ficha n4

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INSTITUTO POLITÉCNICO DE BRAGANÇA 
ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA 
 
BIOTECNOLOGIA APLICADA AO MELHORAMENTO 
 2024/2025 
 
Ficha de Trabalho nº 4 
 
 
1. Uma molécula de DNA foi digerida parcialmente com duas enzimas de restrição, a 
EcoRI e a HaeIII, sendo produzidos os seguintes fragmentos, após determinada a 
sequência de cada um: 
5’AGTATG 
3’TCATACTTAA 
 
5’AGTATGAATTCCGATGCTGGCCCTGACACACAG 
3’TCATACTTAAGGCTACGACCGGGACTGTGTGTCTTAA 
 
5’AGTATGAATTCCGATGCTGG 
3’TCATACTTAAGGCTACGACC 
 
5’AATTCCGATGCTGGCCCTGACACACAGAATTCATAGAC3’ 
 GGCTACGACCGGGACTGTGTGTCTTAAGTATCTG5’ 
 
AATTCATAGAC3’ 
GTATCTG5’ 
 
CCCTGACACACAGAATTCATAGAC3’ 
GGGACTGTGTGTCTTAAGTATCTG5’ 
 
AATTCCGATGCTGGCCCTGACACACA 
 GGCTACGACCGGGACTGTGTGTTTAA 
 
1.1 Qual a sequência da molécula original? 
1.2 Suponha que o objetivo seja realizar a clonagem de um fragmento de DNA proveniente do 
corte de uma das enzimas de restrição, em um plasmídeo cortado com a mesma enzima. 
Qual das enzimas permite mais facilmente atingir o objetivo? Por quê? 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. Foi realizado uma análise com 4 marcadores de microssatélites e foram obtidos os 
seguintes resultados para 5 indivíduos (os números indicam os tamanhos de 
fragmentos amplificados em pb) 
 
 Indivíduo 1 Indivíduo 2 Indivíduo 3 Indivíduo 4 Indivíduo 5 
Alelo 
1 
Alelo 
2 
Alelo 
1 
Alelo 
2 
Alelo 
1 
Alelo 
2 
Alelo 
1 
Alelo 
2 
Alelo 
1 
Alelo 
2 
Locus 1 130 134 134 134 136 138 128 134 128 136 
Locus 2 250 256 256 260 258 260 252 260 250 258 
Locus 3 140 140 140 144 146 148 138 144 140 150 
Locus 4 187 193 185 187 183 189 185 191 181 189 
 
a) Que diferença existe entre os diferentes alelos de um mesmo locus de microssatélite? 
b) Quantos alelos têm os diferentes locos de microssatélites analisados neste estudo? 
c) Se o indivíduo 1 é a mãe do indivíduo 2, quais dos outros três indivíduos podem ser 
descartados como possíveis pais? 
 
3. A figura abaixo representa um segmento de DNA com 4.900 pares de bases (pb). As 
setas indicam sítios de restrição para duas enzimas (enzima X e enzima Y). 
 
 
3.1 Quais os fragmentos que esperaria observar após a digestão do segmento de DNA 
com a enzima X? 
3.2 Quais os fragmentos que esperaria observar após a digestão do segmento com a 
enzima Y? 
3.3 Quais os resultados que esperaria observar após a digestão do segmento de DNA 
com ambas as enzimas? 
 
4. Um fragmento de DNA é cortado com PstI e HindIII por separado. Posteriormente é 
utilizada uma mistura de ambas enzimas e foram obtidos os fragmentos indicados a 
seguir: 
PstI: 3Kb e 4Kb 
HindIII: 2Kb e 5 Kb 
PstI + HindIII: 1Kb, 2Kb e 4Kb 
Desenhe o padrão dos fragmentos esperados com cada enzima por separado e com a 
digestão das duas enzimas em gele de agarose. 
 
 
 
 
 
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5. É digerido um fragmento de DNA clonado com as enzimas de restrição HindIII e SmaI e 
com uma mistura das duas: 
 HindIII: 2,5Kb e 5Kb 
 SmaI: 2Kb e 5,5Kb 
 HindIII + SmaI: 2Kb, 2,5Kb e 3Kb 
 5.1 Desenhe o mapa de restrição apresentado em gele de agarose. 
 5.2 Quando a mistura de fragmentos produzida pela actuação das duas enzimas ao 
mesmo tempo é cortada também pela enzima EcoRI, se observa a perda do fragmento 
de 3Kb e o aparecimento de uma banda de 1,5Kb no gele de agarose. Indicar sobre o 
mapa anterior o ponto de corte de EcoRI. 
 
6. Um fragmento linear de DNA de 11Kb é cortado por separado com as enzimas de 
restrição EcoRI e HaeIII e com uma mistura de ambas são obtidos os fragmentos 
indicados a seguir. EcoRI: 6Kb, 3Kb e 2Kb; HaeIII: 7Kb e 4Kb; EcoRI+HaeIII: 5Kb, 3Kb, 
2Kb e 1Kb. 
Desenhe o mapa de restrição deste segmento de DNA. 
 
7. Um gene clonado apresenta o seguinte mapa de restrição para as enzimas EcoRI e 
HindIII 
 
 3Kb 4Kb 1Kb EcoRI 
 2Kb 4,5Kb 1,5Kb HindIII 
 
7.1 Desenhe os padrões dos fragmentos de DNA esperados com cada enzima ao 
separar os fragmentos mediante electroforese em gel de agarose. Fazer a mesma coisa 
para uma digestão dupla. 
7.2 Desenhar o padrão esperado para uma cópia mutante do gene que perdeu o 
primeiro dos cortes de EcoRI. 
7.3 Desenhar o padrão esperado para uma cópia mutante do gene na que existe um 
novo alvo para HindIII no centro do fragmento de 2Kb. 
 
8. Foi cortado com PstI um plasmídeo bacteriano circular que contem um gene de 
resistência à ampicilina. Após a electroforese observa-se uma banda de 20Kb. Explica 
os resultados apresentados a seguir: 
a) Com EcoRI, o plasmídeo é cortado em dois fragmentos: um de 11,5Kb e outro 
de 8,5 Kb. 
b) A digestão PstI + EcoRI gera três fragmentos de: 6Kb, 5,5Kb e 8,5 Kb. 
c) O DNA do plasmídeo cortado com PstI foi misturado e ligado com fragmentos 
de DNA cortados com PstI. Todos os clones recombinantes são resistentes à 
ampicilina. 
d) Após o corte de um dos clones recombinantes com PstI obtemos dois 
fragmentos: 20Kb e 6Kb. 
e) O clone anterior é cortado com EcoRI e obtemos 10Kb, 8,5Kb e 7,5Kb. 
 
 
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9. O plasmídeo pAl21 foi cortado com diferentes enzimas de restrição e foram 
observadas as seguintes bandas em gel de agarose: BamHI (3,7 Kb, 3,5 Kb), PvuII (7,2 
Kb), HindIII (7,2 Kb), BamHI+PvuII (3,5 Kb, 2,4 Kb, 1,3 Kb), PvuII+HindIII (3,6 Kb). 
Desenhe o mapa de restrição do plasmídeo. 
 
10. Após a procura de marcadores moleculares (RFLP) para uma espécie, é construída uma 
sonda complementar ao DNA genómico desta espécie na região indicada no esquema, 
e que permite diferenciar três alelos distintos (A1, A2 e A3). O DNA extraído de 
diferentes indivíduos é cortado com SacI, é realizada uma electroforese e é transferido 
o DNA posteriormente a uma membrana de nylon. Esta membrana é hibridada com a 
sonda (marcada radioactivamente) e se realiza uma auto-radiografia. 
 Sac I Sac I Sac I 
 _____________________ Alelo A1 
 2Kb 3Kb 
Sac I Sac I Sac I Sac I Sac I Sac I 
____________________ Alelo A2 _____________________ Alelo A3 
 5 Kb 2Kb 1Kb 2Kb 
SONDA 
 
Desenhar esquematicamente o resultado esperado para: Um homozigoto para A1, um 
heterozigoto A1A2, um homozigoto A2 e um heterozigoto A1A3. 
 
11. Numa população de centeio fora isolado um gene de sequência única. Foi extraído o 
ADN genómico de 10 plantas diferentes da população, é utilizada a enzima EcoRI, os 
fragmentos produzidos se separam mediante electroforese em gel de agarose e se 
transferem a uma membrana de náilon. Posteriormente, hibrida-se essa membrana 
utilizando como sonda radioactiva o gene de sequência única de centeio clonado num 
vector bacteriano. Por último, é realizada uma autorradiografia e são obtidos os 
resultados indicados no esquema: 
 
Explique os resultados obtidos 
 
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12. Considere uma árvore com frutos (M) e outras cinco que produziram flores e são 
apenas doadoras de pólen (DP1, DP2, DP3, DP4 e DP5). Foi excluída a capacidade de 
autopolinização das árvores. Os genótipos da árvore com frutos, da semente (S1) e das 
prováveis fontes de pólen foram obtidos pela análise de dois loci (locus A e locus B) de 
marcadores de DNA, conforme a figura. 
 
 
A progénie S1 recebeu o pólen de qual doadora? 
 
13. A figura abaixo mostra padrões hipotéticos de gel de eletroforese para três locos de 
DNA microssatélite (uSAT-1, uSAT-2, uSAT-3) em uma população isolada de leopardos. 
Cada banda representa um alelo diferente, que difere dos outros no número de 
repetições nucleotídicas. O número de repetições está apresentado no lado direito da 
figura. 
Indivíduos com duas bandas são heterozigotos e aqueles com apenas uma 
banda são homozigotos. Com essas informações é possível inferir quem é o pai decada um dos cinco filhotes (P1 a P5) nascidos das fêmeas (F1 a F5); por exemplo: P2 é 
filho da fêmea F2. Há somente 10 machos adultos nesta população (M1 a M10). 
 
13.1 Antes de determinar a paternidade dos filhotes, indique o genótipo de cada 
indivíduo na análise. Identifique os alelos com base no número de repetições que eles 
possuem. 
 
13.2 Faça uma análise de exclusão de paternidade para cada um dos cinco filhotes. 
Esta análise é feita eliminando pais potenciais com base nas incompatibilidades 
genotípicas. Por exemplo, o macho M1 não pode ser o pai de P1 com base em seus 
genótipos no loco uSAT-1. A mãe de P1 (fêmea F1) é homozigótica 10/10 no loco uSAT-
1 e, portanto, deve ter transmitido este alelo para o filho P1. Dado que P1 é 
heterozigoto 10/8, seu alelo 8 foi transmitido pelo seu pai. Como o macho M1 não é 
portador do alelo 8 ele não pode ser o pai de P1. 
Se todos os machos, com exceção de um deles, podem ser excluídos por esta 
análise, macho restante é inferido como pai. 
Indique o possível pai para cada filhote. 
 
13.3 Nem sempre um macho inferido como pai de um indivíduo na análise de exclusão 
será verdadeiramente o pai. Discuta os motivos dessa afirmação e proponha um 
procedimento para diminuir a possibilidade desse erro metodológico. 
 
 
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