exposição aos microrganismos indesejáveis, garantindo a segurança dos alimentos, água e outros produtos consumidos. Referências BRASIL. Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de Imunização e Doenças Transmissíveis, Coordenação-Geral de Vigilância de Zoonoses e Doenças de Transmissão Vetorial. Surtos de Doenças de Transmissão Hídrica e Alimentar no Brasil Informe 2022. Brasília, 2022. Disponível em: https:// www.gov.br/saude/pt-br/assuntos/saude-de-a-a-z/d/dtha/publicacoes/surtos-de- doencas-de-transmissao-hidrica-e-alimentar-no-brasil-informe-2022/view. Acesso em: 5 mar. 2023. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. FELLOWS, P. J. Tecnologia do Processamento de Alimentos: Princípios e Prática. Porto Alegre: Artmed, 2018. FORSYTHE, S. J. Microbiologia da Segurança dos alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2013. GERMANO, P. M.; GERMANO, M. I. S. Sistema de Gestão: qualidade e segurança dos alimentos. Barueri, SP: Manole, 2013. https://www.gov.br/saude/pt-br/assuntos/saude-de-a-a-z/d/dtha/publicacoes/surtos-de-doencas-de-transmissao-hidrica-e-alimentar-no-brasil-informe-2022/view https://www.gov.br/saude/pt-br/assuntos/saude-de-a-a-z/d/dtha/publicacoes/surtos-de-doencas-de-transmissao-hidrica-e-alimentar-no-brasil-informe-2022/view https://www.gov.br/saude/pt-br/assuntos/saude-de-a-a-z/d/dtha/publicacoes/surtos-de-doencas-de-transmissao-hidrica-e-alimentar-no-brasil-informe-2022/view 18 Fatores que interferem no desenvolvimento microbiano em alimentos Autoria: Maria de Sousa Carvalho Rossi Leitura crítica: Marília Liotino dos Santos Objetivos • Compreender como ocorre a curva de crescimento microbiano. • Conhecer os fatores intrínsecos e extrínsecos que interferem no crescimento microbiano. • Identificar os princípios utilizados para controlar o crescimento microbiano nos alimentos. 19 1. Curva de crescimento dos microrganismos Caro estudante, você sabia que os microrganismos são os principais causadores da deterioração dos alimentos? Os alimentos podem estragar basicamente por cinco motivos: deterioração não enzimática; deterioração enzimática – alguns microrganismos produzem enzimas, por exemplo, as lipases, que promovem a rancidez hidrolítica –; danos físicos ou mecânicos – como no caso de frutas batidas, com a exposição do interior da fruta ao ar, quando ocorre a contaminação microbiana –; deterioração por ação de roedores e insetos – que também podem danificar o alimento ou depositar microrganismos na superfície do alimento –; e, por fim, os próprios microrganismos que estão presentes naturalmente nos alimentos ou que contaminam os alimentos durante a manipulação. Então, perceba que das cinco causas possíveis, os microrganismos estão envolvidos em quatro delas direta ou indiretamente (FRANCO; LANDGRAF, 2008; FELLOWS, 2018). Portanto, conhecer a fundo a cinética de crescimento dos microrganismos e identificar todos os fatores que interferem no seu crescimento nos permite entender a melhor forma de controlar o crescimento microbiano e prolongar a vida de prateleira (shelf-life) dos alimentos. A maioria das bactérias se multiplicam por fissão binária, isto é, uma célula se divide em duas, duas células se transformam em quatro e, assim, o crescimento bacteriano se dá em escala logarítmica (BLACK; BLACK, 2021). Entretanto, como qualquer outro ser vivo, as bactérias nascem, crescem e morrem. Seu o ciclo de vida é representado por fases como ilustra a Figura 1. 20 Figura 1 – Curva de crescimento bacteriano Fonte: Shutterstok.com. A seguir, vamos compreender melhor o que ocorre em cada fase: Fase 1 – Fase Lag: nesta fase as células estão aumentando de tamanho e produzindo grandes quantidades de energia na forma de ATP e de enzimas apropriadaspara o crescimento no novo ambiente. Esta fase pode variar muito de microrganismo para microrganismo, a depender da fisiologia da célula, das características do ambiente e do tempo de vida da cultura, pois quanto mais velha maior a fase Lag – isso porque estas culturas estão adaptadas a quantidades limitadas de nutrientes e a um grande acúmulo de resíduos, assim, acabam levando mais tempo para se ajustarem ao novo meio, do que aqueles transferidos de um meio relativamente fresco e rico em nutrientes (BLACK; BLACK, 2021). Fase 2 – Fase de crescimento exponencial ou fase Log: nesta fase os microrganismos encontram-se em plena capacidade de reprodução, e a multiplicação se dá em escala logarítmica de base 10 (cada unidade sucessiva representa um aumento de 10 vezes no número de 21 organismos). Como resultado, tem-se uma linha reta cuja inclinação representa a taxa de crescimento máximo. Cada microrganismo tem uma velocidade específica de crescimento, e o tempo para duplicar uma célula é conhecido como tempo de geração, o qual pode variar de minutos até dias, a depender da bactéria (BLACK; BLACK, 2021). Acompanhe o exemplo abaixo. Quadro 1 – Multiplicação de bactéria com tempo de geração de 20 minutos Tempo Nº de células / ml Inicial 1.000 20 minutos 2.000 40 minutos 4.000 60 minutos 8.000 120 minutos 64.000 180 minutos 512.000 Fonte: adaptada de Black e Black (2021). A fase Log tem um tempo limitado, porque à medida que os nutrientes vão sendo consumidos e o número de células aumentam, ocorrem também o acúmulo de resíduos metabólicos. O espaço pode tornar-se limitado, e os organismos aeróbicos sofrem com a depleção de oxigênio. Fase 3 – Fase estacionária: esta fase é caracterizada por um crescimento linear; a velocidade de divisão celular diminui e o número de células vivas se iguala ao de células mortas. O meio fica desfavorável para a multiplicação em virtude da modificação de pH, do aumento de metabólitos tóxicos para os microrganismos, da redução de disponibilidade de oxigênio (para bactérias aeróbias) e de nutrientes (FORSYTHE, 2013). Fase 4 – Fase declínio ou fase de morte: em função do ambiente cada vez menos favorável para a divisão celular, muitas células perdem a sua capacidade de sofrer divisão, e acabam morrendo. Durante a fase de declínio, muitas células sofrem involução, assumindo uma variedade 22 de formas incomuns, dificultando a sua identificação. O número de células vivas diminui em velocidade logarítmica, conforme indicado pela linha reta diagonal em declive, ilustrada na Figura 1. Microrganismos capazes de esporular aumentam a produção de esporos nesta fase. Esta fase pode durar dias ou meses, a depender da cultura e do ambiente (FORSYTHE, 2013; BLACK; BLACK, 2021. 2. Fatores que interferem no crescimento microbiano Cada microrganismo tem uma exigência diferente de água, nutriente, pH e temperatura, entre outros fatores, para estimular seu crescimento e multiplicação. Conhecer estas informações é de extrema importância para saber tanto a melhor forma para estimular o crescimento – como no caso de uma fermentação –, quanto para inibir ou mesmo eliminar os microrganismos, no caso de deteriorantes e patogênicos. 2.1 Fatores extrínsecos São fatores externos relacionados às condições ambientais. Dentre eles estão a temperatura, a composição gasosa a qual o alimento está exposto e a umidade relativa do ar. 2.1.1 Temperatura A temperatura é um dos fatores mais controlados na manipulação e produção de alimentos, pois cada microrganismo tem uma temperatura ótima para se multiplicar. Não é à toa que inúmeras legislações que tratam de boas práticas de manipulação determinam temperaturas de segurança, que normalmente são consideradas fora da zona de perigo entre 5 e 60 °C (FORSYTHE, 2013). 23 A RDC nº 216 de 2004, que trata das boas práticas em manipulação de alimentos em serviço de alimentação, determina o controle de temperatura em várias etapas do processamento de alimentos, por exemplo: o descongelamento deve ser feito em temperatura inferior a 5 °C, e no tratamento térmico o alimento deve atingir no mínimo 70 °C no seu centro geométrico (BRASIL, 2004). O binômio tempo e temperatura é um parâmetro descrito nesta legislação no caso do resfriamento, e a temperatura do alimento deve chegar em 60 °C após a cocção em até duas horas. Em seguida, o alimento deve chegar em 10 °C nas duas horas seguintes, para ser mantido sob refrigeração a temperaturas inferiores a 5 °C ou em congelamento com temperaturas inferiores a -18 °C. O tempo também é um fator determinante e importante de ser controlado, uma vez que a multiplicação dos microrganismos, como já vimos, se dá em escala logarítmica, portanto, cada minuto impacta o crescimento da população microbiana (BRASIL, 2004; GERMANO; GERMANO, 2013). O Quadro 2 apresenta a classificação dos microrganismos em relação à temperatura ótima de crescimento. Quadro 2 – Classificação dos microrganismos de acordo com a temperatura de crescimento Classificação Faixa de tempera- tura de multiplica- ção °C Temperatura óti- ma °C Exemplos Termófilas 35–90 45–65 Bacillus ssp., Clostridium spp., Desul- fotomaculum spp. e Lactobacillus spp. Mesófilas 5–50 25–40 Maioria bactérias patogênicas e dete- riorantes. Escherichia spp., Campylobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Sta- phylococcus spp., Proteus spp., Pseu- domonas spp., Brevibacterium spp., Chromobacterium spp. e Acetobacter spp 24 Psicrófilas 0 a 20 10–15 Pseudomonas spp., Flavobacterium spp., Alcaligenes, Micrococcus spp., Lactobacillus spp., Aerobacter spp.3 Psicotrófilas 0 a 7 – Pseudomonas spp., Proteus spp., Ser- ratia spp., Streptomyces spp., Strepto- coccus spp., Vibrio spp. e Listeria sp. Fonte: adaptada de Salvatierra (2014). 2.1.2 Umidade relativa do ar (UR) A umidade relativa do ar está relacionada à quantidade de água dispersa no ar. Quando um alimento tem baixa umidade e está exposto a um ambiente em que a UR é alta, este alimento tende a absorver a água do ambiente aumentando o teor de água livre, ficando, portanto, mais suscetível à deterioração (FRANCO; LANDGRAF, 2008). O controle de UR deve ser feito principalmente em ambientes de armazenamento refrigerado e de congelamento, porque quando o alimento tem baixa umidade ele tende a absorver a umidade do ambiente, acelerando o processo de deterioração, e quando a UR é baixa o alimento tende a desidratar, principalmente quando é um alimento com alto teor de água. Normalmente, é possível modular a umidade relativa do ar em função da temperatura; por exemplo, a UR é menor quando a temperatura é mais baixa, e o contrário também é verdadeiro. Modificando a atmosfera gasosa, é possível reduzir a velocidade de deterioração do alimento sem baixar a UR. Outra forma de controlar a absorção da água do ambiente pelo alimento é o uso de embalagens que sejam barreira à passagem do vapor d’água (SALVATIERRA, 2014). 2.1.3 Composição de gases no ambiente A presença de determinados gases pode favorecer ou inibir o crescimento microbiano; por exemplo, microrganismos aeróbios 25 necessitam do oxigênio para se multiplicar, já os anaeróbios crescem na ausência dele. O gás carbônico é um gás com ação bactericida, assim como o ozônio, entretanto, a utilização do ozônio não é indicada para alimentos ricos em lipídeos, por acelerar o processo de rancificação. A indústria de alimentos criou, portanto, um blend (mistura) de gases, que é conhecido como atmosfera modificada, para ajudar na conservação de alimentos. Essa mistura é usada em alimentos in natura minimamente processados ou lanches naturais, os quais passaram por manipulação e processamento, e são mais suscetíveis ao processo de deterioração. O nitrogênio normalmente é usado na atmosfera modificada por ser um gás inerte e por preencher o espaço que falta para ajustar a dosagem ideal de gases de acordo com o tipo de alimento (FELLOWS, 2018). 2.2 Fatores intrínsecos2.2.1 Atividade de água (aw) Atividade de água (aw) é a medida da água disponível em um alimento. Os valores de aw variam entre 0 e 1,0. Este valor é obtido a partir da razão entre a pressão do vapor d’água da amostra e a da água pura, à mesma temperatura. A aw 1,0 só é possível na água no seu estado puro, assim, qualquer alimento ou bebida vai ter uma aw de água menor que 1,0 por conter outras substâncias (solutos) que vão interferir na pressão de vapor da água (FRANCO; LANDGRAD, 2008). É importante diferenciar atividade de água de umidade nos alimentos. Apesar de os dois fatores estarem relacionados à água, a umidade está relacionada ao teor de água nos alimentos, enquanto a aw está relacionada à água disponível no alimento. Na prática, dois alimentos podem ter o mesmo teor de água, mas se um deles tiver acrescido de açúcar, terá aw de água menor, pois o açúcar é higroscópico, ligando- 26 se fortemente à água e reduzindo a disponibilidade deste elemento no alimento (FELLOWS, 2018). No Quadro 3, podemos verificar a faixa de aw ótima para multiplicação de alguns microrganismos. Quadro 3 – Valores de atividade de água para grupos microrganismos Grupo de microrganismos aw mínimo Bactérias deteriorantes 0,9 Bactérias patogênicas* 0,9 Leveduras deteriorantes 0,88 Bolores deteriorantes 0,80 Bactérias halofílicas (afinidade por altas concentrações de sal) 0,75 Bolores xerofílicos (afinidade por altas concentrações de açúcar ou sal) 0,65 Leveduras osmofílicas (afinidade por altas concentrações de açúcar 0,61 *Existem exceções como o Staphylococcus aureus que tolera aw de 0,86. Fonte: adaptada de Franco e Landgrad (2008). Quanto mais fresco o alimento maior sua aw: frutas e vegetais frescos,gram-negativas são menos exigentes que as gram-positivas com relação às necessidades de vitaminas. Bolores e bactérias gram-positivas conseguem sintetizar todos os seus fatores de crescimento (FRANCO; LANDGRAF, 2018). Dentre os minerais mais importantes para o metabolismo microbiano estão sódio, potássio, cálcio e magnésio, ferro, cobre, manganês, molibdênio, zinco, cobalto, fósforo e enxofre (BLACK; BLACK, 2021). 3. Métodos de conservação dos alimentos Segundo Fellows (2008), os métodos de conservação de alimentos usam métodos físicos (calor, frio, irradiação, vibração ultrassônica, filtração, microfiltração e ultrafiltração) e químicos (conservantes sintéticos, substâncias antimicrobianas naturais, desinfetantes, composição gasosa, modificação de pH) para prevenir, retardar ou mesmo eliminar os microrganismos dos alimentos. Vamos compreender como agem alguns destes métodos observando o Quadro 1: Quadro 4 – Efeito dos métodos de conservação dos alimentos Método Efeito esperado Refrigeração Retarda o crescimento de microrganismos. Congelamento Previne, retarda e elimina microrganismos Branqueamento Elimina microrganismos superficialmente. 31 Pasteurização Elimina microrganismos patogênicos e parcialmente a micro- biota vegetativa. Esterilização comercial Elimina microrganismos patogênicos e a microbiota vegetati- va, entretanto, podem sobrar esporos. Irradiação Elimina microrganismos por danificar o DNA. Hipoclorito de sódio Elimina bactérias pela oxidação da parede celular. Ultrafiltração Retém, em membranas, as células de microrganismos. Atmosfera modificada Utiliza gases com ação bactericida, como CO2 e O3. Secagem e desidratação Limita o crescimento de microrganismos pela redução da aw. Fonte: adaptado de Forsythe (2013). Considerações finais Os métodos de conservação dos alimentos podem combinar um ou mais métodos para poder aumentar o shelf-life dos alimentos por mais tempo. Referências BLACK, J. G.; BLACK, L. J. Microbiologia: fundamentos e perspectivas. 10. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2021. BRASIL. Ministério da Saúde. Resolução RDC n. 216, de 15 de setembro de 2004. Regulamento Técnico de Boas Práticas para Serviços de Alimentação. Diário Oficial da República Federativa do Brasil. Brasília,. 2004. Disponível em: https://bvsms. saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2004/res0216_15_09_2004.html. Acesso em: 1 abr. 2023. CANSIAN, R. L. et al. Atividade antioxidante e antimicrobiana de extratos de canela- sassafrás (Ocotea odorifera (Vell.) Rowher). Perspectiva, [s. l.], v. 34, n. 127, p. 123- 133, 2010. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. FELLOWS, P. J. Tecnologia do processamento de alimentos: princípios e prática. Porto Alegre: Artmed, 2018. FORSYTHE, S. J. Microbiologia da segurança dos alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2013. GERMANO, P. M.; GERMANO, M. I. S. Sistema de gestão: qualidade e segurança dos alimentos. Barueri, SP: Manole, 2013. SALVATIERRA, C. M. Microbiologia – Aspectos morfológicos, bioquímicos e metodológicos. São Paulo: Érica, 2014. 32 Métodos de análises microbiológicas Autoria: Maria de Sousa Carvalho Rossi Leitura crítica: Marília Liotino dos Santos Objetivos • Compreender a aplicabilidade dos métodos de análises microbiológicos em alimentos. • Identificar quais métodos de análise microbiológicas são mais praticados. • Conhecer os métodos de análise microbiológicas em ambientes e na água. 33 1. Métodos de análises microbiológicas Caro estudante, você sabia que as análises microbiológicas servem não só para identificar os tipos de microrganismo, mas também são imprescindíveis para fazer o controle de qualidade da produção de alimentos? Vamos, a seguir, conhecer os diferentes tipos de análises microbiológicas e entender em quais situações usar este tipo de recurso. As análises microbiológicas são um conjunto de técnicas laboratoriais que visam identificar e quantificar microrganismos presentes em uma determinada amostra. Esses microrganismos podem incluir bactérias, fungos, vírus e outros organismos unicelulares (FRANCO; LANDGRAF, 2008). As análises microbiológicas em alimentos podem ser do tipo qualitativa quando detecta a presença de determinado microrganismo, indicando o gênero ou mesmo a espécie; ou pode ser quantitativa, quando indica a quantidade estimada de microrganismos presentes na amostra (FILHO; MATA; DORES, 2019). Segundo Forsythe (2013), antigamente as análises eram usadas para avaliar a qualidade e a segurança do produto final, mas, atualmente, estes recursos são usados de forma mais proativa em toda a cadeia do processo produtivo, fazendo parte do monitoramento da qualidade dos alimentos. Além disso, de acordo com Filho, Mata e Dores (2019) as análises têm diferentes finalidades dentro do processo de fabricação ou manipulação de alimentos, e são utilizadas para: • Identificar e isolar cepas de interesse para produção de alimentos. • Avaliar a qualidade higiênico-sanitária de alimentos, equipamentos, superfícies, e a da higiene pessoal dos manipuladores de alimentos. 34 • Avaliar se os alimentos atendem aos critérios microbiológicos exigidos pela Anvisa e pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). • Estimar o shelf-life de um produto alimentício. • Identificar microrganismos causadores de doenças transmitidas por alimentos. • Avaliar a potabilidade da água. • Validar programas de sistemas de gestão de qualidade em alimentos como o APPCC (análises de perigos e pontos críticos de controle) e programas de certificação de qualidade como ISO 22000:2018 ou o FSSC 22000. Para fazer as análises microbiológicas são usados os meios de cultura, ambientes criados de forma intencional para fornecer aos microrganismos nutrientes necessários para seu desenvolvimento de acordo com a sua necessidade (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Vejamos as classificações dos meios de cultura descritos na Figura 1. 35 Figura 1 – Classificação dos meios de cultura para microrganismos Fonte: adaptada de Salvatierra (2014). 36 1.1 Métodos convencionais e métodos rápidos Os métodos convencionais, também conhecidos como tradicionais, são métodos que possibilitam detectar os microrganismos por meio da cultivação destes em meios de cultura, permitindo o isolamento das cepas e possibilitando fazer a avaliação morfológica. Entretanto, são métodos demorados, e dependendo dos objetivos da análise, o uso pode tornar-se inviável como forma de monitoramento da rotina de uma indústria alimentícia, por exemplo. Já os métodos rápidos, criados na década de 1970, possibilitam resultados mais rápidos e não necessitam do cultivo dos microrganismos, pois podem usar princípios de bioquímica, biofísica, imunologia e sorologia. Algumas técnicas utilizam detecção por DNA ou mesmo ensaios enzimáticos para a detecção. No Quadro 1, conhecemos mais detalhes a respeito das diferenças dos dois métodos. Quadro 1 – Características dos métodos de análise em alimentos Métodos convencionais Métodos rápidos Vantagens São confiáveis e oficialmen- te aprovados. Requerem quantidades pequenas de amostras e materiais para a aná- lise. Alta produtividade e resultados mais rápidos. Desvanta- gens Requerem longo período para obtenção dos resulta- dos. Análises devem ser feitas em duplicata. Requerem uso de muitas vidrarias, e é trabalhoso. Maior risco de falha no pro- cesso e contaminação cru- zada. Alguns métodos são mais sensíveis e específicos que os métodos con- vencionais. Dependendo do teste pode exigir a confirmação com o teste convencio- nal. 37 Técnicas mais comuns NMP: número mais provável ou técnica dos tubos múlti- plos. Contagem padrão de pla- ca: pode ser feito pelo pla- queamento em superfície (Spread plate) ou plaquea- mento em profundidade (Pour plate). PCR: técnica que permite a amplifi- cação rápida e precisa de sequên- cias específicas de DNA de micror- ganismos (primers). ELISA: ensaio imunoenzimáticoque interage com anticorpos mono e po- liclonais, fixados em uma superfície, e o antígeno-alvo (microrganismo alvo). Exemplos NMP: para detecção de co- liformes totais, coliformes fecais, Staphylococcus au- reus. Contagem padrão de pla- cas: detecção de bactérias aeróbia mesófilas, termófi- cas e psicotróficas, bolores e leveduras. Quando usa- dos meios seletivos permite o isolamento de cepas es- pecíficas. Petrifilm®: meio de cultura desidra- tado carreado em um fino filme plás- tico. Detecção de E. coli, contagem de aeróbios, bolores, leveduras e Staphylococcus aureus. TECRA/Biotrace®: método ELISA para detecção de Campylobacter ssp. BAX®: método PCR – para detec- ção de E. coli. Fonte: adaptado de Franco e Landgraf (2008); Filho, Mata e Dores (2019); Forsythe (2013). Caso seja utilizado algum método rápido, deve passar por um trabalhoso processo de validação para garantir que o resultado fornecido por ele seja eficiente e eficaz. Deve haver evidências com comparação estatística com o método convencional, mostrando que seu resultado é confiável. 2. Métodos de análises em alimentos Existem inúmeras técnicas para detecção e monitoramento da presença de microrganismos nos alimentos. A Anvisa (BRASIL, 2021) orienta que os laboratórios usem métodos validados e que constem nos compêndios ou referencias oficiais, como: 38 International Organization for Standardization (ISO), Official Methods of Analysis of AOAC International, Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (APHA), Standard Methods for the Examination of Dairy Products (APHA), Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (APHA), Bacteriological Analytical Manual (BAM/ FDA), Farmacopeia Brasileira ou Farmacopeia Americana, de acordo com sua aplicação. (BRASIL, 2021, [s. p.]) Para realizar análises microbiológicas em alimentos, normalmente são escolhidos microrganismos indicadores de qualidade higiênico-sanitária, pois os alimentos não podem conter microrganismos patogênicos ou metabólitos e toxinas. No entanto, seria inviável fazer a análise de todos os microrganismos possíveis em um alimento, e por isso são escolhidos microrganismos que tenham relevância para assegurar a inocuidade do alimento. Para saber qual microrganismo analisar, devemos consultar a IN nº 126 de 2022 (BRASIL, 2022b) que estabelece os padrões microbiológicos dos alimentos. No Quadro 2 são apresentados alguns exemplos dos principais microrganismos a serem pesquisados de acordo com a categoria de alimentos: Quadro 2 – Análises microbiológicas e físico-químicas em alimentos recomendadas pela Anvisa Categoria de alimento Microrganismo/ toxina/ metabólito Frutas e derivados. Hor- taliças, raízes, tubérculos, fungos comestíveis e deri- vados. Nozes, amêndoas e se- mentes comestíveis. Outros produtos vegetais. Salmonella/25 g. Escherichia coli/g. Bolores e leveduras/g. Enterobacteriaceae/g. 39 Carne de aves. Salmonella Enteritidis/25 g. Salmonella Typhimurium/25 g. Escherichia coli/g. Aeróbios mesófilos/g. Clostridium perfringens/g. Estafilococos coagulase positiva/g. Bolores e leveduras/g. Carne bovina, suína e ou- tras. Salmonella/25 g. Escherichia coli/g. Aeróbios mesófilos/g. Estafilococos coagulase positiva/g. Pescados. Histamina (mg/Kg), somente para peixes com elevado teor de histidina. Salmonella/25 g. Escherichia coli/g. Estafilococos coagulase positiva/g. Ovos. Salmonella/25 g. Bolores e leveduras/g. Enterobacteriaceae/g. Leite e derivados. Enterobacteriaceae/ml. Enterotoxinas estafilocócicas (ng/g). Salmonella/25 g. Estafilococos coagulase positiva/g. Escherichia coli/g. Bolores e leveduras/g. Aeróbios mesófilos. Fonte: adaptado de Brasil (2022a). 40 3. Métodos de análises no ambiente A contaminação cruzada e condições inadequadas de higiene nas instalações e na superfície de contato contaminadas, durante o processamento, são potenciais causas de surtos por doenças transmitidas por alimentos. E o monitoramento microbiológico das áreas de preparo, assim como dos equipamentos utilizados, permitem avaliar a eficiência do processo de limpeza e desinfecção e a periodicidade ideal de limpeza e desinfecção, assim como descobrir possíveis fontes de contaminação e a presença de microrganismo patogênicos (SÃO JOSÉ, 2019). Segundo a APHA (American Public Health Association), o teste do swab é amplamente usado para coleta de amostra em superfícies. O swab é uma haste de plástico que tem entre 12 e 15 cm de comprimento e em uma das suas extremidades é recoberta de algodão, muito parecido com um cotonete – a diferença é que o swab é comercializado em embalagens individuais, e é estéril. É recomendado fazer a coleta em uma área igual à 25 cm2. O swab é muito versátil poque pode ser usado tanto em superfícies lisas quanto irregulares ou com algum tipo de rugosidade. Após a coleta, é feita a inoculação da amostra no meio de cultura de interesse, por exemplo, contagem de bactérias, bolores e leveduras. Para ser considerado uma superfície limpa, a APHA recomenda que os níveis de bactérias aeróbias mesófilas não ultrapassem 2 UFC/cm2 (unidade formadora de colônia) para bancadas e 100 UFC para utensílios (MOBERG; KORNACKI, 2015). Uma recomendação considerada rigorosa principalmente para os ambientes brasileiros, em que as condições de temperatura ambiental são diferentes das americanas (SÃO JOSÉ, 2019). No Brasil não existem recomendações específicas para grupo de microrganismos, o que torna mais difícil a avaliação dos resultados obtidos (SÃO JOSÉ, 2019). 41 Outros métodos que podem ser aplicados para coleta de amostras em superfícies, segundo São José (2019), são: • Método de fricção com espojas ou tecidos estéreis: indicado para superfícies rugosas ou lisas. Superfície para coleta recomendada de 100 cm2. É um método prático. • Método de placas de contato: é um método recomendado pelo ISSO 18593:2004 para quantificar e analisar a viabilidade de bactérias na superfície sólida, indicado somente para superfícies lisas com área maior que 100 cm2, em que são usadas esponjas ou tecidos estéreis que permitem aplicar uma pressão mais elevada, quando comparado ao swab na superfície. É um método prático, possível de padronizar e coleta superfícies com diferentes níveis de contaminação. • Método por imersão: a superfície é colocada em contato com um meio diluente estéril dentro de um saco estéril, que em seguida é agitado por pelo menos um minuto. Depois, esta solução diluente segue para diluição seriada e plaqueamento no meio de cultura apropriado. É aplicável em qualquer tipo de superfície e é prático, possibilitando coletar em superfícies com diferentes níveis de contaminação. 4. Métodos de análises microbiológica de água A análise microbiológica da água é de extrema importância para avaliar sua potabilidade e prevenir contaminação durante o processamento dos alimentos. Segundo Silva (2017), a coleta da amostra de água para análise microbiológica deve ser adaptada de acordo com a origem da água: 42 • Água da torneira e tubulações: deve-se primeiro limpar a área externa com uma solução de hipoclorito de sódio 100 mg/l ou álcool 70%. Em seguida, flambar a saída de água se o material for resistente ao fogo; depois, abrir totalmente o fluxo de água e deixar correr de dois a três minutos. Então, reduzir o fluxo e coletar a amostra sem respingos para fora do frasco de coleta. • Água clorada: para estes casos o cloro residual livre deve ser neutralizado imediatamente após a coleta para evitar seu efeito bactericida sobre a água. Para isso, deve ser adicionada aos frascos de coleta, antes da sua esterilização, uma solução de 3% de tiossulfato de sódio para cada 100 ml de água. • Água de poço ou cisterna com bomba: bombear a água de cinco a dez minutos para estabilizar a temperatura da água. Caso não haja bomba, introduzir o frasco diretamente no fundo do poço tomando cuidado para evitar a contaminaçãoda amostra com material presente na superfície da água. Os padrões microbiológicos para água utilizada nas áreas de produção industrial de produtos comestíveis, segundo o MAPA, deve ser ausência E. coli, coliformes totais em 100 ml de água (BRASIL, 2022b). Já a Instrução Normativa nº 126/2022 indica que para águas comercializadas envasadas o critério estabelecido é a ausência de coliformes totais, E. coli, enterococos e Pseudomonas aeruginosa em 250 ml de água, e ausência de esporos de clostrídios sulfito-redutores e esporos de Clostridium perfringens em 50 ml de água (BRASIL, 2022b). Considerações finais Os critérios dos padrões microbiológicos têm sido atualizados nos últimos anos, e é importante sempre consultar os órgãos governamentais de referência, como a Anvisa e o MAPA, para verificar as legislações vigentes, e poder atender aos requisitos exigidos 43 Há vários fatores que podem influenciar a escolha de um método de análise microbiológica, como tipo de alimento, custo e tempo necessário para resposta da análise dentre outros. Contudo, independentemente do método escolhido, é preciso certificar-se de que é um método validado por algum dos órgãos oficiais, como mostrado nesta leitura digital. Referências BRASIL. Perguntas & Respostas: padrões microbiológicos. Gerência-Geral de alimentos. Gerência de avaliação de risco e eficácia de alimentos. 4. ed. Brasília, 2021. Disponível em: https://www.gov.br/anvisa/pt-br/centraisdeconteudo/ publicacoes/alimentos/perguntas-e-respostas-arquivos/padroes-microbiologicos. pdf. Acesso em: 16 abr. 2023. BRASIL. Instrução Normativa n. 161, de 1 de julho de 2022. Estabelece os padrões microbiológicos dos alimentos. Agência Nacional da Vigilância sanitária (Anvisa). Brasília, 2022a. Disponível em: http://antigo.anvisa.gov.br/ documents/10181/6503717/%281%29IN_161_2022_COMP.pdf/64b8368b-1f56-43c9- ab89-0674ef9a069f. Acesso em: 16 abr. 2023. BRASIL. Ofício-circular n. 15/2022/CGI/DIPOA/SDA/MAPA. Água de abastecimento. Produto de Origem Animal. Verificação oficial. Brasília, 2022b. Disponível em: https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/inspecao/produtos- animal/copy4_of_OC15_2022_DIPOA.pdf. Acesso em: 16 abr. 2023. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. FILHO, N. J. P.; MATA, G. M. S. C; DORES, M. T. Métodos de detecção de microrganismos em alimentos convencionais e rápidos. In: SÃO JOSÉ, J. F. B.; ABRANCHES, M. V. Microbiologia e higiene de alimentos–Teoria e prática. Rio de Janeiro: Rubio, 2019. FORSYTHE, S. J. Microbiologia da Segurança dos alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2013. MOBERG, L.; KORNACKI, J. L. Monitoramento Microbiológico do Ambiente de Processamento de Alimentos. In: APHA PRESS. Compêndio de Métodos para o Exame Microbiológico de Alimentos. APHA, 2015. Disponível em: https://ajph. aphapublications.org/doi/full/10.2105/MBEF.0222.008?role=tab. Acesso em: 16 abr. 2023. https://ajph.aphapublications.org/doi/full/10.2105/MBEF.0222.008?role=tab https://ajph.aphapublications.org/doi/full/10.2105/MBEF.0222.008?role=tab 44 SALVATIERRA, C. M. Microbiologia – Aspectos morfológicos, bioquímicos e metodológicos. São Paulo: Érica, 2014. SÃO JOSÉ, J. F. B. Monitoramento das condições microbiológicas no ambiente de produção de refeições. In: SÃO JOSÉ, J. F. B.; ABRANCHES, M. V. Microbiologia e Higiene de Alimentos Teoria e prática. Rio de Janeiro: Rubio, 2019. SILVA, N. da et al. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água. São Paulo: Blucher, 2017. 45 Alteração da qualidade de alimentos, critérios microbiológicos e legislações Autoria: Maria de Sousa Carvalho Rossi Leitura crítica: Marília Liotino dos Santos Objetivos • Conhecer alterações ocasionadas nos alimentos pelo processo de deterioração. • Entender como funciona o estabelecimento dos critérios microbiológicos para determinação da qualidade dos alimentos. • Aprender a interpretar a legislação relacionada aos padrões microbiológicos dos alimentos. 46 1. Avaliação da qualidade microbiológica dos alimentos. Caro estudante, você sabia que a qualidade microbiológica de um alimento é avaliada pela presença de microrganismos deteriorantes e patogênicos? Entretanto, não dá para fazer análise microbiológica de todos eles, e para escolher quais microrganismos serão considerados indicadores de qualidade, são consideradas as características do alimento, o processo de fabricação, as condições de armazenamento, os perigos e riscos e a relevância destes microrganismos para a saúde pública. Nesta leitura digital, conheceremos as alterações ocasionadas durante o processo de deterioração e de que forma utilizaremos a legislação para fazer a validação da qualidade microbiológica dos alimentos. 1.1 Alterações provocadas por microrganismos deteriorantes 1.1.1 Leite e derivados Devido às suas características intrínsecas, como riqueza de nutrientes, pH próximo do neutro e alta atividade de água, o leite é considerado um ótimo meio de cultura (FRANCO; LANDGRAF, 2008). A maioria dos microrganismos deteriorantes são provenientes do leite cru 102 a 104 UFC/ml, oriundos dos canais do teto da vaca, do úbere e dos equipamentos. Microrganismos psicotróficos como Pseudomonas, Flavobacterium e Alcaligenes ssp. constituem o grupo de maior potencial para deterioração dos produtos lácteos durante a estocagem sob refrigeração. Estes microrganismos produzem proteases e lipases termoestáveis que geram sabores e aromas desagradáveis, por 47 exemplo: odor de batata por Pseudomonas mucidolens, de peixe por Aeromonas hydrophila e de estábulo por Enterobacter. A coloração azulada pode ocorrer pela presença de Pseudomonas syncyanea, a coloração amarela aparece pela multiplicação deste mesmo organismo concomitante à presença do gênero Flavobacterium, e a coloração vermelha pela presença de Serratia marcescens e Micrococcus roseus. 1.1.2 Carnes e derivados Segundo Franco e Landgraf (2008; 2019), carnes e derivados têm em sua composição um meio de cultura propício ao desenvolvimento de microrganismos, pelo seu alto teor de nutrientes, especialmente substâncias nitrogenadas, alta atividade de água e pH próximo à neutralidade. A contaminação natural, o processamento e a temperatura de armazenamento contribuem para multiplicação dos microrganismos. A presença ou ausência de oxigênio neste caso não é impeditivo para os microrganismos deteriorantes. Defeitos como alteração de cor e odor, sabor desagradável e produção de gás podem ser ocasionados por microrganismos deteriorante aeróbios e anaeróbios facultativos, como a Pseudomonas spp., Shewanella putrefaciens, Brochothrix thermosphacta, Carnobacterium spp, membros da família Enterobacterieae, Lactobacillus spp. e outras que produzem ácido lático. Já defeitos como sabor azedo, descoloração, produção de gás, redução de pH e limo podem ser ocasionadas por microrganismo anaeróbicos bactérias B. thermophacta, S. putrefaciens e bactérias produtoras de ácido lático (carnobacterium, lactobacillus, Leuconostoc, Weissella). A seguir vamos conhecer os principais microrganismos deteriorantes e os defeitos que causam nas carnes e seus derivados. Limosidade superficial: em carne refrigeradas provocada por Pseudomonas e Alcaligenes, em salsichas e linguiças por Micrococcus 48 e leveduras, em frangos refrigerados ocasionada por Alcaligenes, Flavobacterium quando em temperatura mais altas, e em temperaturas mais baixa por Pseudomonas, Acinetobacter, Corynebacterium, Shewanella putrefaciens e leveduras. Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S): odor desagradável em carnes curadas provocada pelos microrganismos da família Enterobacterieae. Esverdeamento por H2S: em salsichas, carnes curadas e embaladas a vácuo, provocada por Weissella, Leuconostoc, Enterococcus e Lactobacillus, em carne vermelhas frescas embaladas a vácuo ocorre pela presença de Shewanella putrefaciens, Pseudomonas mefítica e Lactobacillus sakei.Odor de sulfeto: em carnes embaladas a vácuo ocasionado por Clostridium e Hafnia. Odor de repolho: em bacon provocado pela bactéria Providencia. Putrefação: em presuntos ocasionada pela presença de Proteus e Enterobactereceae Manchas nos ossos: em carnes inteiras provocadas por Clostridium e Enterococcus. Acidificação/azedamento: em presunto ocorre pela multiplicação de Enterococcus, Micrococcus, bactérias produtoras de ácido lático, Bacillus e Clostridium. 1.1.3 Pescados e frutos do mar O grupo dos pescados são alimentos altamente perecíveis em virtude das suas características intrínsecas que são propícias ao desenvolvimento de microrganismos, além do alto teor de gordura 49 poliinsaturada que é mais suscetível à oxidação (GERMANO; GERMANO, 2013). Segundo Franco e Landgraf (2008), a deterioração em pescados se dá basicamente por três motivos: Autólise: por ação dos sucos digestivos liberados após a morte do pescado que atravessa a parede intestinal, atuando na decomposição dos tecidos musculares, facilitando a multiplicação dos microrganismos que utilizam as substâncias nitrogenadas como fonte de energia, uma vez que o pescado tem baixo teor de carboidratos. A decomposição dos tecidos também pode ocorrer pela ação das enzimas presentes no próprio tecido do peixe. Oxidação de gordura insaturada: ocorre durante o armazenamento, podendo acontecer pela presença de microrganismos que produzem lipases. Desenvolvimento microbiano: que pode ser acelerado devido à qualidade da água onde vive o pescado, ou à contaminação acidental durante a manipulação ou armazenamento do peixe pós abate. As principais bactérias deteriorantes em pescados são: Pseudomonas spp., que durante o armazenamento produz odor frutado, sulfídrico e enjoativo; bactérias produtoras de H2S, Shewanella spp., em peixes de água salgada conservados sob refrigeração e que na presença de oxigênio produz TMA (trimetilamina), um metabólito produzido quando os microrganismos usam o TMAO (óxido de trimetilamina) como fonte de energia, produzindo mau cheiro e odores desagradáveis, que remetem à couve estragada; a Enterobacteriaceae são mais presentes em pescados fluviais; bactérias acidoláticas; Brochothrix thermosphacta; Photobacterium phosphoreum. É importante ressaltar que a maioria destes microrganismos são psicotrófilos, portanto, conseguem se desenvolver bem sob refrigeração (GERMANO; GERMANO, 2013). 50 Alguns microrganismos como Enterobacteriaceae, Vibrio ssp., Costridium spp. e Lactobacillus spp. têm a capacidade de produzir histamina no processo de deterioração, e o consumo de histamina pode provocar uma intoxicação química (GERMANO; GERMANO, 2013). Pescados salgados são deteriorados por bactérias halotolerantes (Micrococcus) ou halofílicas (genêro Haloccous e Halobacterium), que causam alteração de cor, promovendo aparecimento de pontos vermelhos no pescado (FRANCO; LANDGRAF, 2008). 1.1.4 Ovos Os ovos têm barreiras físicas, como a casca e as membranas internas e externas, que funcionam como barreiras mecânicas protegendo contra o ataque microbiano. Contam também com barreiras químicas, em virtude da presença de substâncias que inibem o crescimento microbiano. Como exemplo, há a conalbumina e a avidina, que se ligam ao ferro e à biotina, respectivamente, inviabilizando a utilização pelos microrganismos. Além disso, o pH dos ovos é mais alto (9,3), e a lisozima inibe o crescimento de bactérias gram-positivas (FRANCO; LANDGRAF, 2019). Dessa forma, para que haja deterioração do ovo, o microrganismo deve superar todas essas barreiras para conseguir chegar à gema, meio mais favorável à sua multiplicação. Isso ocorre quando há rachadura, fendas na casca ou sujidades na casca do ovo. Entretanto, quando ocorre deterioração microbianana, os responsáveis geralmente são a Pseudomonas, Alcaligenes e Acinetobacter, capazes de produzir derivados de H2S, gerando odor desagradável e produção de gás. Manchas pretas podem ser produzidas pela presença de Proteus, outras espécies de Pseudomonas e Aeromonas (FRANCO; LANDGRAF, 2019; FRANCO; LANDGRAF, 2008). 51 Fungos são menos frequentes, mas podem ocorrer pela presença de Serratia, que produz pontos vermelhos, e de Penicillium, que provoca pontos azuis, amarelos e verdes. Outros fungos que podem se desenvolver quando a umidade durante o armazenamento é alta são Sporotrichum, Cladosporium, Mucor, Thamnidium, Alternaria e Botrytis (FRANCO; LANDGRAF, 2008). 1.1.5 Vegetais Os vegetais, de maneira geral, em virtude de características inerentes ao processo de produção que promove uma contaminação natural considerável e da sua composição química (alta atividade de água, pH, rico em nutrientes, principalmente carboidratos, vitaminas e minerais), são alimentos muito perecíveis, e a multiplicação tanto de bactérias como de fungos é facilitada. Assim, a adoção de boas práticas de fabricação é essencial para prologar o shelf-life destes alimentos. No Quadro 1, vemos os principais microrganismos envolvidos na deterioração dos vegetais, e de que maneira isso ocorre. Quadro 1 – Deterioração em alimentos de origem vegetal Microrganismos Alterações Alimentos Erwinia, Pec- tobacterium, Carotovora, Pseudomonas e Xanthomonas Podridão mole bacteriana, oca- sionada pela decomposição da pectina, devido à produção de pectinases, causando odor de- sagradável, aparência úmida e amolecimento do vegetal. Alface, alho, aspargo, cebola, cenoura, couve-flor, melancia, espinafre, repolho, pepino, ba- tata. Erwinia, Pecto- bacterium, Enterobacter, Pseudomonas e Xanthomonas Amolecimento do vegetal. Vegetais minimamente proces- sados são mais suscetíveis, pois perdem suas barreiras físi- cas durante o processamento. Botrytis Este fungo pode se desenvolver em pH mais baixo, facilitando crescimento do bolor na superfí- cie e degradação dos carboidra- tos. Causa podridão fúngica*. Este fungo acomete mais de 26 tipos de vegetais, como e uvas, 52 Colletotrichum e Gloeosporium Responsáveis pela antracnose (infecção que causa lesão ne- crótica no tecido vegetal). Causa podridão fúngica. Mangas, abacates, papaya (Colletotrichum), maçã e bana- na (Gloeosporium). Fusarium sam- bucinum, F. coeruleum e Pe- nicillium scleroti- genum Deterioração seca (o tecido é de- teriorado, mas mantém aspecto seco). Tubérculos (batata, inhame, mandioca). Leveduras (1) Leveduras selva- gens (2) Lactobacillus bre- vis, Leuconostoc mesenteroides, L. delbrueckii (3), Leuconotoc me- senteroides, L. brevis e L. planta- rum (4) (1) Fermentação alcóolica. (2) Produzem ácidos de cadeia curta gerando sabores e odores desa- graváveis quando se mul- tiplicam em temperaturas mais elevadas. (3) Fermentação lática. (4) Limosidade. (1,2) Sucos e fruta naturais, concentrados de frutas. (3) Suco de maçã e pera. (4) Suco de maçã. Bacillus ssp. (1) Rizopus (2) Fusarium, Alter- naria, Cladospo- rium e Claviceps, Penicillium, As- pergillus (3) (1) Produzem amilase, que hidro- lisa molécula do amido. (2) Aparecimento de pontos pre- tos. (3) Produzem micotoxinas. (1, 2 e 3) Cereais e farinhas. *Podridão fúngica é identificada pela presença de áreas marrons ou de cor creme, e pela formação do micélio. Fonte: adaptado de Franco e Landgrad (2019). 2. Critérios microbiológicos e legislações A qualidade de um alimento é definida por vários parâmetros, entre eles, qualidade física, química, sensorial e microbiológica. Por meio das análises microbiológicas é possível determinar a presença de microrganismos patogênicos, no caso da ocorrência de uma doença 53 transmitida por alimento. Entretanto, antes disso, o uso de análises microbiológicas durante o processo de fabricação e manipulação de um alimento permite reduzir riscos à saúde e defeitos que possam ocorrer no processo de fabricação em virtude de ingredientes de má qualidade, defeitos nos equipamentos, falta de boas práticas de manipulação etc. – ou seja, as análises