AULA1_TESTES MARCADOS_2025 1

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Princípios	dos	testes	sorológicos	
marcados
	Prof.	Dr.	Gdayllon	Cavalcante	Meneses
UNIVERSIDADE	FEDERAL	DO	CEARÁ	–	UFC	
FACULDADE	DE	FARMÁCIA,	ODONTOLOGIA	E	ENFERMAGEM	–	FFOE	
DEPARTAMENTO	DE	ANÁLISES	CLÍNICAS	E	TOXICOLÓGICAS	–	DACT	
DISCIPLINA:	IMUNOLOGIA	APLICADA	À	FARMÁCIA
2025.1
Objetivos	da	aula
• Conhecer	a	importância	dos	testes	marcados	e	os	métodos	
usados	para	imunodiagnóstico	
• Aprender	os	princípios	gerais	dos	testes	sorológicos	
marcados.	
• Conhecer	os	principais	tipos	de	testes	marcados	e	suas	
peculiaridades,	bem	como	importância	clínica.
Introdução Imunodiagnóstico
técnicas	imunológicas	que	
revelam	hipersensibilidade	a	
antígenos
técnicas	imunológicas	que	revelam	
a	presença	de	Ac	ou	de	Ag	no	
organismo	do	paciente
as	reações	
intradérmicas	e	
percutâneas	e	outras Ensaios	não	
marcados
Ensaios	
marcados
utilizam	sinalizadores	da	interação	
Ag-Ac	com	conjugados-ligantes
imunofluorescência,	radioimunoensaio,	
imunoenzimáticos,	imunofluorimétricos	
e	quimiluminescência
Imunoprecipitação,	
aglutinação	(sem	uso	de	
amplificadores)
Ex:.	Teste	de	Mantoux	(PPD)
Introdução
Ensaios	clássicos	com	reagentes	
não	marcados vs Ensaios	com	reagentes	marcados
Princípio	da	precipitação	
clássica
Necessária	formação	de	grandes	
complexos	Ac-Ag	para	detecção
Baixa	sensibilidade	de	detecção
Uso	de	reagentes	marcados	
(amplificadores	de	sinal)
Não	há	necessidade	de	formação	de	
grandes	complexos	para	detecção
Alta	sensibilidade	de	detecção
Princípio	geral	dos	testes	sorológicos	marcados
• Interações	entre	Ac-Ag	
• Marcação	(conjugados)	
• Emissão	de	sinal	e	leitura
especificidade
sensibilidade
Amplificação	do	sinal
Interação	Ac-
Ag
Marcadores	
radioativos Enzimas Fluorocromos
Contador	de	
radiação	
gama	ou	beta
Marcação Sinal
Substrato	+	
Cromógeno
Colorimétrico
Substrato	+	
luminógenos
Quimioluminescente
Espectrofotômetro Luminômetro
substratos	
fluorogênicos
Fluorimetria
Microscopia	de	
fluorescência,	
Citometria	de	
fluxo,	fluorímetro.	
Sistemas	de	
revelação
Técnicas	e	ensaios	utilizando	conjugados-
ligantes
Fluorescência
• São	empregados	conjugados	constituídos	de	
anticorpos	ou	antígenos	ligados	covalentemente	
a	moléculas	reveladoras	denominadas	
fluorocromos LUZ	(pequeno	comprimento	de	onda)
Elétrons	elevam	
sua	energia	no	
átomo
Liberação	de	LUZ/
fluorescência		
(comprimento	de	
onda	maior)
Elétrons	voltam	ao	
estado	basal
Detector	de	
fluorescência	
Imunofluorescência
• Técnica	de	imunohistoquímica	para	detecção	de	
antígenos	em	células	ou	tecidos	através	do	uso	
de	conjugados	de	anticorpos	marcados	com	
fluorocromos	
• Tipos:	Direta	e	indireta
Imunofluorescência
Imunofluorescência	
Direta vs Imunofluorescência	
Indireta
Amostra	biológica:	tecido	
(biópsia)	ou	célula	do	
paciente
Pesquisa	do	antígeno	alvo:	(add	
Anticorpo	conjugado	ao	
fluorocromo	->	anti-Ag)
Exemplos	de	Ag:	
vírus,	protozoários,	fungos,	
bactérias,	imunoglobulinas,	
imunofenotipagem	de	células..
Amostra	biológica:	soro	do	
paciente
Pesquisa	de	Anticorpos	no	soro	
que	se	ligam	aos	Ag	da	Amostra
Exemplos	de	Ag:	
anti-T.cruzi,	anti-T.pallidum,	
anti-T.gondii
Biópsia
Fluoresceína:	absorção	(490-	495	nm)/	
emissão	(517nm-	cor	verde).	
Rodamina:absorção	(517	nm)/	emissão	
(580	nm-	cor	vermelha).
Microscópio	de	
Fluorescência
Exemplos	de	fluorocromos	usados:
Fonte	de	luz	→	Filtro	de	excitação	→	Espelho	
dicróico	→	Amostra	(fluoresce)	→	Espelho	→	
Filtro	de	emissão	→	Ocular/câmera
Imunofluorescência
• Observações:	
1)	A	intensidade	máxima	de	luz	emitida	ocorre	em	pH	8,5	(glicerina	alcalina);		
2)	Uso	de	corantes	como	o	azul	de	Evans	reduz	a	coloração	de	fundo,	
melhorando	o	contraste;		
3)	A	qualidade	do	teste	depende	do	material	utilizado	no	preparo	dos	
conjugados	anticorpo-fluoresceína.
Exemplos	importantes
• Imunofluorescência	Direta	–	análise	de	biópsias	em	tecidos:
Pesquisa	de	IgG/C3	em	biópsia	
de	glomérulo	renal
Pesquisa	de	IgG/C3	em	biópsia	
de	pele
Exemplos	importantes
• Imunofluorescência	indireta	-	Chagas:
- Detectar anticorpos do tipo IgG, relacionados à fase crônica da doença 
de Chagas, e os anticorpos do tipo IgM, associados à fase aguda da 
doença.
 
- Confirmar os resultados positivos, duvidosos ou negativos obtidos com os 
métodos de IHA (Inibição da Hemaglutinação) e de ELISA.
- O teste pode ser qualitativo ou semi-quantitativo (títulos das diluições 
com PBS)
Exemplos	importantes
• Imunofluorescência	indireta	–	IgG	anti-Treponema	pallidum	
Fluorescent	Treponemal	Absorption	(FTA-ABS)
Triagem!	Baixa	especificidade Confirmatório!	alta	especificidade
• Prova	qualitativa:	Fluorescent	Treponemal	Absorption	(FTA-ABS)
1. Coleta	de	amostra	de	soro	do	paciente	
2.	Inativação	do	complemento	(Incubar	amostras	a	56°C,	30min,	para	inativar	
complemento)	
3.	Absorção	com	Treponemas	de	Reiter	(soro	é	tratado/pré-absorvido	–	absorção	de	
anticorpos	anti-treponema	saprófitas	[Reiter	-	cepa	de	treponema	não	patogênico].	à 
diminui	reação	cruzada	à reduz	falso-positivo	à aumenta	especificidade	
4.	Adição	a	Lâminas	Cobertas	com	Treponema	pallidum	(Add	soro	pré-absorvido	a	
lâminas	previamente	cobertas	com	antígenos	de	T.pallidum)	
5.	Incubação	com	Anticorpos	Fluorescentes	e	revelação	(Adição	de	anti-IgG	marcada	
com	fluorocromos,	permitindo	sua	detecção)
ELISA	(enzyme-linked	immunosorbent	assay)	
“Ensaio	Imunoenzimá/co"	
ELISA	(enzyme-linked	immunosorbent	assay)
• Baseia-se	na	imobilização	de	um	dos	componentes,	antígeno	ou	
anticorpo,	em	fase	sólida,	e	na	utilização	de	um	conjugado	(Ag	ou	
Ac,	ligado	a	uma	enzima),	com	a	preservação	da	atividade	
enzimática	e	imunológica.
•Elevadas	sensibilidade	e	especificidade	
•Rapidez	e	custo	baixo	
•Objetividade	de	leitura	
•Possibilidade	de	adaptação	a	
diferentes	graus	de	automação	
ELISA	-	Componentes
• Fase	sólida	
• Anticorpos	
• Bloqueio	
• Soluções	de	lavagem	
• Diluente	da	Amostra	
• Antígenos	
• Conjugados	
• Substratos
ELISA	-	Componentes
• Fase	sólida	
– Geralmente	fases	sólidas	de	plástico	com	polímero	de	estireno	
(poliestireno)	-	sítios	apolares	hidrofóbicos		
– Placas	de	96	poços	com	alta	afinidade	a	anticorpos	e	antígenos
ELISA	-	Componentes
• Anticorpos	
– Conjugados	à	enzima	(através	de	resíduos	de	açúcar	na	fração	Fc)	ou	não;	
– Policlonais	ou	monoclonais;	
– Totais	ou	purificados;		
– Podem	ser	empregados	fragmentos	ou	frações	de	imunoglobulinas.
ELISA	-	Componentes
• Bloqueio	
– Bloqueio	de	sítios	reativos	remanescentes	na	fase	sólida,	usando	proteína	
bloqueadora		
– Proteína	bloqueadora:	não	tem	relação	com	o	sistema	antígeno-anticorpo	
em	estudo.		
– Exemplos:	soluções	de	leite	desnatado,	caseína,	gelatina	e	albumina	
concentrados.	
BSA	5%	(Bovine	Serum	Albumin)
ELISA	-	Componentes
• Soluções	de	lavagem	
– Soluções	isotônicas,	salina	tamponada	com	fosfatos,	pH	de	6,8	-	7,2	(PBS,	
Salina	tamponada	com	fosfato)	contendo	0,01	a	0,05%	de	Tween	20.		
– Processo	de	lavagem	por	3	a	5	vezes	+	tempo	de	molho	(soaking	time)	de	
cerca	de	30	a	60s	entre	as	lavagens	e	leve	agitação.
Lavadora	de	placas
ELISA	-	Componentes
• Diluentes:	
– Deve	conter	componentes	que	reduzam	a	adsorção	inespecífica	de	
componentes	da	amostra	ao	suporte	sólido	(diminuir	background!).		
– Exemplos:	Tween	20	(detergente	não	iônico),	e	proteínas,	como	leite	
desnatado,	BSA	e	caseína	(proteínas	que	foram	usadas	no	bloqueio,	mas	em	
menor	concentração).
ELISA	-	Componentes
• Antígenos	
– Conjugados	ou	não	à	enzima;	
– Podem	ser	naturais,	extratos	brutos	ou	fracionados	e	purificados,	peptídios	
sintéticos	ou	recombinantes;	
– O	grau	de	pureza	e	a	acessibilidade	dos	epítopos	são	fatores	determinantes	
na	eficiência	do	teste.
ELISA	-	Componentes
• Conjugados	
– moléculas	de	antígenos	ou	anticorpos	ligados	covalentemente	à	enzima,	de	
modo	a	conservar	as	funções	das	moléculas	conjugadas:		
✓atividade	enzimática	da	enzima	
✓antigenicidade	do	antígeno		
✓especificidade	da	imunoglobulina
Exemplos:	
o Sistema	Avidina-biotinao Proteína	A	conjugada	com	peroxidase	
o Streptavidina-peroxidase	
o Anti-IgG	conjugado	a	corante	coloidal
ELISA	-	Componentes
• Sistema	avidina-biotina
ELISA	-	Componentes
• Substratos	
– Cromogênicos:	
– Exemplos	de	cromógenos:	
• ortofenilenodiamina	(OPD)	ou	
tetrametilbenzidina	(TMB)	
Produtos	
coloridos
H2O2	
(substrato)
Ação	enzimática	(peroxidase)
Cromógeno+ Add	aos	poços
Solução	de	parada	
(ácido	diluído)
Coloração	solúvel
ELISA	-	Componentes
• Substrato	quimioluminescente
Maior	sensibilidade
ELISA	-	Componentes
• Leitura Espectrofotômetro
Luminômetro
ELISA	-	Tipos
• Para	pesquisa	de	antígeno	na	amostra	
– Sanduíche,	competitivo	
• Para	pesquisa	de	anticorpo	da	amostra	
– Indireto,	sanduíche,	competitivo,	captura	de	imunoglobulina	classe	
específica.	
ELISA	sanduíche	para	pesquisa	de	antígenos
ELISA	competitivo	para	pesquisa	de	antígenos
ABS [Ag]=
ELISA	indireto	para	pesquisa	de	anticorpos
cor
ELISA	sanduíche	indireto	e	competitivo	para	
pesquisa	de	anticorpos
ELISA	de	captura	de	Imunoglobulinas
captura	de	IgM	com	
antígeno	marcado
captura	de	IgM	com	
anticorpo	marcado
Exemplo	importante:	
-	Falso	positivo	para	pessoas	que	já	tiveram	Dengue	(IgG	+),	no	exame	IgM:	
Interferência	de	Fator	Reumatóide	
	(IgM	anti-IgG	–	autoanticorpo)....
Fazer	captura	de	
IgM
uso	de	absorventes	para	
remover	IgG
“Magnetic	beads”	–	
Partículas	magnetizadas
• Beads	magnéticas	são	
revestidas	de	Ag	ou	Ac.		
• Depois	se	coloca	a	amostra	
(pesquisa	Ag	ou	Ac).		
• A	separação	do	que	não	
ligou	é	feita	usando	uma	
placa	imantada/
magnetizada	(aumenta	
sensibilidade	e	
especificidade	do	ensaio)	
• Segue	procedimento	até	
leitura.
ELISA	–	índice	de	avidez	de	IgG
• Soma	das	forças	de	ligação	(afinidade)	não	covalente	entre	Ag-Ac.	
• Quanto	maior	a	avidez	dos	Ac	da	amostra	à	maior	a	estabilidade	dos	
imunocomplexos	à	amostra	contém	IgG	de	memória	(infecção	pregressa)
Resultado: Abs amostra teste uréia x 100 (%)
Abs amostra teste não tratada
Solução	
dissociante
Ex:.	Uréia	6M,	
dietanolamina	35	mM
Método	de	diluição:		
• Ensaio	1:	diluição	de	soro	em	diluente		
• Ensaio	2:	diluição	de	soro	em	diluente	+	
DEA	ou	ureia.
ELISA	–	índice	de	avidez	de	IgG
anticorpos	de	baixa	avidez	
predominam	na	fase	aguda/
recente	da	infecção	primária
anticorpos	de	elevada	
avidez	são	predominantes	
na	resposta	de	memória,	ou	
secundária
VS
Ajuda	a	definir	se	a	infecção	é	
recente	ou	pregressa.	
IMPORTÂNCIA
SOROLOGIA	PARA	TOXOPLASMOSE..		
INFECÇÃO	PRIMÁRIA	EM	GESTANTE?
Teste	de	Avidez	
de	IgG
	50%
Aguda? Intermediária
/	inclonclusivo
Pregressa/
crônica?
??
Exame	1:	IgM+/IgG-		
Exame	2:	IgM+/IgG-	 FP?!
Exame	1
Exame	1:	IgM-/IgG+	
15	dias	depois
ELISA	–	expressão	de	resultados
• O	resultado	do	ELISA	pode	ser	qualitativo,	semi-quantitativo	e	
quantitativo.	
Cut-off
Curva	padrão
TÍTULO
Absorbância	(positiva/Negativa)
Concentração
Testes	imunocromatográficos
Poço
Poço
Poço
RESULTADOS	POSITIVO
RESULTADOS	NEGATIVO
Poço
Poço
BOM	DIAAA!!