relatorio 3 bioquimica(Salvo Automaticamente)

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ - UESC 
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIAS E COMPUTAÇÃO - DEC 
ENGENHARIA QUÍMICA 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA 
 
 
Disciplina: CET 996 – Engenharia Bioquímica 
Professora: Elizama Aguiar de Oliveira 
Semestre: 24.2 
 
Aula Prática n° 03 
Data: 15/10/2024 
Tema: Contagem de células de leveduras em Câmaras de Neubauer. 
Grupo: 
Davi Gomes Nascimento / 202210597 
Hannah Vita Moraes Santana / 202210598 
 
 
 
 
 
 
ILHÉUS-BAHIA 
2024
 RESUMO 
 
O experimento focou na contagem de células de Saccharomyces cerevisiae em câmara de 
Neubauer, comparando uma amostra com azul de metileno e outra apenas com a solução do 
microrganismo. O objetivo foi avaliar a diferença entre as duas técnicas para distinguir células 
viáveis. A metodologia envolveu a aplicação das amostras na câmara de Neubauer e a contagem 
sob o microscópio. O azul de metileno facilitou a identificação de células mortas. Os resultados 
mostraram maior precisão na contagem de células viáveis com o uso do corante. Conclui-se que o 
azul de metileno é essencial para distinção de células viáveis e mortas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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SUMÁRIO 
 
1) INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................... 4 
2) OBJETIVOS DA AULA PRÁTICA ..................................................................................... 5 
3) MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 5 
3.1 Materiais ............................................................................................................................... 5 
3.2) Métodos ou Procedimentos ................................................................................................. 5 
4) RESULTADOS E DISCUSSÕES ......................................................................................... 6 
5) CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................ 12 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 13 
 
 
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LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1 – Utilização do vortex para agitar e homogeneizar a solução. ................................... 6 
Figura 2 – Contagem em zig-zag dentro do quadrante. ............................................................ 7 
Figura 3 – Demonstração da contagem de células em linhas divisórias. Em vermelho, células não 
contadas no quadrante; em verde, células contadas em apenas um quadrado interno; em azul, 
células contadas. ......................................................................................................................... 7 
Figura 4 –Contagem em zig-zag dentro do quadrante.. ............................................................ 8 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1) INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
 
A contagem de células de levedura, como a Saccharomyces cerevisiae, faz parte de atividades 
cotidianas que impactam diretamente áreas como a produção de alimentos e a pesquisa científica. 
Embora esse processo seja invisível a olho nu, ele desempenha um papel fundamental na criação 
de produtos que consumimos no dia a dia, como pão, cerveja e vinho. Saber quantas células 
viáveis estão presentes em uma amostra nos permite controlar a qualidade da fermentação e 
garantir que o processo produtivo ocorra sem problemas. A precisão dessas contagens pode 
determinar o sucesso ou o fracasso de uma produção. 
No centro dessa tarefa está a câmara de Neubauer, um dispositivo relativamente simples, mas 
crucial para contagens precisas. Utilizando essa ferramenta em combinação com técnicas de 
diluição seriada, conseguimos identificar a concentração de microrganismos viáveis em uma 
solução, permitindo extrapolar a quantidade total em um volume maior. Além disso, quando 
utilizamos corantes como o azul de metileno, que ajuda a distinguir células vivas das mortas, 
aumentamos ainda mais a precisão da análise. 
A Saccharomyces cerevisiae, uma das leveduras mais estudadas, tem uma relevância que vai 
além da fermentação alcoólica. Seu papel na biotecnologia moderna é extenso, com aplicações 
que incluem a produção de biocombustíveis e até medicamentos, como proteínas terapêuticas. 
Portanto, a contagem adequada dessas células viáveis tem implicações que tocam tanto a 
indústria quanto a saúde pública. 
A técnica de diluição seriada complementa a contagem em câmara de Neubauer, permitindo 
ajustar amostras que podem ter concentrações celulares muito altas para serem contadas 
diretamente. Com isso, evitamos erros comuns em amostras muito densas, garantindo uma maior 
precisão nos resultados. Esta metodologia é aplicada em vários campos da microbiologia, sendo 
uma ferramenta básica para estudantes, pesquisadores e profissionais. 
Portanto, o que pode parecer um simples processo de contagem de células em uma pequena 
lâmina é, na verdade, uma prática que assegura a eficiência de grandes processos industriais e 
pesquisas científicas. É uma técnica que, quando bem executada, garante qualidade, controle e 
sucesso em aplicações que impactam diretamente nossa vida diária. 
 
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2) OBJETIVOS DA AULA PRÁTICA 
Estimar o número de levedura por volume de amostra utilizando as técnicas de diluição seriada 
e contagem em câmera de Neubauer. 
3) MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1 Materiais 
 Solução estoque (Saccharomyces cerevisiae); 
 Solução salina NaCl (0,85% p/v); 
 Solução azul de metileno/eritosina; 
 Tubos de ensaio; 
 Galeria para tubos; 
 Micropipeta 1000µL; 
 Ponteiras; 
 Pipeta volumétrica de 10mL; 
 Pera de sucção; 
 Vortex; 
 Câmara de contagem Neubauer; 
 Lamínula; 
 Microscópio. 
3.2) Métodos ou Procedimentos 
3.2.1) Procedimento 1- Diluição seriada 
Foram separados 8 tubos de ensaio em uma galeria para tubos, e foi transferido 9 mL de solução 
salina (NaCl 0,85%) em cada um dos 7 primeiros tubos. Após isso pipetou-se 1 mL de uma 
solução contendo Saccharomyces cerevisae, transferiu-se essa alíquota para o primeiro tubo e a 
solução foi agitada com a utilização do vortex, formando 10 mL de uma solução mais diluída, ou 
seja, menos concentrada quando comparada com a solução inicial de Saccharomyces cerevisae. 
Dessa solução contida no primeiro tubo, foi pipetada 1 mL e transferida para o segundo tubo, 
que também foi agitado. O processo de diluição descrito foi repetido até que foi alcançada uma 
diluição de 10-7 da solução original (foi diluído 7 vezes). No oitavo tubo, foi transferido 1mL da 
solução presente no sétimo tubo, ou seja, a solução com fator de diluição de 107 e adicionou-se 
1mL de azul de metileno, que serviu como corante para facilitar a visualização de células ao 
observá-las no microscópio com a utilização da câmara de Neubauer. As células vivas, devido a 
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sua alta atividade fisiológica não se colorem, pois degradam o corante, já as células mortas são 
coloridas, isso torna possível a distinção entre células mortas e células vivas (viáveis). 
 
 Figura 1- Utilização do vortex para agitar e homogeneizar a solução 
3.2.2) Procedimento 2- Preparação da Câmara de Neubauer 
Para a contagem de células, foi necessário preparar a câmara de Neubauer. A câmara foi lavada 
com água e detergente neutro, tomando cuidado para não a arranhar, após isso foi feita uma 
lavagem com álcool 70% e com um papel foi feita a secagem. O mesmo procedimento de 
lavagem foi feito na lamínula. Depois desse processo de limpeza, a lamínula foi colocada sobre 
a câmara de Neubauer, tomando o cuidado de deixar um espaço para que seja adicionada a 
amostra. Com uma micropipeta, foi transferida um pouco de solução com diluição de 107 semcorante para a câmara inferior, além disso, transferiu-se a solução diluída que está com corante 
para a outra câmara. Essa adição de solução em cada câmara deve ocorrer de maneira cuidadosa 
para que não ocorra a formação de bolhas. Com a câmara de Neubauer preparada, o próximo 
passo foi a observação e contagem das células com auxílio do microscópio óptico. 
3.2.3) Procedimento 3- Contagem de células na Câmara de Neubauer 
A câmara de Neubauer contendo as soluções com e sem corante foram levadas para observação 
e contagem de células no microscópio. 
 
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Para realizar a contagem devemos escolher os quadrantes que iremos contar, em nossa prática 
selecionamos 4 quadrantes A. A contagem de um quadrante deve ser feita contando a quantidade 
de células em cada um dos quadrados internos desse quadrante em zig-zag como pode ser visto 
na figura 2. 
 
 Fonte: Roteiro da prática 
 Figura 2-Contagem em zig-zag dentro do quadrante. 
As células que estão sobre as divisórias entre quadrados devem ser contados apenas uma vez, já 
as células que estão em cima das linhas divisórias do quadrante não são contadas, como mostrado 
na figura 3. 
 
 Fonte: Roteiro da prática 
 Figura 3– Demonstração da contagem de células em linhas divisórias. Em vermelho, células não contadas no quadrante; em 
verde, células contadas em apenas um quadrado interno; em azul, células contadas. 
Após a contagem de células totais de cada um dos quadrantes, deve-se calcular a média de células 
dos quadrantes para que seja possível estimar a quantidade de células da solução de origem. A 
contagem é feita nas duas amostras, na amostra com corante pode-se contar o número de células 
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mortas, já na amostra sem corante são contadas as células totais, com isso, é possível determinar 
o número e porcentagem de células viáveis na solução de origem. 
4) RESULTADOS E DISCUSSÕES 
4.1) Contagem de células na Câmara de Neubauer 
Durante o experimento com a câmara de Neubauer, utilizamos duas soluções com concentrações 
muito diluídas: uma com corante e outra sem corante. A solução com corante tinha o objetivo de 
nos permitir visualizar as células mortas, enquanto a solução sem corante era destinada à 
contagem geral das células. No entanto, devido à baixa concentração celular em ambas as 
soluções, a visualização foi ineficaz, especialmente na solução com corante, onde não 
conseguimos identificar as células mortas. 
Devido a essa dificuldade, fomos orientados a realizar os cálculos com base em dados fornecidos 
pela professora. Esses dados fornecem a contagem de células em uma amostra que não possui 
corante, portanto não há como fazer a distinção entre células vivas e mortas, tornando impossível 
dizermos a quantidade de células viáveis que estão presentes na solução, além disso, nos foi 
fornecido apenas a contagem de um quadrante, devido a isso, iremos considerar a quantidade 
total dessas células nesse quadrante como a média dos quadrantes ao fazermos os cálculos. 
O valor médio foi de 545 células por quadrante. 
 
 Fonte: Docente 
 Figura 4- Quadrante inferior esquerdo para a contagem de células 
 
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 Fonte: Docente 
 
Utilizando volume de amostra sobre cada quadrante (0,1 mm3 = 10-4 mL), obtém-se o valor médio 
da contagem de 545x104 cel/mL ou 5,45x106 cel/mL. A amostra teve uma diluição de 1:107 a 
contagem de células totais na amostra foi de (5,45x106) x (107) = 5,45x1013cel/mL. 
 
M(cél) = Média do número de células contadas em cada quadrante 
V(a) = Volume de amostra sobre cada quadrante 
FD = Fator de diluição da amostra 
 
Devido a indisponibilidade dos dados de células mortas, não foi possível realizar o cálculo da 
viabilidade das células. 
 
 
 
 
5) CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 
A prática mostrou a importância da técnica de contagem de células na câmara de Neubauer, 
destacando como a preparação correta das amostras é essencial para obter resultados confiáveis. 
O uso do corante, embora útil para diferenciar células vivas e mortas, também depende de uma 
boa concentração celular. No geral, a prática reforçou a relevância de controlar bem essas 
condições para garantir uma contagem e um cálculo confiável do número de células em uma 
amostra. 
 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
[1] MADIGAN, T. M.; MARTINKO, M. J.; BENDER, S. K.; BUCKLEY, H. D.; STAHL, A. 
[2] D. Microbiologia de Brock, 14.ed. Artmed, Porto Alegre, 2016. 
[3] TORTORA, J. G.; FUNKE, R. B.; CASE, L. C. Microbiologia, 12.ed. Artmed, Porto 
Alegre, 2017. 
[4] VIEIRA, D.A.P; FERNANDS, N.C.A Microbiologia Geral. Rede e-Tec. Inhumas, 2012