Bioinformática: Desenho Experimental

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Bioinformática
Aula 4: Pesquisa, material genético e a Bioinformática
Apresentação
Nas aulas anteriores, aprendemos que a Bioinformática é uma área de estudo que mistura a Biologia, a Matemática e as
ferramentas computacionais para analisar as biomoléculas relacionadas com a expressão gênica: DNA, RNA e proteínas.
Este campo de estudo é extremamente importante para o desenvolvimento de novos biomarcadores, descobertas de
novas drogas e outras aplicações na área da Saúde.
Agora, você deve estar se perguntando: E então? Como eu posso iniciar um trabalho na área de Bioinformática? Podemos
dizer que iniciar uma pesquisa em Bioinformática não é uma tarefa fácil, pois envolve muitas etapas, começando pelo
desenvolvimento do desenho experimental e �nalizando com as análises dos resultados obtidos.
Nesta aula, aprenderemos como desenvolver um bom desenho experimental para os estudos em Bioinformática e
também sobre as etapas que antecedem as aplicações das técnicas de Biologia Molecular e análises de Bioinformática:
Transporte, armazenamento e extração de ácidos nucleicos da amostra de estudo. Vamos lá?
Objetivos
Esclarecer os critérios básicos na elaboração de um desenho experimental;
Distinguir transporte e armazenamento de amostras para extração de ácidos nucleicos;
Explicar as importantes etapas da extração e quanti�cação de ácidos nucleicos.
Pesquisa cientí�ca experimental em Bioinformática
Todos os avanços que observamos até hoje nas áreas da Saúde, economia, ambiental, transportes, assim como em
outras áreas, são frutos de pesquisas cientí�cas.
 Atendimento psicológico | Fonte: BlurryMe / Shutterstock
A pesquisa cientí�ca é a forma universal de se obter novos conhecimentos
que são baseados em fatos e não no senso comum. Ela pode ser conduzida
de formas diferentes dependendo do seu objetivo e contexto.
Exemplo
Uma pesquisa cientí�ca pode ser realizada, por exemplo, a partir de buscas teóricas realizadas em livros, artigos, revistas ou pode
ser mais laboriosa, necessitando de laboratórios equipados para ser realizada.
Atenção! Aqui existe uma videoaula, acesso pelo conteúdo online
Pesquisa cientí�ca na área de Bioinformática
Para se iniciar uma pesquisa cientí�ca na área de Bioinformática, o primeiro passo a se pensar é no desenho experimental para
produzir resultados con�áveis.
Mas o que vem a ser desenho experimental?
O desenho experimental seria uma espécie de roteiro que é seguido pelo pesquisador para conduzir a pesquisa de acordo com
o objetivo da mesma, com o intuito de obter resultados estatisticamente con�áveis.
Na área da Bioinformática, as pesquisas cientí�cas são
classi�cadas como experimentais, ou seja, são pesquisas
que têm como �nalidade testar hipóteses de causa e efeito
estabelecidas pelo pesquisador e, para isso, é necessário
selecionar a população, controles e as variáveis que serão
manipuladas.
 Por joker1991 (Fonte: Shutterstock).
Achou confuso? Vamos a um exemplo.
Exemplo
Um estudo cientí�co realizado na África, região endêmica para malária , mostrou que uma determinada população com anemia
falciforme não adquiria malária. Neste exemplo, existe uma relação causal entre os eventos: Ausência de malária e presença de
anemia falciforme. A ausência de malária seria o efeito enquanto a possível causa seria a presença de anemia falciforme.
Desenho de uma pesquisa experimental
Vamos, agora, pensar em alguns passos do desenho de uma pesquisa experimental que devem ser seguidos de acordo com a
sua ordem de execução:
1
Estabelecer uma idéia de relação
causa-efeito.
2
Estanbelecer hipóteses que serão
testadas.
3
Determinar a população e as variáveis
que serão manipuladas.
4
Executar o experimento e observar os
resultados.
5
Formular aas conclusões sobre a
hipótese estabelecida.
Você deve agora estar se questionando sobre todos esses passos. Calma, explicaremos cada um deles!
Estabelecendo uma ideia de relação causa-efeito
Para iniciarmos o desenho de uma pesquisa experimental em Bioinformática, é necessário mais do que estabelecer a relação
de causa-efeito entre eventos.
https://estacio.webaula.com.br/cursos/go0270/aula4.html
 Brian A Jackson (Fonte: Shutterstock).
Trabalhando com hipóteses
Nos estudos experimentais, geralmente temos duas hipóteses, a nula e a alternativa.
O objetivo de um experimento é achar evidências que possibilitem aceitar a hipótese alternativa e recusar a hipótese nula.
Hipótese nula
É de�nida como aquela que declara que
não existe uma relação de causa-efeito no
experimento. 
Hipótese alternativa
É de�nida como aquela que declara que
existe uma causa-efeito no experimento.
Agora que você já sabe a diferença dos dois tipos de hipótese, se
fôssemos nos basear no estudo da anemia falciforme x malária, qual
seria a hipótese nula e a alternativa?
Se você pensou que a hipótese alternativa seria “a presença de anemia falciforme protege contra a malária” e a hipótese nula
seria “a presença de anemia falciforme não protege contra a malária”, você acertou!
Se você conseguiu formular corretamente as duas hipóteses, é porque você conseguiu visualizar a importância de pensar nas
duas possibilidades como o desfecho do estudo.
De�nindo a população de estudo e as variáveis manipuladas
Uma vez que nós temos as hipóteses estabelecidas, o próximo passo é de�nirmos a nossa população de estudo.
A seleção da população de estudo é a etapa crucial para a garantia dos resultados con�áveis. Existem várias maneiras
diferentes de selecionar a população que será estudada, já que não raro é necessário fazer uma amostragem da população, ou
seja, selecionar alguns participantes pela impossibilidade de recrutar todos.
Independentemente da maneira pela qual a seleção é feita, o mais importante é que a amostragem seja representativa da
população que será estudada.
Seguindo a hipótese nula e alternativa elaborada no caso do estudo
da anemia falciforme x malária, qual é a nossa população de estudo?
Se você respondeu pessoas com anemia falciforme, você acertou em parte.
 Por Kateryna Kon (Fonte: Shutterstock).
Para provarmos a hipótese alternativa, nós precisamos
veri�car a ausência de malária em pessoas com anemia
falciforme e a presença de malária em pessoas sem
anemia falciforme.
Além disso, precisamos veri�car se existem pessoas com
anemia falciforme e com malária além de pessoas sem
anemia falciforme e sem malária (saudáveis embora
expostos). Entendeu agora quem é a nossa população?
Outra etapa importante atrelada aos estudos experimentais em Bioinformática é pensar nas variáveis do estudo. Existem
basicamente dois tipos de variáveis: Independentes e dependentes.
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As variáveis independentes são aquelas que in�uenciam ou afetam outras variáveis. Desta forma, este tipo de variável é
utilizado pelo pesquisador para avaliar a causa da presença ou não do efeito.
Variáveis independentes 
As variáveis dependentes são aquelas que são in�uenciadas pelas independentes. Assim, este tipo de variável pode
aumentar, diminuir, aparecer ou desaparecer, de acordo com o estímulo da variável independente.
Variáveis dependentes 
Exemplo
Voltando ao exemplo da anemia falciforme e da malária, estudos mostram que a presença de mutação na cadeia da
hemoglobina causa a anemia falciforme que está presente em indivíduos sem malária. Neste exemplo, uma variável
independente pode ser a mutação e a dependente seria a malária. Entendeu?
Executando o experimento e observando os resultados
Após identi�car uma situação-problema, estabelecer a hipótese, identi�car as variáveis de estudos e selecionar a população, a
pesquisa cientí�ca experimental começará de vez.
 Lucas Vasques (Fonte: Unsplash).
Uma vez que todos os critérios apresentados acima foram bem de�nidos, a pesquisa em Bioinformática pode ser conduzida no
intuito de gerar bons resultados contribuindo para o desenvolvimento de inovações na área da Saúde.
Formulando as conclusões sobre a hipótese estabelecida
Após a obtenção dos resultados,ainda pode ser necessário
validá-los de forma estatística com o intuito de fortalecer os
resultados encontrados.
Só assim o trabalho cientí�co, que inclui também o trabalho
em Bioinformática, vai apresentar a robustez necessária e
con�abilidade.
 Trust "Tru" Katsande (Fonte: Unsplash).
Transporte e armazenamento de amostras destinadas à extração
de ácidos nucleicos
 Monika Wisniewska (Fonte: Shutterstock).
Quando uma pesquisa experimental em Bioinformática é
iniciada, é necessário ter em mente que a população
recrutada irá prover a molécula-alvo do estudo a partir da
coleta de espécimes clínicos.
Nas pesquisas de Bioinformática nas quais os alvos são
moléculas de ácidos nucleicos, diferentes espécimes
clínicos podem ser utilizados. A escolha dependerá do
objetivo da pesquisa.
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Se o objetivo é avaliar a presença de
mutações especí�cas no DNA de células
de tumor hepático, é necessário fazer a
coleta de uma amostra de tecido do tumor,
e não coletar uma amostra do sangue do
paciente. Como a amostra foi coletada, o
transporte e o armazenamento da mesma
devem ser realizados com certos cuidados,
a �m de garantir a qualidade do material
que será utilizado. 
Quando o objetivo é avaliar o RNA,
cuidados extras devem ser tomados, pois
esta molécula é instável e facilmente é
degradada. Assim, são realizados cuidados
especiais já na coleta, como o uso de
estabilizadores.Os estabilizadores
protegem o RNA da ação das RNase,
dando mais estabilidade à amostra,
eliminando a necessidade de processá-la
imediatamente ou congelá-la.
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Os espécimes clínicos que podem ser utilizados como fonte de ácidos nucleicos são muitos. Por exemplo: Sangue aspirado de
medula, tecido, células bucais, urina, líquor, fezes e outros.
Vamos falar como transportar e armazenar alguns desses espécimes para garantir a integridade do ácido nucleico que será
posteriormente extraído.
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As amostras de sangue coletadas podem ser centrifugadas para a obtenção do soro ou plasma. Esses espécimes podem
ser armazenados em geladeira (2-8ºC) por até oito dias ou podem ser congelados por bastante tempo.
 
Para obtenção tanto do RNA quanto do DNA, a amostra deve ser mantida congelada a -20ºC. O sangue total é estável à
temperatura ambiente por até 24h para obtenção do DNA, e para a extração do RNA, ele deve ser mantido a -20ºC. As
amostras de sangue total, soro ou plasma que serão destinadas à extração de ácidos nucleicos devem ser transportadas
congeladas em caixas isotérmicas com gelo seco, evitando o ciclo de descongelamento.
Amostras de sangue 
A obtenção do aspirado de medula deve ser feita com agulha especí�ca com o EDTA. Quando a amostra for destinada à
extração de RNA, ela deve ser imergida imediatamente em solução estabilizadora e armazenada a -70ºC, se a extração
não for realizada o mais breve possível.
 
Para a extração de DNA, o aspirado de medula pode ser armazenado em geladeira por até 72h. Caso o processamento
ocorra posteriormente, é recomendado armazenar a amostra no freezer a -20ºC. O transporte de aspirado de medula deve
ser realizado com gelo triturado, se a amostra estiver descongelada ou em gelo seco, se a amostra estiver congelada.
Aspirado de medula 
As amostras de tecidos são geralmente utilizadas para extração de ácidos nucleicos em situações pontuais quando há
necessidade especi�camente de um tipo de genótipo celular.
 
A coleta é invasiva e conhecida como biópsia. Este procedimento deve ser realizado por médico capacitado. Para a
obtenção do DNA, o material coletado deve ser imediatamente resfriado após a coleta. O transporte pode ser efetuado em
caixa isotérmica com gelo triturado e o armazenamento pode ser feito em geladeira por até 24h, no freezer a -20ºC, por
até 14 dias ou no freezer a -70ºC, por até dois meses.
 
Para a obtenção do RNA, as amostras de tecidos devem ser imergidas imediatamente em solução estabilizadora,
podendo, assim, ser transportadas resfriadas em gelo triturado. O armazenamento deve ser feito em baixas temperaturas,
com intuito de diminuir ou paralisar o metabolismo celular, já que o RNA é muito instável. Desta forma, as amostras
podem ser mantidas em freezer a -70ºC ou por tempos maiores, em nitrogênio líquido (-196,1ºC).
Amostras de tecidos 
As células bucais são excelentes fontes de DNA e RNA e o procedimento de coleta empregado nesse caso não é invasivo.
A obtenção das células bucais pode ser realizada por meio da raspagem ou swab e também por meio de bochecho. É
importante que, para obtenção do RNA, a amostra seja misturada após a coleta com a solução estabilizadora. As
amostras de células bucais podem ser transportadas em temperatura ambiente e apresentam estabilidade nesta
temperatura por até uma semana.
Células bucais 
Extração de ácidos nucleicos
Até então, aprendemos sobre os primeiros passos de como começar
uma pesquisa em Bioinformática. A partir de agora, falaremos sobre
como obter os ácidos nucleicos a partir das amostras coletadas da
população de estudo.
Extrair os ácidos nucleicos é um processo primordial, uma vez que eles são as moléculas-alvos que serão analisadas no estudo
de Bioinformática.
Imunidade humoral
A extração de ácidos nucleicos nada mais é do que um processo de separação destes de todos os outros
componentes celulares. Esses procedimentos têm como objetivo remover impurezas e substâncias inibidoras da
amostra para que se obtenha sucesso na realização das técnicas moleculares que precedem as análises da
Bioinformática.
 Atendimento psicológico | Fonte: BlurryMe / Shutterstock
Para que ocorra a extração, é necessário utilizar reagentes químicos com propriedades que bene�ciem essa separação
combinados com o processo de centrifugação.
Existem diferentes protocolos de extração de ácidos nucleicos, utilizando reagentes diversos. Alguns procedimentos podem ser
realizados de forma manual e outros automatizados. Entre os protocolos mais conhecidos, estão os protocolos à base de
fenol-clorofórmio, isotiocianato de guanidina ou sílica. Independentemente do protocolo, o processo de extração pode ser
dividido basicamente em três etapas:
1
Lise das membranas lipídicas.
2
Precipitação das proteínas.
 
3
Precipitação do DNA.
 
 Extração com base no fenol-clorofórmio
 Clique no botão acima.
Extração com base no fenol-clorofórmio
Agora, focaremos em um protocolo de extração que utiliza como base o fenol-clorofórmio!
Como você deve lembrar, os ácidos nucleicos (DNA e RNA) estão dentro do núcleo celular. Desta forma, para acessar
essas moléculas, é necessário o rompimento da membrana plasmática celular e da membrana nuclear. O rompimento
e a retirada dos lipídios das membranas são realizados na primeira etapa da extração pela ação de substâncias
detergentes como brometo de cetiltrimetilamômio (CTAB).
A centrifugação, nesta etapa, também é muito importante, pois após este processo, os debris lipídicos são removidos.
Na fase de lise, o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) também é utilizado. Este ácido é um agente quelante de íons
bivalentes que funcionam como cofator de DNases. Desta forma, elas são inibidas.
Após a liberação do ácido nucleico, a molécula deverá ser separada dos demais componentes contaminantes da
amostra: As proteínas. Para efetuar a retirada e inativação das proteínas, é necessário o tratamento da amostra com
uma série de substâncias como: Fenol-clorofórmio ou trizol (desnaturam proteínas), proteinase K (inativa nucleases),
NaCl (rompem as ligações iônicas da cadeia proteica) e outras.
O fenol-clorofórmio exerce o papel mais importante desta etapa, pois, além de promover a desnaturação das proteínas
contaminantes, ele também atua na separação dos componentes em duas fases após a centrifugação: Fase fenólica
(onde estão as proteínas) e a fase aquosa (onde está o DNA ou RNA).
Para �nalizar a extração, o DNA ou RNA pode ser precipitado após aadição de etanol à mistura. O etanol promove
alteração transitória na estrutura dos ácidos nucleicos levando a sua agregação e precipitação. Ao �nal do processo, o
ácido nucleico poderá ser solubilizado em água e armazenado em freezer ou geladeira para análises futuras (�gura 1).
Esquematização da extração de ácidos nucleicos
(Fonte: biomedicinaonline).
Quanti�cação e veri�cação da qualidade do material extraído
Terminado o processo de extração de ácidos nucleicos, você deve estar pensando: Agora, sim, vamos começar a utilizar as
ferramentas de Bioinformática! E eu te digo que ainda não!
Antes de analisarmos o nosso ácido nucleico, precisamos veri�car a quantidade e a qualidade desse material extraído.
A análise de quantidade e qualidade do material extraído é uma etapa essencial para a garantia dos resultados do nosso
estudo. É preciso checar se o nosso processo de extração funcionou, ou seja, se eu tenho apenas o meu ácido nucleico
naquela amostra, e se eu tenho uma quantidade de material su�ciente para iniciar um método de Biologia Molecular.
O conhecimento da quantidade e da qualidade de ácido nucleico extraído é essencial para:
1
Veri�car se houve ou não degradação da amostra durante o
processo.
 
2
Evitar o excesso de ácido nucleico aplicado na PCR (ou outra
técnica de Biologia Molecular), o que di�culta a análise do
resultado.
3
Minimizar resultados falso-negativos pela baixa concentração
de DNA/RNA na reação.
 
Basicamente, existem três metodologias que podem ser utilizadas nestas análises: Eletroforese, espectrofotometria e
�uorimetria. Vamos falar de cada uma delas a seguir.
Eletroforese
Dentre as técnicas descritas anteriormente, a eletroforese é a mais simples e barata para ser executada, mas também é a que
produz os resultados menos precisos.
A técnica da eletroforese consiste na migração da molécula de ácido nucleico sobre a in�uência de um campo elétrico, ou seja,
diferença de potencial (polo positivo e polo negativo).
O DNA/RNA são moléculas com carga negativa devido à presença do grupamento
fosfato (PO4-). Assim, eles migram do polo negativo em direção ao polo positivo. Essa
migração acontece sobre uma matriz gelatinosa que permite a passagem das
moléculas.
Geralmente, a matriz é um gel formado de poliacrilamida ou agarose. Durante a
preparação do gel, um composto químico chamado brometo de etídio é adicionado
como corante pela sua capacidade de se ligar ao DNA/RNA e emitir �uorescência
quando é excitado com luz ultravioleta.
 Photo by National Cancer Institute (Fonte: Unsplash)
Durante a corrida da eletroforese, as moléculas de ácidos nucleicos, além da in�uência do campo elétrico, migram de acordo
com o seu peso molecular, ou seja, moléculas maiores (mais pesadas) migram de forma mais lenta pelo gel do que moléculas
menores (mais leves). Dessa forma, é formado um padrão bandas, de acordo com o peso das moléculas corridas.
 Componente da eletrofose (Fonte: canal.cecierj).
A eletroforese, além de revelar a presença da molécula, permite separar
diferentes moléculas de ácido nucleico e quanti�car pelo escaneamento da
banda por densitometria.
O padrão da banda é analisado por um densitômetro que mede a transmitância e, assim, a partir do uso de fórmulas
matemáticas, é possível chegar à concentração aproximada de ácidos nucleicos na amostra. A desvantagem da eletroforese
em relação às outras técnicas é que a quanti�cação é imprecisa, pois não é avaliada a presença de moléculas contaminantes
na amostra.
Espectrofotometria
A espectrofotometria é uma metodologia ótica realizada em um instrumento chamado espectrofotômetro, no qual a
quanti�cação das moléculas se baseia na quanti�cação da luz absorvida (absorbância) por ela.
 Por extender_01 (Fonte: Shutterstock).
Toda substância, ao receber uma quantidade de luz, é capaz de absorvê-la. Isso produz excitação nos elétrons, que passam
para níveis energéticos mais altos. Cada molécula necessita de uma quantidade especí�ca de energia para promover a
excitação. No caso do DNA/RNA, essa energia obtida no comprimento de onda é 260nm. Quanto maior for a quantidade de
DNA e RNA presente na amostra, maior será o valor de absorbância lida pelo aparelho. Logo, a absorbância é proporcional à
concentração da molécula lida.
Atenção
Para fazer a correlação entre absorbância e mg de ácido nucleico, utiliza-se a seguinte proporção: O valor 1 de absorbância
corresponde a 50mg de DNA �ta dupla e 32,7mg de RNA �ta simples.
Para avaliar a qualidade do material, ou seja, veri�car a presença de moléculas contaminantes, a amostra pode ser lida no
comprimento de onda de 280nm, pois é nesta faixa que as ligações peptídicas das proteínas se excitam.
Assim, a pureza da amostra de ácidos nucleicos extraídos pode ser realizada com as leituras em 260 e 280nm, analisando-se a
relação 260/280. Se o resultado obtido estiver entre a faixa de 1,8 a 2,0, a amostra se encontra em boas condições para o uso,
diferente do que ocorre em faixas menores do que 1,6, onde será necessário repetir o processo de extração.
A espectrofotometria também é uma metodologia
imprecisa, pois ela não indica se a amostra contém
somente DNA ou RNA, ou ambos, nem nos dá informação
sobre integridade.
Para se obter uma informação mais robusta quanto à
quantidade e qualidade do material extraído, a técnica de
eleição seria a �uorimetria, embora a mesma apresente
altos custos.
 Por rebusy (Fonte: Shutterstock).
Fluorimetria
A �uorimetria é uma técnica de espectroscopia eletromagnética que analisa a luz emitida pelas moléculas �uorogênicas.
 Por Fluke Cha (Fonte: Shutterstock).
O DNA e RNA são ligados ao corante �uorescente. Ao serem
excitados pela absorção de luz, eles emitem luminosidade
�uorescente proporcional à concentração da amostra lida. O
interessante da �uorimetria é que você pode utilizar
corantes diferentes para cada molécula, o que permite
distingui-las dentro de uma mesma amostra. Esta
metodologia também é indicada para amostras com
concentração muito baixa de DNA ou RNA que não
conseguem ser analisadas por espectrofotometria.
Atividade
1. Nesta aula, nós aprendemos a importância do desenho experimental para a pesquisa em Bioinformática. Baseando-se nos
conhecimentos adquiridos, descreva os critérios básicos que devem ser avaliados para a confecção de um desenho experimento.
2. João coletou uma amostra de tecidos proveniente de uma biópsia de um câncer de tireoide que será usado em um estudo de
biologia molecular. Marque a alternativa correta sobre qual seria o local e a temperatura mais apropriada para João fazer o
armazenamento deste espécime clínico.
a) Geladeira (2º a 8ºC)
b) Freezer ( -10ºC)
c) Freezer (-70ºC)
d) Freezer (-20ºC)
e) Nitrogênio líquido (-196ºC)
3. A detecção da qualidade e da quantidade do DNA extraído de uma amostra são informações importantes de serem obtidas
antes da etapa experimental, para evitar a produção de resultados não con�áveis. Sabendo da importância desse procedimento,
explique as diferenças entre a espectrofotometria e a �uorimetria.
Notas
Malária
A malária é uma doença causada pelo parasita do gênero Plasmodium.
Referências
GRESSLER, Lori Alice. Introdução à pesquisa: Projetos e Relatório Gressler. São Paulo: Edições Loyola, 2004.
MELO et al. Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico molecular. 2010. In: J Bras Patol Med Lab,
46(5), p. 375-381. Disponível em: //www.scielo.br/pdf/jbpml/v46n5/06.pdf. Acesso em: 10 jan. 2020.
MOLINARO, Etelcia Moraes; CAPUTO, Luzia Fátima Gonçalves; AMENDOEIRA, Maria Regina Reis. Conceitos e métodos para
formação de pro�ssionais em laboratório de saúde: Volume 3. Rio de Janeiro: EPSJV: IOC, 2013. Disponível em:
//www.epsjv.�ocruz.br/sites/default/�les/l227.pdf.Acesso em: 10 jan.
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Desenhos de pesquisa //www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010286502005000800002.
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https://tools.thermo�sher.com/content/sfs/manuals/7020M.pdf.
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Quanti�cação de amostras de DNA e RNA https://www.jove.com/video/2565/nanodrop-quanti�cao-microvolume-de-
cidos-nuclicos?language=Portuguese.
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