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14/04/24, 17:39 OneNote
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Clonagem molecular (DNA recombinante) 
10 de abril de 2024 13:22 
 
 
 
 
Para obter uma clonagem necessitamos: (passos) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Introdução do plasmídeo (produto da ligação) em bactéria - transformação  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Investigação da função de um determinado gene 
•  Manipulação genética (animais transgénicos)  
• Produção de proteínas (em bactéria ou outros organismos)  
 
Como obter o fragmento de DNA: 
• Fazendo o PCR para isolar o fragmento do genoma 
• Sintetizá-lo por síntese química 
• Por restrição do genoma (enzimas de restrição)  
Partir o genoma aos bocados e colocar cada bocado num plasmídeo 
 
Serve para sequenciar 
DNA obtido por transcrição reversa 
            (complementar) 
             É sintetizado a partir do RNAm 
É sempre produzido por bactérias 
 
Sequências palindrómicas- sequências iguais mas invertidas 
 
Insert/fragmento é a mesma coisa 
 
Enzima ligase- faz a ligação entre a ponta do vetor e a ponta do fragmento 
• Produção de uma enzima de substituição (tratamento), 
 • Produção de anticorpos para combater uma infecção (ex: HIV)  
• Produção de proteína para estudos estruturais (raio X) 
 
• Significa que se refere à expressão de um gene de um organismo eucariótico (como um
gene humano) em uma bactéria.  
 
• Em vez de clonar o DNA genômico completo do organismo eucariótico, o que incluiria
sequências não codificantes e introns,  concentra-se apenas no RNA mensageiro
(mRNA) produzido pelo gene desejado. 
 
•  Esse mRNA é então convertido em DNA complementar (cDNA) usando a enzima
transcriptase reversa.  
 
• O cDNA, que contém apenas as regiões codificadoras do gene eucariótico, é então
clonado na bactéria para expressão do gene. Isso é comum em pesquisas biomédicas e
biotecnológicas, onde se deseja produzir uma proteína específica ou estudar a função
de um gene eucariótico em um sistema bacteriano. 
 
cDNA para clonagem terá de ser ds cDNA (ds - double stranded) 
Obtenção dos:  
• Restrição de genoma  
•  Produto de PCR  
• cDNA                                                   
• Síntese química  
 
 
 
• Amplificação e isolamento a partir de bactéria  
(vectores naturais foram a base dos vectores hoje usados 
 – foram sujeitos a enormes alterações e manipulações)  
 
Obtenção dos fragmentos de DNA a clonar 
Obtenção do vetor  
 
Digestão do plasmídeo e do fragmento de DNA com enzimas de restrição 
Ligação do vector ao fragmento por complementaridade de sequências  
(+ ligase)  
(O plasmídeo é sempre produzido por bactérias) 
• Se eu digerir o fragmento com enzimas de restrição e digerir o vetor com a
mesma enzima (dado que as sequências são palindrómicas),  o que sobre de um
lado é o complementar do outro 
 
• Quando abre encaixa na perfeição 
 
• Enzima ligase – faz a ligação das duas peças  
 
 
• Com fragmento a zona de lacZ fica partida em 2 
• LacZ consegue degradar através da beta- galactosidase o X-Gal (azul) 
Serve para:  
Isolar, manipular e copiar fragmentos  
de DNA inseridos 
 no plasmídeo que permitem obter 
 o vetor recombinante  
Não podem ser usados para expressar o gene em células humanas 
• Falta um gene de resistência humano 
• Falta uma origem de replicação humana  
 
 
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         Seleção do DNA recombinante 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• PCR não funciona se não tiver insert / funciona se tiver insert 
 
• Apresentam várias bandas- não tem fragmento (descartar) 
 
• Apresentam uma banda- têm fragmento (utilizar) 
 
 
 
 
(Por fim, é necessário fazer uma terceira confirmação- sequenciar para utilização futura) - confirmar a
sequência 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Resulta da junção das duas peças 
• O nome da tecnologia – DNA recombinante deriva desse processo 
 
• Há poucas cópias do DNA recombinante no tubo onde ocorreu a reação 
 
• 99,9 vão ser assim:  
(não houve transformação) 
 
Outras transformaram-se  
com o plasmídeo que não se quer 
E as restantes têm a transformação ocorrida 
 e está lá o plasmídeo 
que se quer 
 
 
Os vetores são: 
• Pequenos e circulares (forma estrutural) 
• Têm 3 regiões: 
O gene que permite a seleção das bactérias que têm plasmídeo 
Ex: genes que conferem resistência a antibióticos 
 
Gene da seleção dos transformantes 
(permite selecionar as bactérias  
que têm plasmídeo) 
Zona que permite a clonagem molecular do fragmento 
Permite a replicação do plasmídeo 
 a cada divisão celular 
• Pegamos nas bactérias que transformámos  
 
• Obtivemos uma placa cheia de colónias 
As bactérias que não têm plasmídeo não formam colónias!! 
Porque não têm o gene de resistência ao antibiótico  
Origem de replicação 
Sem ela o plasmídeo não é replicado a cada vez que a bactéria dividir   
(Entrando em ciclo celular)    
                                                                                         
      
MCS- Local do plasmídeo onde existem regiões de corte para a enzima 
 (existem várias sequências de corte para as enzimas de restrição) 
(é uma espécie de zona de entrada do fragmento que se pretende colocar) 
 
 
Desaparecem 
  -99,9% 
A) 
A) 
 
• Ir uma a uma 
• Cultivar as bactérias e fazê-las crescer em meio líquido para  
isolar o DNA plasmídico 
• Utilizar as mesmas enzimas de restrição que foram usadas para colonar o
plasmídeo 
 
• Cortar no mesmo sítio 
 
• Plasmídeo fechado sem nada quando se corta- inadequado 
• Plasmídeo com o fragmento - adequado 
 
 
Colónias azuis são as que correspondem ao gene LacZ intacto (não tem fragmento) 
Colónias brancas correspondem ao gene de  LacZ que se partiu (tem o fragmento) 
 
 
Hospedeiros  Para produzir DNA recombinante 
 
• Crescem muito rápido  
• São muito estudadas 
• Proteina a verde está em fusão com a GFP 
 
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Plasmídeos em leveduras: 
 
• Sistema de seleção diferente                   não funciona assim:  
• Se o plasmídeo lá tiver (vantagem)- gene de resistência ao antibiótico (ampicilina) 
Marcador que permite selecionar as bactérias que têm um
plasmídeo 
 
 
• Marcadores de seleção em leveduras: Basta tirar um aminoácido (triptofano) e
cultiva-se num meio sem triptofano – cresce só as que tiverem plasmídeo 
 
• Colocar uma sequência de 10 mil pares de bases não funciona porque: 
Plasmídeo fica demasiado grande e instável (não funciona) 
 
• Cada fragmento de DNA nas células humanas denomina-se: cromossomas 
 Em células bacterianas: plasmídeos 
Elementos que definem um cromossoma: 
• Telómeros (extremidades protegidas) 
• Centrómeros ( cromossoma  
• segregado durante a mitose vai um para cada lado) 
 
 
Permite clonar fragmentos de DNA enormes 
 
Limitações de tamanho do fragmento de DNA: O método TOPO-TA 
 pode não ser adequado para clonar fragmentos de DNA muito grandes, 
 limitando sua aplicabilidade em certos casos. 
 
Fagos 
• Podemos usar como vetor um virus (clonagem no virus) 
• Virus filamentosos - úteis e são usados em tecnologia de produção de anticorpos  
• Colocar no genoma do virus o gene que codifica o anticorpo 
• Ponta do fago tem a proteína do anticorpo 
 
 
 
Permite isolar anticorpos com grande eficiência 
Promotor GAL1: O promotor GAL1 é ativado na presença de galactose e é inibido na
presença de glicose. Quando a leveduraé cultivada em meio contendo galactose como fonte
de carbono, o promotor GAL1 é ativado e permite a expressão do gene de interesse ligado a
ele. 
 
Investigação  
Produção industrial 
 
 
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