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Isolamento de ácidos nucleicos
O isolamento de ácidos nucleicos é fundamental na qualidade das amostras utilizadas em métodos
moleculares. Esse processo segue etapas que vão desde o desenho experimental até a extração e
quantificação dos ácidos nucleicos. A padronização e o cuidado em cada fase ajudam a obter dados que
sejam, de fato, confiáveis. Portanto, compreender esse fluxo é o primeiro passo rumo ao sucesso
experimental.
Prof. Eldio dos Santos
1. Itens iniciais
Objetivos
Descrever o desenho experimental e as fases pré-analíticas do isolamento dos ácidos nucleicos.
 
Descrever os procedimentos de extração e quantificação do DNA e RNA, e síntese do cDNA.
Introdução
A biologia molecular estuda as moléculas primordiais para a manutenção da vida, como o DNA, o RNA e as
proteínas. De acordo com o princípio geral da biologia:
 
O DNA armazena a informação genética.
 
O RNA transporta a informação genética.
 
As proteínas desempenham funções celulares vitais.
 
Os avanços tanto na área médica quanto nas ciências animais e vegetais foram impulsionados pelo
desenvolvimento de técnicas moleculares, que estudam o DNA e o RNA com cada vez mais precisão. 
 
Antes de analisarmos o material genético, é necessário um planejamento criterioso, que seja capaz de obter a
qualidade e a confiabilidade dos resultados. Cada etapa do processo, desde a coleta e armazenamento das
amostras até a extração e quantificação do DNA e RNA, deve ser conduzida de forma padronizada para evitar
erros que comprometam a integridade do material.
 
Garantir um material genético puro e íntegro é requisito para que técnicas moleculares, como a síntese de
cDNA, sejam bem sucedidas. A organização dessas etapas, além de melhorar a reprodutibilidade dos
experimentos, também influencia diretamente a precisão das análises realizadas em pesquisas e diagnósticos.
 
Mas, você saberia descrever como esse processo acontece? O DNA e o RNA são extraídos da mesma forma?
E qual a importância do cDNA?
 
Neste conteúdo, vamos explorar todas essas questões. Começaremos pelo desenho experimental,
entendendo sua aplicabilidade, etapas e importância na pesquisa científica. Em seguida, veremos as fases
pré-analíticas, os métodos de extração, a quantificação e a avaliação da qualidade do material genético. 
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1. Introdução ao isolamento dos ácidos nucleicos
Desenho experimental
Neste vídeo, vamos explicar o método científico e o desenho experimental, abordando etapas como hipótese,
experimento, análise e conclusão, além da importância da reprodutibilidade, variáveis e relação causa-efeito
nos estudos. Não perca!
Conteúdo interativo
Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.
O desenho experimental é o planejamento estruturado de um estudo, composto por etapas que focam a
organização e a validade dos resultados. Assim, ele faz parte do método científico, uma das ferramentas mais
importantes para o avanço tecnológico da humanidade e muda até mesmo a forma que pensamos nas coisas
do cotidiano. 
 
Veja agora a aplicação deste método em um exemplo de atividade do cotidiano.
Leonardo tem o
hábito de assistir
ao telejornal todos
os dias. Enquanto
assistia ao
programa, viu que o
prefeito da sua
cidade participou
de uma pequena
entrevista e fez
algumas afirmações
sobre o
funcionamento da
prefeitura naquele
trimestre.
 Primeiro,
Leonardo
deve parar,
pensar sobre
tal afirmação
e aplicar o
método
científico. Ele
deve observar
o que foi
falado e 
questionar:
será que é
verdade o que
o prefeito
falou?
 Em seguida, ele
estabelecerá 
hipóteses:
 É verdade
que tal
coisa
aconteceu.
 
É mentira
que tal
coisa
aconteceu.
 A próxima etapa é
realizar um 
experimento, que
nesse caso é a
busca de fontes
confiáveis de notícia
para identificar se o
que o político falou
é verdade ou não, 
analisar o discurso
e, finalmente, poder
tirar a sua
conclusão baseado
no método
científico.
 Após a
análise, ele
pode validar
a hipótese “é
verdade” ou
“é mentira”
ao invés de
simplesmente
aceitar a
afirmação
dita.
Etapas do método científico.
O método científico foi utilizado para produzir quase tudo que existe, indo do aparelho em que você está
lendo este texto até a cadeira em que está sentado(a). Mas ele não está presente apenas nos laboratórios ou
na ciência de ponta - sem perceber, aplicamos esse método em diversas situações do dia a dia.
 
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O método científico, basicamente, é constituído pelas seguintes etapas: observação, questionamento,
hipótese, experimento, análise dos resultados e conclusão. Vamos pensar no seguinte exemplo: imagine que
você sinta um cheiro estranho vindo da geladeira. Mesmo sem perceber, você está iniciando um processo
semelhante ao método científico para descobrir a origem desse cheiro. 
 
A seguir, vamos analisar como cada etapa se aplica a essa situação.
Observação
Você abre a geladeira e percebe um cheiro ruim. Algo não está certo.
Questionamento
Você se pergunta: de onde vem esse cheiro? Será que algum alimento estragou?
Formulação da hipótese
Com base na sua experiência, você levanta uma possível explicação: a causa pode ser o leite vencido.
Experimentação
Para testar sua hipótese, você pega a caixa de leite e verifica a validade. Além disso, abre a
embalagem e sente o cheiro.
Análise dos resultados
O leite tem um odor azedo e está com uma textura diferente. Essas evidências indicam que ele
realmente estragou.
Conclusão
Você confirma então sua hipótese e decide descartar o leite. Se, por outro lado, o leite estiver em
bom estado, você reconsidera e busca outra explicação para o cheiro ruim, como um queijo mofado
ou uma fruta estragada, por exemplo.
Agora que já entendemos o método científico, podemos falar sobre desenho experimental. Ele representa a
aplicação prática desse método, organizando as etapas necessárias para testar uma hipótese. Seu principal
objetivo é ter certeza que os resultados obtidos sejam confiáveis e reprodutíveis. Desse modo, outros
pesquisadores poderão replicar o estudo e chegar às mesmas conclusões. 
 
A reprodutibilidade é um dos pontos mais importantes da ciência!
Suponha que sua equipe do laboratório desenvolveu uma nova
técnica de quantificação de DNA. Você deverá escrever sua
metodologia passo a passo, com detalhes dos tipos de solventes
necessários, as concentrações, a pressão, a temperatura de
incubação etc. Os dados devem ser claros para que, quando
outra pessoa ler essa metodologia (por exemplo, alguém do outro
lado do mundo, cinco anos depois), ela consiga chegar no mesmo
resultado, considerando que todas as condições e manipulação
foram realizadas conforme o descrito.
 Veja agora as
etapas do
desenho
experimental.
Definir a relação causa-efeito
Estabelecer o problema existente, os objetivos do trabalho e as metas a serem cumpridas.
Planejamento
Com o projeto estabelecido, definir a metodologia, preparar a instrumentação e antecipar possíveis
problemas para obter a precisão e reprodutibilidade dos resultados. 
Execução
Realizar as medições e técnicas planejadas.
Análise e interpretação
Após a execução, analisar os dados coletados de forma criteriosa e científica.
Formular as conclusões
A partir da análise e interpretação dos resultados, deve-se concluir se a relação causa-efeito se
mostrou existente e responder aos objetivos do trabalho definidos na primeira etapa, fechando dessa
forma o ciclo do desenho experimental.
A partir do desenho experimental, pretendemos dizer que modo ou por que o fenômeno é produzido. Assim, a
partir da ideia de relação de causa-efeito em que se acredita que existe uma relação entre a construção da
causa e o efeito observado, formulamos as hipóteses a serem testadas, temos os vários tratamentos
(variáveis independentes), executamos o experimento e observamos os resultados (variáveis dependentes).
Se o experimento for bem elaborado e planejado, podemos formular conclusões a respeito da relação de
causa-efeito para a hipótese estabelecida.
Atividade 1
O planejamento experimental é fundamental para que um estudopoliacetato de celulose e
géis de agarose, que apresentam poros por onde as moléculas devem passar.
Comentário
As moléculas apresentam diferentes cargas no nosso organismo. O DNA/RNA, devido ao grupamento
fosfato, apresenta carga negativa. Além disso, as moléculas são separadas pelo tamanho. 
Uma pequena quantidade de amostra é aplicada em um gel, geralmente a agarose, inerte (que não reage com
a amostra) em um poço (local de aplicação da amostra). Em seguida, é gerado um campo elétrico onde um
polo do gel fica com a carga negativa (local onde a amostra é aplicada) e outra positiva. Como o DNA/RNA
possui carga negativa, migrará para o polo positivo através do gel. No entanto, esse gel apresenta poros,
conferindo resistência ao movimento das moléculas. Assim, moléculas mais pesadas e maiores ficarão presas
no gel, enquanto as menores e mais leves migram com mais facilidade no gel.
Esquema da eletroforese para DNA.
Após a eletroforese, podemos detectar o DNA/RNA pela coloração (normalmente é utilizado o brometo de
etídio, um corante que intercala no DNA) e visualização de bandas de DNA em um equipamento chamado
transiluminador. Se a amostra estiver íntegra, verificamos apenas uma marca (banda) intensa no gel de
eletroforese. No entanto, caso a nossa amostra esteja fragmentada, essa banda se apresenta “espalhada”
(arraste) ao longo do comprimento do gel, indicando que existem fragmentos, ou seja, o DNA/RNA não está
íntegro.
Bandas bem definidas Bandas com arraste
Síntese de cDNA
Conforme já estudamos, existem várias técnicas na biologia molecular, PCR, sequenciamento, clonagem e
hibridização que são dependentes da matéria-prima (DNA, na maioria dos casos). Essas técnicas podem ser
utilizadas para diferentes fins, mas nem sempre a simples extração de DNA/RNA é suficiente para analisar o
que se deseja.
 
Por exemplo, imagine que queremos analisar a produção de uma proteína específica em um tecido. Se
extraímos apenas o DNA, teremos acesso à sequência completa dos genes da célula, incluindo aquele
responsável pela proteína que estamos investigando. No entanto, o simples fato de um gene estar presente no
DNA não significa que ele está sendo utilizado. Isso porque, para que uma proteína seja produzida, primeiro o
gene precisa ser transcrito em RNA mensageiro (RNAm) e, depois, traduzido na proteína correspondente.
Nesse caso,
estudar apenas o
DNA não nos
diria se o gene
foi ativado, se o
RNAm foi gerado
corretamente ou
se passou por
modificações,
como o splicing
alternativo, que
pode alterar a
proteína final. O
ideal, então,
seria analisar
diretamente o
RNAm da célula,
pois ele reflete
quais genes
estão ativos e
regulando a
produção de
proteínas
naquele
momento.
 Outro exemplo
envolve a
detecção de
vírus de RNA,
como o SARS-
CoV-2,
causador da
covid-19.
Quando
buscamos
identificar uma
infecção viral, o
material
genético do
vírus extraído
da amostra
biológica é o
RNA. O
problema é que
a técnica mais
utilizada para
essa detecção,
o PCR, amplifica
apenas DNA. E
como podemos
resolver isso?
 A resposta para esse
problema surgiu a
partir do estudo do
HIV, o vírus da
imunodeficiência
humana. Esse vírus
contém RNA como
material genético,
mas tem um
mecanismo especial
para se multiplicar
dentro das células.
Quando o HIV invade
uma célula, ele utiliza
uma enzima chamada
transcriptase reversa
para converter seu
RNA em DNA. Esse
DNA viral é então
integrado ao DNA da
célula hospedeira,
permitindo que o vírus
controle a célula e se
replique.
 Os cientistas
perceberam
que essa
enzima poderia
ser usada em
laboratório
para converter
qualquer RNA
em DNA.
Assim, surgiu a
técnica de
síntese de 
cDNA (DNA
complementar),
que estuda
informações
originalmente
contidas no
RNA. O cDNA
recebe esse
nome porque é
complementar
à sequência do
RNA original.
Comentário
A transcriptase reversa do vírus é capaz de alterar o famoso princípio da biologia, o qual estabelece que
o DNA é transcrito em RNA e o RNA é traduzido em proteína. Isso ocorre porque a transcriptase reversa
realiza o processo oposto, sintetizando DNA a partir de RNA, o que representa uma exceção à regra
convencional. 
A construção do cDNA é feita em um tubo contendo:
RNA molde
É a sequência de RNA usada para a construção do cDNA.
Transcriptase reversa
É a polimerase capaz de transcrever o RNA em cDNA.
Nucleotídeos (A, T, C, G)
São unidades funcionais para a síntese do cDNA.
Íon bivalente de magnésio (Mg2+)
É um cofator essencial para o funcionamento da transcriptase reversa.
Primers
São pequenos fragmentos de DNA fita simples que se complementam ao RNA para dar início à
transcrição reversa.
DNA polimerase
Responsável por sintetizar o DNA a partir dos nucleotídeos presentes.
A síntese do cDNA começa pelo anelamento do primer no RNA, seguido pelo acoplamento da transcriptase
reversa e início da sua atividade, formando o cDNA no sentido 5’ – 3’. Uma vez formado o cDNA, o fragmento
de RNA usado como molde é degradado pela RNase H, um domínio do próprio complexo da transcriptase
reversa.
 
Durante a construção do cDNA, uma etapa crítica para termos um cDNA de boa qualidade é a construção do
primers. Existem três estratégias gerais de construção de primers:
Oligo dt
Primer formado por vários nucleotídeos do tipo timina que se anela a cauda poli-A do RNAm maduro.
A cauda tem esse nome por ser formada de 80 a 250 resíduos de adenina. A cauda serve para
proteger o RNAm de degradação enzimática durante todo o processo de locomoção em direção ao
ribossomo. A cauda poli-A é clivada por endonucleases quando o RNAm encontra o ribossomo. Ele é
preferencialmente utilizado quando queremos fazer cDNA de RNAm. Para o oligo dT é importante que
o RNAm esteja íntegro, uma vez que ele se anela na extremidade 3’ do molde. Se o RNAm estiver
fragmentado, o cDNA vai ser feito apenas de um pequeno trecho e talvez seja não funcional.
Randômico
Primer feito de pequenas sequências aleatórias que se anelam a qualquer RNA presente, incluindo
rRNA (RNA ribossomal) e tRNA (RNA transportador). Ele é indicado para amostras de sequência
desconhecida ou de difícil manipulação.
Específico
Primer construído especificamente para determinado RNA, sendo utilizado quando se tem um alvo
determinado, por exemplo, diagnosticar um RNA viral. O primer é desenhado de forma complementar
ao RNA viral. Por isso, ao término da reação, só teremos cDNA se o primer encontrar o seu RNA alvo.
Para o primer específico, é fundamental que toda a sequência do DNA/RNA seja conhecida.
Os três tipos de primers podem ser combinados, formando um primer com um trecho oligo dT e outro trecho
específico. Dessa forma, teremos uma transcrição da porção 3’ de um RNA molde específico ou oligo dT com
um randômico, para tentar formar cDNA de qualquer RNAm do material inicial. A combinação de primers
depende de criatividade do pesquisador e da sua capacidade de otimizar a síntese do cDNA.
Nesse ponto, temos então uma fita de cDNA íntegra, recém-formada pela transcriptase reversa e uma fita de
RNA ligada ao cDNA parcialmente degradada pela RNase H. Assim, sintetizamos um RNAm maduro, sem a
presença de íntrons. Esses fragmentos de RNA serão utilizados como primers de iniciação pela DNA
polimerase que irá construir o DNA complementar ao cDNA.
Com isso, temos finalmente a fita dupla de DNA formada.
Formação da fita dupla de cDNA
Na imagem, vemos que o RNAm se liga ao primer oligo dT(1). Em seguida, a transcriptase reversa sintetiza
uma fita de cDNA (sequência de bases representada pela linha azul), a partir do primer oligo dT ligado ao
RNA(2). A RNAse H quebra o RNAm associado ao cDNA recém-sintetizado. Os dNTPs presentes no meio
reacional são usados para a construção de uma nova fita de DNA complementar ao cDNA, pela ação da DNA
polimerase(3). Com isso, a fita dupla de cDNA é formada (4).
A construção de cDNA tem como funções principais:
Possibilitar a amplificação de RNA pela PCR.
 
Determinar o nível de expressão gênica de determinada proteína no organismo.
 
Possibilitar a construção de uma bibliotecagenômica, estabelecendo relações de quais genes podem
expressar determinadas proteínas, o que pode ser aplicado para elaboração de terapias, estudo de
espécies, doenças etc.
 
O cDNA pode ser utilizado na clonagem (formação de novos trechos de DNA em outro indivíduo),
criação de bibliotecas (responsáveis por identificação e armazenamento de informação gênica), testes
de microarranjo (coleção de DNAs presos em uma superfície sólida, para estudos de genotipagem,
expressão, entre outros), detecção de SNP (Single Nucleotide Polymorphism, variações pontuais
encontradas ao longo do DNA, isto é, são diferenças em um único nucleotídeo) etc.
Atividade 5
A fluorometria é uma técnica utilizada para quantificar o DNA/RNA extraído, baseada na medição da
fluorescência emitida por um agente fluorescente. Com base nesse contexto, qual das alternativas descreve
corretamente a relação entre a fluorescência e a quantidade de material genético?
A Quanto maior a fluorescência, menor a quantidade de DNA/RNA.
B A fluorescência é independente da quantidade de material genético.
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C Quanto maior a fluorescência, maior a quantidade de DNA/RNA.
D A fluorescência está relacionada à pureza do material genético, não à quantidade.
E A fluorescência é utilizada apenas para quantificar RNA, não DNA.
A alternativa C está correta.
A fluorescência emitida pelo agente fluorescente é diretamente proporcional à quantidade de DNA/RNA
presente na amostra, ou seja, quanto maior a fluorescência, maior a quantidade de material genético.
Caso prático
Mariana, 28
anos, procurou
atendimento
médico após
apresentar
sintomas
gripais, como
febre, tosse
seca e dor de
garganta. Ela
também
mencionou que
teve contato
recente com
uma pessoa
que testou
positivo para
covid-19. O
médico solicitou
que Mariana
realizasse o
exame de RT-
PCR para
diagnóstico de
infecção por
SARS-CoV-2.
 Para o teste de
RT-PCR, o
laboratório
precisou
realizar a
extração do
RNA viral
presente nas
amostras
respiratórias de
Mariana,
coletadas
através de um
swab
nasofaríngeo. O
processo de
extração é uma
etapa crítica na
qualidade e na
integridade do
material
genético, o que
impacta
diretamente na
precisão do
diagnóstico
molecular.
 No laboratório, a
equipe de biologia
molecular seguiu um
protocolo rigoroso
para a extração do
RNA. Primeiramente,
as amostras foram
tratadas com uma
solução lítica para
quebrar as células e
liberar o material
genético. A extração
foi realizada
utilizando uma
coluna de sílica, que
possui afinidade
específica para o
RNA. Após a
purificação, o RNA
foi eluído e
quantificado para
garantir a
adequação da
amostra para a
realização do PCR.
 Durante a
análise, o
laboratório
observou
que o RNA
extraído
estava com
boa
qualidade,
sem sinais
de
degradação.
A RT-PCR
foi
realizada, e
a
amplificação
do RNA do
SARS-
CoV-2 foi
positiva,
confirmando
o
diagnóstico
de covid-19
em Mariana.
 O médico
prescreveu
o
tratamento
adequado,
e ela foi
orientada
sobre as
medidas de
isolamento
para evitar
a
transmissão
do vírus.
Questão 1
Durante a extração de DNA da amostra biológica da paciente com infecção viral, o laboratório utilizou uma
solução de fenol/clorofórmio para purificação. Com base nisso, qual é a principal função dessa solução no
processo de extração de DNA?
A Eliminar contaminantes como lipídios e proteínas, deixando o DNA purificado.
B Realizar a lise celular, quebrando as membranas celulares para liberar o DNA.
C Precipitar o RNA da amostra, deixando apenas o DNA solúvel.
D Inibir a ação de enzimas como a DNase, para evitar a degradação do DNA.
E Acelerar o processo de separação do DNA devido à sua alta temperatura.
A alternativa A está correta.
A solução de fenol/clorofórmio é comumente usada durante o processo de extração de DNA para remover
proteínas, lipídios e outros contaminantes da amostra. O fenol separa as proteínas para a fase orgânica,
enquanto o DNA, que permanece na fase aquosa, é purificado para análises posteriores. Essa etapa é
importante para garantir a qualidade do DNA extraído, livre de impurezas que poderiam interferir em testes
moleculares, como PCR ou sequenciamento.
Questão 2
No caso de Mariana, a extração de DNA foi realizada com sucesso e a amostra foi considerada adequada para
as análises moleculares. Considerando essa afirmação, quais são os principais fatores que influenciam a
qualidade de uma amostra de DNA para ser utilizada em análises laboratoriais?
Chave de resposta
Os principais fatores que influenciam a qualidade de uma amostra de DNA incluem:
Pureza: a amostra de DNA deve ter uma alta razão entre as absorbâncias a 260 nm e 280 nm,
idealmente em torno de 1,8 a 2,0, indicando a presença mínima de contaminantes como proteínas
ou fenol.
Integridade: o DNA deve estar intacto, sem fragmentação significativa, o que pode ser verificado
por eletroforese em gel.
Concentração: a quantidade de DNA deve ser suficiente para as análises que serão realizadas,
sendo determinada pela quantificação usando espectrofotometria ou fluorometria.
Ausência de contaminantes: substâncias como RNA, proteínas e compostos fenólicos podem
interferir nas análises, por isso a amostra deve ser limpa de tais contaminantes.
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Questão 3
No caso de Mariana, foi realizada a extração de DNA de uma amostra respiratória. Após a extração, a amostra
foi quantificada utilizando um espectrofotômetro, e o valor da razão entre as absorbâncias a 260 nm e 280 nm
foi de 2.0. O que esse valor indica sobre a qualidade da amostra e por que ela está adequada para as análises
moleculares subsequentes?
Chave de resposta
A razão entre as absorbâncias a 260 nm e 280 nm de 2.0 indica que a amostra de DNA é de boa qualidade.
Essa razão é um padrão ideal, ou seja, a amostra contém uma quantidade mínima de contaminantes, como
proteínas ou outros compostos, que absorvem a 280 nm. Valores próximos de 2.0 indicam que a amostra
está suficientemente pura para ser utilizada em análises moleculares, como PCR ou qPCR, sem riscos
consideráveis de interferência nas reações. Isso confirma que a extração foi realizada de maneira eficaz,
preservando a integridade do material genético e possibilitando a realização de experimentos
subsequentes com precisão.
Acompanhe no vídeo a seguir a explicação do caso prático e a resolução das questões.
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3. Conclusão
Considerações finais
O que você aprendeu neste conteúdo?
A aplicação do método científico, por meio do desenho experimental, é essencial para reprodutibilidade
e a confiabilidade dos resultados em estudos moleculares.
 
A definição devidamente elaborada de hipóteses, variáveis e critérios de análise orienta todas as
etapas do experimento, assegurando que a relação causa-efeito possa ser avaliada corretamente.
 
A coleta, o transporte e o armazenamento adequado das amostras são fundamentais para evitar
degradações e garantir a viabilidade do DNA ou RNA.
 
Devido à sua instabilidade e suscetibilidade às RNases, o RNA requer cuidados específicos, como o uso
de tubos RNase-free e congelamento rápido.
 
A escolha dos anticoagulantes, soluções de preservação e reagentes livres de contaminantes interfere
diretamente na qualidade do material extraído.
 
As técnicas de extração de DNA e RNA possuem diferenças fundamentais, especialmente no pH das
soluções e no manuseio das enzimas degradadoras.
 
A análise por fluorometria e espectrofotometria avalia a quantidade e pureza dos ácidos nucleicos,
influenciando o sucesso das etapas posteriores.
 
A eletroforese é essencial para verificar se o DNA ou RNA está íntegro, condição indispensável para a
eficácia das análises moleculares.
 
A conversão de RNA em cDNA amplia as possibilidades de análise, especialmente em estudos de
expressão gênica e em testes de RNA viral.
 
O cumprimento rigoroso dos POPs e das normas de biossegurança evita erros, contaminações e
garante resultados fidedignos em diagnósticos e pesquisas.
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Confira as indicações que separamos paravocê!
 
Assista no YouTube:
 
Como é feito um Teste de DNA?
 
Eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose.
 
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Leia:
 
Aprenda a fazer extração de DNA em Casa da Ciência, Hemocentro da FMRP-USP, e conheça a técnica
de extração utilizando cebola e materiais que temos dentro de casa.
 
Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico molecular, de Murilo Rezende Melo
e colaboradores (2010).
Referências
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J. Clin. Microbiol, v. 39, p. 485-93, 2001.
 
AUSUBEL, F. M. Current protocols in molecular biology ‒ 1987-1988. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 1987.
 
BELOTSERKOVSKII, B. P. et al. Polypropylene tube surfaces may induce denaturation and multimerization of
DNA. Science, v. 271, p. 222, 1996.
 
FEIGELSON, H. S. et al. Determinants of DNA yield and quality from buccal cell samples collected with
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GUBLER, U.; HOFFMAN, B. J. A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene, v. 25, n.
2-3, p. 263-269, 1983.
 
LAZAR, J.; FENG, J. H.; HOCHHEISER, H. Research methods in human-computer interaction. Burlington,
Massachusetts: Morgan Kaufmann, 2017.
 
MELO, M. R. et al. Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico molecular. Jornal
Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, v. 46, n. 5, p. 375-381, 2010.
 
MULLEGAMA, S. V. et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. In: WALKER, J. M. Methods in
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NUOVO, G. J. In situ detection of PCR-amplified DNA and cDNA: a review. Journal of Histotechnology, v. 17, n.
3, p. 235-246, 1994.
 
OLIVEIRA, M. C. de S. et al. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de DNA
por meio da técnica de reação em cadeia de polimerase. Embrapa Pecuária Sudeste - Livro científico, 2007.
 
RODRIGUES JR., J. F. Pesquisa Experimental. 2018. Escrita Científica USP, s. d.
 
SANTELLA, R. M. Approaches to DNA/RNA extraction and whole genome amplification. Cancer Epidemiology
and Prevention Biomarkers, v. 15, n. 9, p. 1585-1587, 2006.
 
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SHOKERE, L. A.; HOLDEN, M. J.; JENKINS, G. R. Comparison of fluorometric and spectrophotometric DNA
quantification for real-time quantitative PCR of degraded DNA. Food control, v. 20, n. 4, p. 391-401, 2009.
 
VISVIKIS, S.; SCHLENCK, A.; MAURICE, M. DNA extraction and stability for epidemiological studies. Clinical
Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM), v. 36, n. 8, p. 551-555, 1998.
	Isolamento de ácidos nucleicos
	1. Itens iniciais
	Objetivos
	Introdução
	1. Introdução ao isolamento dos ácidos nucleicos
	Desenho experimental
	Conteúdo interativo
	Observação
	Questionamento
	Formulação da hipótese
	Experimentação
	Análise dos resultados
	Conclusão
	Definir a relação causa-efeito
	Planejamento
	Execução
	Análise e interpretação
	Formular as conclusões
	Atividade 1
	Variáveis, hipóteses e erros no desenho experimental
	Conteúdo interativo
	Variável dependente e independente
	Variáveis independentes
	Variáveis dependentes
	Hipótese nula e hipótese alternativa
	Tipos de erros
	Erro Tipo 1 (falso positivo)
	Erro Tipo 2 (falso negativo)
	Seleção de participantes
	Amostragem não probalística
	Amostragem probalística
	Amostragem aleatória simples
	Amostragem sistemática
	Atividade 2
	Coleta, transporte e armazenamento de amostras biológicas
	Conteúdo interativo
	Coleta da amostra
	Identificação e cadastro
	Armazenamento e transporte
	Impacto da fase pré-analítica nos resultados
	Falso negativo
	Falso positivo
	Extração de DNA
	Extração de RNA
	Sangue e aspirado de medula óssea
	Comentário
	Sangue total
	Plasma
	Amostras congeladas
	Atenção
	Amostra de tecidos
	Dica
	Células bucais
	Extração de RNA
	Extração de DNA
	Coleta de líquido cefalorraquidiano (líquor ou LCR)
	Atividade 3
	Caso prático
	Conteúdo interativo
	2. Extração e quantificação do material genético
	Extração do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas
	Conteúdo interativo
	Atenção
	Atividade 1
	Procedimentos de extração de DNA
	Conteúdo interativo
	Atenção
	Adição de solvente orgânico
	Fase aquosa: DNA
	Fase orgânica
	Solução concentrada de NaCl
	Coluna de adsorção do DNA
	Curiosidade
	Relembrando
	Primeira etapa
	Segunda etapa
	Terceira etapa
	Comentário
	Rompimento das membranas
	Desnaturação de proteínas e remoção de RNA
	Separação do DNA de outros componentes celulares
	Precipitação e purificação do DNA
	Ressuspensão do DNA
	Atividade 2
	Procedimentos de extração de RNA
	Conteúdo interativo
	Fase 1
	Fase 2
	Fase 3
	Extração de DNA/RNA
	Adição de solução fenol/clorofórmio
	Separação da fase orgânica por centrifugação
	Adição de acetato de amônio e etanol absoluto
	Ressuspensão e armazenamento do material genético extraído
	Atividade 3
	Armazenamento do DNA e do RNA purificados
	Conteúdo interativo
	Atividade 4
	Quantificação, análise de pureza e integridade do material
	Conteúdo interativo
	Quantificação
	Pureza
	Exemplo
	Etapa 1
	Etapa 2
	Etapa 3
	Etapa 4
	Integridade
	Comentário
	Bandas bem definidas
	Bandas com arraste
	Síntese de cDNA
	Comentário
	RNA molde
	Transcriptase reversa
	Nucleotídeos (A, T, C, G)
	Íon bivalente de magnésio (Mg2+)
	Primers
	DNA polimerase
	Oligo dt
	Randômico
	Específico
	Atividade 5
	Caso prático
	Conteúdo interativo
	3. Conclusão
	Considerações finais
	O que você aprendeu neste conteúdo?
	Explore +
	Referênciassiga critérios lógicos e organizados em
busca de respostas confiáveis. Com base nisso, qual ação representa corretamente uma etapa do desenho
experimental?
A Escolher um reagente com base em preferências pessoais.
B Registrar as conclusões sem considerar os dados obtidos.
C Formular hipóteses depois da execução para justificar os resultados.
D Estabelecer o problema e os objetivos antes de iniciar o experimento.
E Repetir o experimento diversas vezes para gerar diferentes resultados.
A alternativa D está correta.
Uma das etapas iniciais do desenho experimental é definir o problema a ser investigado, os objetivos do
estudo e o que se pretende alcançar. Esse direcionamento inicial orienta as demais fases do experimento,
desde o planejamento até a análise dos dados e formulação de conclusões, sendo essencial para garantir
clareza, foco e reprodutibilidade na pesquisa.
Variáveis, hipóteses e erros no desenho experimental
Neste vídeo, vamos falar sobre variáveis dependentes e independentes, hipóteses nula e alternativa, erros do
tipo 1 e 2, além de estratégias de amostragem e sua importância na construção de experimentos confiáveis.
Confira!
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Variável dependente e independente
O que são variáveis dependentes e independentes? Para responder a essa pergunta, aprenderemos alguns
conceitos essenciais para o desenho experimental.
 
Sempre que fazemos um experimento, queremos verificar os seus resultados. Todos os resultados (outputs)
são originados a partir das entradas do experimento (inputs).
 
Considerando a necessidade de se extrair o DNA com sucesso, o input será o material coletado, por exemplo,
o raspado da face interna da bochecha, e o output será o DNA extraído desse material.
Entradas
Correspondem a todos os valores inseridos em determinado modelo, ou seja, em um modelo
experimental em que valores são dados, as entradas são estes valores.
Extração de DNA.
Os inputs podem ser influenciados por diferentes fatores, chamados de variáveis. Elas são agrupadas em dois
grupos:
Variáveis independentes
São aquelas que podemos controlar e modificar,
e possuem certo efeito sobre a variável
dependente.
Variáveis dependentes
São aquelas que medem o efeito do que está
sendo avaliado e dependem da variável
independente.
O experimento será medir a concentração plasmática do colesterol. As variáveis independentes, ou seja, as
que são possíveis controlar, seriam: “Fiz jejum? Me alimentei bem? Usei algum medicamento nos últimos dias?”
Essas perguntas influenciarão diretamente no resultado do colesterol encontrado, ou seja, na variável
dependente, que nesse caso é a concentração de colesterol dosada no soro. 
Hipótese nula e hipótese alternativa
Após os resultados do experimento, baseando-se nos dados coletados e processos realizados, como garantir
que o dado obtido em uma amostra pode ser generalizado para toda a população e verificar se a hipótese
inicial estava correta?
 
Para tentar responder a essas perguntas, os cientistas utilizam modelos estatísticos e testes de hipóteses
para analisar os dados e testar a validade desses resultados. Por meio da inferência estatística, os testes de
hipótese são utilizados para tomar a decisão de aceitar ou rejeitar uma hipótese estabelecida no início do
desenho experimental.
 
Existem dois tipos de hipótese:
Vamos entender melhor a partir de um exemplo!
Para provar que existe
um padrão, ou seja, uma
relação causa-efeito,
vamos estudar se, ao
falar com um papagaio,
ele repete exatamente o
que falamos. Nesse
caso, a hipótese inicial,
aquela que se deseja
provar, é que o papagaio
repete o que falamos.
 Para isso, o experimento
será falar várias vezes para
o papagaio a palavra
Vasco e observar o que ele
diz. Como resultado,
podemos esperar que ele
repita a mesma palavra
Vasco ou não (Flamengo,
ou qualquer outra palavra
diferente de Vasco). Assim,
teremos duas hipóteses: 
 Hipótese
nula: aquela
em que não
há relação
causa-
efeito, que
ele não
repete o
que
falamos, ou
seja, ao
ouvir Vasco,
ele diz
Flamengo.
Quando
isso
acontece,
dizemos
que a H₀ é
verdadeira.
 
Hipótese
alternativa:
aquela que
confirma a
relação
causa-
efeito, em
que ele
repete o
que
estamos
falando, ao
ouvir Vasco,
ele repete
Vasco.
Nesse caso,
rejeitamos a
H₀ e a H1 é
verdadeira.
Tipos de erros
Todos os experimentos e análises de resultados são passíveis de erros de interpretação e/ou do processo
realizado. Os erros são causados quando temos uma interpretação errônea dos dados, o que nos leva a
rejeitar uma hipótese verdadeira (falso positivo) ou não rejeitar uma hipótese falsa (falso negativo). Os erros
podem ser classificados como tipo 1 e 2, de acordo com a hipótese que será rejeitada. Veja o quadro a seguir.
Hipótese nula 
Indica que não há uma relação causa-
efeito.
Hipótese alternativa 
Indica que existe uma relação causa-
efeito, ou seja, rejeita a hipótese nula.
• 
• 
 A hipótese nula é
verdadeira A hipótese nula é falsa
Decisão
Decidimos rejeitar
a hipótese nula.
Erro tipo 1 (rejeição de
uma hipótese nula
verdadeira)
Decisão correta
Aceita-se a
hipótese nula.
Decisão correta
Erro tipo 2 (não rejeição ou
aceitação de uma hipótese
nula falsa)
Eldio dos Santos.
Para facilitar a compreensão, vamos retomar o exemplo do papagaio:
1
Erro Tipo 1 (falso positivo)
Falamos a palavra Vasco para o papagaio, mas ele responde Flamengo ou outra palavra. Aqui, a H₀
(não há relação causa-efeito) é verdadeira, pois o papagaio não está repetindo a palavra. No
entanto, se acreditarmos que há uma relação e rejeitarmos H₀, cometemos um Erro Tipo 1.
2
Erro Tipo 2 (falso negativo)
Falamos Vasco e o papagaio repete realmente a mesma palavra, mas por engano entendemos Asco.
A H₀ (o papagaio não repete a palavra) seria falsa, pois ele repetiu corretamente. No entanto, se
aceitarmos H₀ por termos ouvido errado, cometemos um Erro Tipo 2.
Esses conceitos podem ser utilizados em qualquer desenho experimental e são muito comuns na área médica,
principalmente em testes de diagnóstico clínico, nos quais kits de diagnóstico demonstram resultado positivo
para uma doença inexistente ou resultado negativo, quando, na verdade, há presença de doença.
Seleção de participantes
A seleção dos participantes, população de estudo, deve ser a mais representativa possível, para termos
menor chance de errar ao generalizar os resultados.
A seleção de participantes de um estudo também pode ser chamada de amostragem, que pode ser não
probabilística ou probabilística.
Amostragem não probalística
A seleção dos participantes não é aleatória, ou
seja, não segue um critério de probabilidade e
depende do julgamento do pesquisador. Pode
ocorrer por conveniência, escolhendo
indivíduos mais acessíveis, ou por julgamento,
considerando características específicas. 
Amostragem probalística
Ocorre quando cada elemento da população
possui a mesma probabilidade de ser
selecionado para compor a amostra. Nesse
caso, a probabilidade da seleção de cada
participante é conhecida. Por exemplo, em uma
amostra aleatória simples com 10 participantes,
a chance de um deles ser escolhido é 1/10, ou
seja, 10%.
A amostragem probabilística pode ser aleatória simples ou sistemática. Entenda melhor a seguir.
Amostragem aleatória simples
Os participantes são selecionados aleatoriamente em uma determinada população. Em uma população de 12
participantes, eu escolho 9 de forma aleatória (ao acaso). Isso poderia ser realizado por sorteio, por exemplo.
Ilustração de uma amostragem aleatória simples.
Amostragem sistemática
O primeiro participante é selecionado a partir de um número preestabelecido e os outros participantes são
escolhidos seguindo um mesmo coeficiente. Por exemplo, em uma população com 13 participantes, vamos
padronizar um coeficiente de 3. Além disso, vamos utilizar a fórmula 1 + (K x N), em que K é meu coeficiente e
N o número do participante. Se definimos o primeiro participante como o número 1 (poderia ser qualquer
outro), quaisseriam os outros participantes?
 
O segundo participante será o número 1 + o coeficiente (3) X a quantidade de participantes já
escolhidos, assim teríamos 1 + 3 (coeficiente) X 1 (número já selecionado). Ou seja, o participante seria
o número 4.
 
O terceiro participante será o número 1 + 3 x 2 = 7.
 
O quarto 1 + 3 x 3 = 10.
 
O quinto 1 + 3 x 4 = 13, fechando, assim, a amostra.
Ilustração de uma amostragem sistemática.
Com os conceitos básicos sobre desenho experimental estabelecidos, podemos seguir para as próximas
etapas da fase pré-analítica do isolamento de ácidos nucleicos. Os conceitos aprendidos aqui são valiosos e
podem ser utilizados em qualquer situação da vida, seja ela profissional ou do cotidiano.
Atividade 2
• 
• 
• 
• 
Ao elaborar um experimento, precisamos compreender como os elementos controlados e os resultados
observados se relacionam entre si. Qual das alternativas apresenta corretamente o papel de uma variável
independente?
A Aquela que representa o desfecho do experimento.
B Um elemento manipulado que influencia a resposta observada.
C O dado que surge da observação dos resultados.
D Um fator que depende das análises estatísticas finais.
E O número de participantes obtido após a coleta dos dados.
A alternativa B está correta.
Variáveis independentes são elementos que o pesquisador pode controlar ou modificar durante o
experimento, com o objetivo de avaliar o impacto dessas mudanças sobre as variáveis dependentes, que
são os resultados observáveis. Essa distinção ajuda a compreender a relação de causa e efeito dentro de
um desenho experimental.
Coleta, transporte e armazenamento de amostras
biológicas
Este vídeo mostra os cuidados na coleta, no transporte e no armazenamento de amostras biológicas para
testes moleculares, com foco nos tipos de amostras, anticoagulantes, estabilização, temperaturas e riscos
pré-analíticos. Confira!
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Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.
O mercado dos testes moleculares está em intensa expansão. O marketing feito pelos laboratórios, as
divulgações promovidas por celebridades, as regulações nos preços dos testes, o desenvolvimento de
marcadores e os kits acessíveis, entre outros fatores colaboram para o crescimento desse ramo de mercado.
São várias as empresas que
fazem testes utilizando
material genético para
diferentes fins, por
exemplo, indicar a
ancestralidade e a origem
genética, e apontar
marcadores genéticos para
doenças, além dos testes
laboratoriais para diversos
tipos de infecções
(incluindo covid-19).
 Os testes moleculares são frequentemente
associados à precisão absoluta, seja por
utilizarem tecnologia de ponta, pela forma
como são divulgados ou pelo seu caráter
técnico e complexo, distante do senso
comum. No entanto, é um equívoco pensar
que seus resultados são infalíveis. Assim
como qualquer outro exame laboratorial, os
testes genéticos estão sujeitos a erros, e a
maioria desses erros ocorre na fase pré-
analítica. 
O que é a fase pré-analítica?
Compreende todas as etapas que antecedem a análise laboratorial propriamente dita, incluindo:
Coleta da amostra
A obtenção do material biológico deve seguir protocolos rigorosos para evitar contaminação ou
degradação.
Identificação e cadastro
Todas as amostras devem estar devidamente identificadas com nome do paciente, data da coleta,
assinatura do responsável pela coleta e um código numérico para dupla verificação.
Armazenamento e transporte
Condições inadequadas, como variações de temperatura ou tempo excessivo entre a coleta e a
análise, podem comprometer a qualidade do material.
Além das amostras biológicas, os testes moleculares podem ser realizados a partir de cultura de células e de
microrganismos. Nesses casos, também é essencial os cuidados com a fase pré-analítica, para um resultado
de qualidade. A coleta e manipulação de todas essas amostras, assim como na coleta de qualquer material
biológico, deve ser realizada seguindo todas as normas de biossegurança, com utilização dos equipamentos
de proteção individual, para evitar contaminação.
Impacto da fase pré-analítica nos resultados
Erros nesta etapa podem levar a resultados inválidos, falsos negativos ou falsos positivos, afetando a
confiabilidade dos testes.
Falso negativo
É quando o teste não detecta o que deveria e
pode ocorrer devido à degradação do material
genético.
Falso positivo
É quando o teste indica um resultado
incorretamente positivo e pode ser causado por
contaminação.
Alguns testes possuem critérios específicos de acordo com o procedimento realizado. Portanto, é
responsabilidade do laboratório informar quais são os critérios de aceitação e exclusão de amostras para cada
tipo de ensaio, garantindo a qualidade e confiabilidade dos resultados.
A padronização e o controle rigoroso da fase pré-analítica são fundamentais, pois evitam erros e
garantem a precisão dos exames, principalmente na biologia molecular.
As amostras devem estar devidamente identificadas com o nome do paciente e data da coleta, assinatura de
quem coletou e um código numérico para dupla verificação. Amostras que não estiverem identificadas
corretamente ou aquelas que apresentem características que impossibilitem o teste, como a presença de 
hemólise no tubo de sangue, devem ser descartadas.
 
Alguns tipos de testes possuem critérios específicos de acordo com o procedimento realizado. É obrigação do
laboratório deixar evidente para os pacientes os critérios de aceitação e exclusão de amostras para cada tipo
de ensaio.
Hemólise
Extravasamento de componentes intracelulares das hemácias para o meio extracelular, por conta de um
rompimento das membranas celulares. 
A quantidade de material
genético extraído
depende diretamente do
local de coleta, do número
de células presentes e
pode variar conforme a
idade do paciente, além
de depender diretamente
das condições de
transporte e
armazenamento.
 Em algumas ocasiões, um resultado
negativo em um exame pode ser
resultado de um erro durante a fase
pré-analítica, uma vez que o material
genético tem que estar viável para
conseguir realizar as técnicas
moleculares que envolvem sua
amplificação. É sempre preferível
trabalhar com amostras frescas para
melhorar o rendimento.
 Veja a
seguir
alguns
cuidados
para
extração
de
amostras
de DNA
e RNA.
Extração de DNA
A coleta deve ser feita com atenção, pois, no organismo, existem moléculas capazes de degradar o
DNA, como as desoxirribonucleases (DNases) que necessitam de íons metal para a sua atividade.
Então, para inativação da enzima, pode ser necessária a utilização de agentes quelantes como o
EDTA. Ela também é inativada pelo calor durante 10 minutos a 65 °C.
Extração de RNA
A coleta exige mais rigor, visto que o RNA é uma molécula extremamente instável e frágil, que se
degrada rapidamente pela ação das ribonucleases (RNase). Essas enzimas atuam sem necessidade
de cofatores, são altamente estáveis — permanecendo ativas mesmo após fervura ou autoclavagem
— e estão presentes em diversos materiais biológicos, inclusive na pele humana. Por isso, é
indispensável adicionar agentes estabilizadores de RNA imediatamente após a coleta. Além disso, o
recipiente utilizado deve ser certificado como livre de RNases (RNase-free), estéril e sempre
manipulado com luvas.
Diferentes amostras biológicas podem ser coletadas para testes moleculares, incluindo sangue, escarro,
tecidos e até um fio de cabelo. A partir dessas amostras, é possível analisar tanto o material genético humano
(DNA/RNA) quanto o de microrganismos, detectando e quantificando vírus, bactérias e protozoários, além de
investigar doenças genéticas, predisposições e até testes de paternidade. Os testes moleculares também têm
aplicações forenses, como no caso do jornalista Tim Lopes, cuja identificação após o crime só foi possível com
auxílio dos testes moleculares.
 
A seguir, veremos os cuidados específicos para cada tipo de amostra destinadas à extração do DNA/RNA.
Vamos lá!
Sangue e aspirado de medula óssea
Amostras de sanguee aspirado de medula óssea precisam ser armazenados junto a agentes anticoagulantes
para manter a estabilidade da amostra, impedindo a coagulação sanguínea. Entretanto, a heparina (agente
anticoagulante amplamente utilizado) é um potente inibidor de algumas técnicas moleculares, entre elas o
famoso PCR (Polymerase Chain Reaction).
PCR
Técnica utilizada para amplificar a quantidade de material genético. É fundamental para as análises
posteriores ou até pode ser utilizada como ferramenta principal de diagnóstico. 
Comentário
A impossibilidade do uso de heparina fez com que outros anticoagulantes fossem preferíveis, sendo
normalmente utilizados o EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou o ACD (citrato de dextrose) para
essas amostras. A coleta de amostras com o anticoagulante EDTA, apesar de ser mais utilizada e
indicada para amostras de sangue, também pode interferir em algumas metodologias, já que o EDTA
pode inibir drasticamente a atividade da DNA polimerase se estiver em excesso. 
Quando o objetivo é a análise do DNA, o sangue total apresenta uma estabilidade variável, dependendo das
condições de armazenamento. Entenda a estabilidade das amostras.
Sangue total
Estável por até 24 horas em temperatura ambiente e até 8 dias entre 2 °C e 8 °C.
Plasma
Estável por 5 dias entre 2 °C e 8 °C, mas pode ser armazenado por mais tempo se congelado.
Amostras congeladas
Devem evitar ciclos de congelamento e descongelamento para preservar a integridade do material
genético.
Para RNA viral, o sangue deve ser centrifugado em até 4 horas após a coleta e o plasma transferido para um
tubo estéril livre de RNases. 
 
Além disso, para a extração de RNA após a coleta, esta deve ser colocada imediatamente em solução
estabilizante de RNA. Caso não tenha essa solução e não seja congelada, ela deve ser transportada em gelo
seco e analisada em até 4 horas.
 
Para as amostras de aspirado de medula óssea, a seringa deve conter EDTA e, após a coleta, o aspirado pode
ser armazenado por até 72 horas na temperatura de 2 °C a 8 °C. Caso seja necessário maior tempo para o
processamento, os eritrócitos precisam ser removidos e a amostra congelada a -20 °C, assim a estabilidade
do material permanece por meses.
Atenção
A amostra só pode ser congelada após a remoção dos eritrócitos. A remoção dos eritrócitos deve ser
feita com cuidado para evitar a hemólise, pois a liberação do grupamento heme contido nas hemácias
pode comprometer os resultados e inibir a PCR. Vale ressaltar que amostras com hemólise não são
adequadas para testes moleculares. 
Amostra de tecidos
Essas amostras são preferíveis quando os agentes etiológicos estão alojados no tecido e/ou o diagnóstico das
possíveis infecções seja difícil por meio da simples coleta de sangue. Além disso, essas amostras são as de
escolha durante as autópsias e para a análise de tecidos tumorais para comparar o DNA das células tumorais
com as normais.
 
Para garantir uma boa análise, é recomendado coletar de 1 g a 2 g de tecido-alvo. No entanto, a quantidade
pode variar conforme o tecido. Apenas para termos uma ideia, 10 mg de tecido fornece cerca de 10 µg de
material genético. Essa quantidade já é suficiente para análise, mas sempre devemos trabalhar com uma
margem de segurança, pois possíveis perdas de material podem ocorrer.
Para tecidos, o ideal,
após a coleta por
biópsia, é o rápido
congelamento em
nitrogênio líquido
(-196 °C) ou manter
esse tecido em
solução de
preservação de
ácidos nucleicos. Não
é recomendável
manter esse tipo de
material em
temperatura
ambiente por muito
tempo.
 Amostras pequenas
devem ser
embrulhadas em
gazes umedecidas
com salina para evitar
ressecamento, além
da solução de
preservação de
ácidos nucleicos.
Tecidos sólidos
apresentam muitas
endonucleases e
devem ser
processados ou
congelados o mais
rápido possível!
 Tecidos de biopsia
embebidos em
fixadores
utilizados para a
preservação de
tecidos para
exame
histopatológico 
não devem ser
empregados para
os exames de
biologia molecular.
 A estabilidade
do tecido
depende do tipo
de tecido
coletado.
Observe no
quadro a seguir
a estabilidade
do DNA em
diferentes
formas de
armazenamento.
Condições 
Mantido em banho de gelo triturado ou refrigerado em temperatura entre 2
°C e 8 °C
Até 24 h
Condições 
Congelado a -20 °C
Duas
semanas
Congelado a -70 °C Dois anos
Eldio dos Santos.
Se houver impossibilidade de congelar ou usar a solução preservadora, a amostra deve permanecer em
ambiente com gelo, inclusive no transporte e ser processada em 24 horas para o isolamento do DNA.
Quando a amostra for coletada para a extração do RNA, essa amostra deve ser rapidamente congelada em
nitrogênio líquido (-196 °C) antes de ser congelada a -70 °C, processada em no máximo uma hora após a
coleta ou colocada em solução estabilizadora do RNA. No momento da extração, as amostras não podem ser
descongeladas, e sim homogeneizadas diretamente em solução adequada para a extração (chamado agente
de extração, geralmente isotiocianato de guanidina). Os tubos de coleta também devem ser livres de RNases,
estéreis, e manipulados apenas com luvas, para evitar a degradação do RNA.
Dica
Normalmente, em temperatura de -20 °C, as RNases ainda estão ativas, assim, é recomendado manter
as amostras para análise de RNA em temperaturas inferior ou igual a -70 °C. 
Células bucais
A coleta das células bucais para a extração de DNA ou RNA pode ser realizada por meio de um raspado de
células da parte interna da boca utilizando um swab (cotonete estéril, específico para coleta de exames
microbiológicos) ou a partir do bochecho.
Extração de RNA
A amostra deve ser inserida em um tubo
contendo solução estabilizante de RNA.
Extração de DNA
As amostras podem ser secas ou estabilizadas
e transportadas à temperatura ambiente.
As amostras estabilizadas dentro do tubo possuem validade de até uma semana em temperatura ambiente,
podendo ser transportadas sem maiores cuidados.
 
Alguns swabs mais longos também podem ser utilizados para coletar material presente na orofaringe e na
nasofaringe para o diagnóstico de algumas doenças, em que o agente infectante colonize as vias
respiratórias, como o novo coronavírus e o vírus influenza.
Durante a pandemia da covid-19, a
testagem em massa popularizou o
uso de kits de coleta domiciliar,
facilitando o diagnóstico de
infecções respiratórias. Atualmente,
as empresas enviam os kits de
coleta para o paciente realizar o
procedimento em casa: o swab deve
ser esfregado na parte interna da
bochecha, cerca de 10 vezes de
cada lado e, em seguida, inserido no
tubo que vem no kit contendo a
solução estabilizante.
 Existem
alguns
erros
comuns
que
ocorrem
nesse tipo
de
abordagem.
Vamos
conhecê-
los! 
 Descartar a
solução
estabilizante.
 
Não
identificar
corretamente
o tubo de
coleta.
 
Contaminar o
swab com
restos de
alimentos,
batom ou
outros
resíduos.
 Além disso,
recomenda-se
evitar a coleta logo
após as refeições,
pois não é raro que
as amostras
encaminhadas para
o laboratório
contenham DNA de
alimentos, o que
pode comprometer
a análise destinada
à detecção de DNA
humano.
Coleta de líquido cefalorraquidiano (líquor ou LCR)
O LCR quando coletado para análise do DNA deve ser coletado em frascos estéreis, transportado na
temperatura de 2 °C a 8 °C e, caso não seja processado rapidamente, congelado na temperatura a partir de
-20 °C. Para análise de RNA, se o processamento não for realizado em até 4 horas, essa amostra deve ser
congelada. No entanto, caso a amostra tenha eritrócitos, eles devem ser removidos antes do congelamento.
 
No quadro a seguir, vamos reforçar as principais recomendações para coleta, armazenamento e transporte
dos materiais biológicos, visando à preservação da amostra e à confiabilidade dos resultados.
Amostra Coleta Armazenamento Transporte
Sangue
EDTA ou ACD
(evitar heparina)
24 h (ambiente),
8 dias (2-8 °C);
Meses (- 20 °C)
Refrigerado (2-8 °C);
Congelado (evitar
descongelamento)Plasma Separação em até 4 h
(RNA viral)
5 dias (2-8 °C) ou
congeladoAspirado
de medula
EDTA, inclusive na
seringa
72 h (2 °C a 8 °C)
Meses (-20 °C)
Tecido
1-2 g;
manter úmido para
evitar ressecamento
24 h (Gelo ou 2 °C e
8 °C)
Duas semanas (-20
°C )
Anos (-70 °C ou 196
°C)
Evitar temperatura
ambiente
Solução de preservação ou
Congelado
• 
• 
• 
Células
bucais
Swab/bochecho; evitar
contaminação
(alimentos, batom)
DNA: seco ou
estabilizado
1 semana
(ambiente);
RNA: em solução
estabilizante
DNA: Temperatura
ambiente;
RNA: Refrigerado ou
congelado
LCR Frasco estéril
DNA 24 h (2-8 °C)
ou
Meses (-20 °C)
RNA 4 h (2-8 °C) ou
meses (-70 °C)
Refrigerado
ou congelado
Nathalia Martins.
Em um passado recente, pensar nesse tipo de tecnologia de diagnóstico era deixado para filmes de ficção
científica, aqueles em que um médico high-tech coleta o sangue do paciente, passa em uma máquina e depois
de alguns segundos um papel é impresso indicando todas as doenças e quais os medicamentos utilizar.
 
Hoje, esse tipo de abordagem é real, ou pelo menos bem parecido com filmes, pois a população tem acesso
aos testes de forma mais fácil e barata. É importante ressaltar que, no Brasil, existem algumas empresas com
esse perfil.
Atividade 3
A detecção do vírus de RNA em testes moleculares pode ser comprometida quando há a presença de
hemólise em amostras de sangue, dificultando a obtenção de resultados confiáveis. Assinale a alternativa que
explica o efeito da hemólise.
A A hemólise libera hemoglobina, que pode inibir a PCR e comprometer a amplificação do RNA viral.
B A hemólise pode degradar o RNA viral e liberar enzimas intracelulares que interferem na extração do
material genético.
C A presença de hemoglobina e outros componentes celulares liberados pela hemólise pode afetar a
pureza do RNA extraído, reduzindo a eficiência da PCR.
D A hemoglobina presente na amostra pode alterar a fluorescência dos reagentes utilizados na PCR,
comprometendo a detecção do RNA viral.
E A hemólise pode indicar degradação da amostra, tornando-a inadequada para testes moleculares e
aumentando o risco de resultados inconclusivos.
A alternativa A está correta.
A hemólise ocorre quando os glóbulos vermelhos se rompem, liberando hemoglobina e outras substâncias
no plasma ou soro. A hemoglobina pode atuar como um inibidor da PCR (reação em cadeia da polimerase),
interferindo na ação da DNA polimerase e reduzindo a eficiência da amplificação do material genético. Além
disso, a hemoglobina pode afetar a qualidade da extração do RNA viral, dificultando a obtenção de um
material puro e íntegro para análise molecular.
Caso prático
Um laboratório
clínico recebeu
uma solicitação
para realizar
testes
moleculares
para a
detecção de
um vírus de
RNA a partir de
amostras
biológicas de
pacientes
sintomáticos.
Para garantir a
confiabilidade
dos resultados,
a equipe seguiu
rigorosos
protocolos de
coleta,
transporte e
armazenamento
das amostras.
 A coleta foi
realizada
utilizando dois
tipos de material
biológico: 
sangue e 
secreção
nasofaríngea. As
amostras de
sangue foram
colhidas em
tubos contendo
EDTA, um
anticoagulante
que ajuda a
evitar a
coagulação sem
interferir nas
análises
moleculares. Já
os swabs
nasofaríngeos
foram coletados
com hastes
estéreis e
imediatamente
imersos em meio
de transporte
viral (MTV), para
preservar o
material
genético até a
etapa de
extração.
 Após a coleta,
as amostras
foram
cuidadosamente
transportadas
em caixas
térmicas
contendo gelo
seco para evitar
a degradação
do RNA,
altamente
instável e
suscetível à
ação de
ribonucleases.
O transporte foi
realizado dentro
do tempo
recomendado,
garantindo que
todas as
amostras
chegassem ao
laboratório com
qualidade
preservada.
 No laboratório, as
amostras de
sangue passaram
por centrifugação
para separação
do plasma, que foi
armazenado a -80
°C até o
processamento.
As amostras de
swab foram
mantidas a -70
°C, para manter a
integridade do
RNA viral até o
momento da
extração. Para
evitar qualquer
risco de
contaminação ou
degradação, os
pesquisadores
trabalharam em
ambiente
controlado,
utilizando
materiais e
reagentes livres
de RNases e
adotando todas
as medidas de
biossegurança
necessárias.
 O RNA foi
extraído
imediatamente
das amostras
frescas ou
dos estoques
congelados,
seguindo
protocolos
padronizados
para obter
resultados
confiáveis.
Com isso, a
equipe
assegurou a
viabilidade do
material
genético para
a realização
dos testes
moleculares,
contribuindo
para um
diagnóstico
preciso e
confiável.
Questão 1
Considerando o caso prático, qual é a principal razão para armazenar as amostras de swab e plasma a
temperaturas inferiores a -70 °C antes da extração do RNA?
A Evitar a contaminação por microrganismos ambientais.
B Impedir a coagulação do sangue coletado.
C Prevenir a degradação do RNA por ribonucleases (RNases).
D Melhorar a eficiência da extração de DNA.
E Preservar a estabilidade do RNA viral até a realização dos testes moleculares.
A alternativa C está correta.
A degradação do RNA ocorre rapidamente devido à presença de ribonucleases (RNases), que permanecem
ativas mesmo em baixas temperaturas. O armazenamento a -70 °C ou inferior preserva a integridade do
RNA até a análise.
Questão 2
Como as etapas de coleta, transporte e armazenamento das amostras biológicas influenciam a confiabilidade
dos testes moleculares para a detecção do vírus de RNA, considerando os desafios do laboratório clínico no
caso apresentado? 
Chave de resposta
As etapas de coleta, transporte e armazenamento das amostras biológicas são fundamentais para a
confiabilidade dos testes moleculares na detecção do vírus de RNA, especialmente devido à alta
instabilidade desse material genético. No caso, o laboratório clínico adotou protocolos rigorosos para
minimizar os riscos de degradação e contaminação, assegurando a qualidade das amostras até o
processamento. Na fase de coleta, a escolha do material biológico adequado foi fundamental: o sangue foi
armazenado em tubos com EDTA para evitar coagulação sem interferir na análise molecular, enquanto os
swabs nasofaríngeos foram imediatamente imersos em meio de transporte viral (MTV) para preservar o
RNA viral. Durante o transporte, o uso de caixas térmicas com gelo seco manteve as amostras em
temperaturas baixas, reduzindo a ação de ribonucleases que poderiam degradar o RNA. O tempo de
transporte também foi controlado para evitar exposição prolongada a condições inadequadas. No 
armazenamento, as amostras foram mantidas em temperaturas ultra baixas (-70 °C para swabs e -80 °C
para plasma), garantindo a integridade do RNA até o momento da extração. Além disso, a equipe seguiu
protocolos rígidos de biossegurança e utilizou reagentes livres de RNases, prevenindo contaminação e
degradação.
Questão 3
Durante o processamento de amostras para testes moleculares, por que é importante utilizar materiais e
reagentes livres de RNases e adotar práticas rigorosas de biossegurança? Como podemos relacionar esses
cuidados com a qualidade dos resultados obtidos?
Chave de resposta
O uso de materiais e reagentes livres de RNases é essencial porque essas enzimas, presentes no ambiente
e em superfícies contaminadas, degradam rapidamente o RNA, comprometendo a integridade das
amostras. Como o RNA viral é altamente instável, qualquer exposição inadequada pode levar à perda do
material genético, prejudicando a amplificação e detecção nos testes moleculares. Além disso, a adoção
de práticas rigorosas de biossegurança protege tanto os profissionais quanto as amostras, evitando
contaminações cruzadas e interferências nos resultados. Com esses cuidados, é possível obter maior
precisão e confiabilidade nos diagnósticos, especialmente em testes sensíveis como os que detectam vírus
de RNA.
Acompanhe no vídeo a seguir a explicação do caso prático e a resolução das questões.
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2. Extração e quantificação do material genético
Extração do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas
Neste vídeo, mostramos de forma prática e teórica como éfeita a extração de DNA e RNA, com foco nos
POPs, reagentes, instrumentos e nas precauções para evitar contaminações e garantir bons resultados. Não
deixe de conferir!
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Agora que conhecemos todas as etapas pré-analíticas, estamos prontos para colocar a mão na massa! Vamos
então estudar de fato como é feita a extração do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas para a
obtenção do nosso material genético.
No entanto, antes de
começarmos a estudar a
extração, é interessante
relembrar que qualquer técnica
ou procedimento utilizado no
laboratório – seja ele qual for – é
como fazer um bolo, e por isso
devemos seguir determinada
receita.
No laboratório, chamamos a
receita de POP (procedimento
operacional padrão) e temos que
ter os ingredientes (os reagentes)
e os utensílios para fazer o bolo
(os materiais e instrumentos).
 Ler a receita e fazer o bolo é um
processo mecânico, qualquer pessoa
com um mínimo de conhecimento e
que saiba como manusear os
instrumentos consegue seguir o
passo a passo, e dependendo da
experiência, vai conseguir ter um
resultado satisfatório.
No fim do procedimento, pode ser que saia um bolo maravilhoso ou pode ser que não saia. Dessa forma,
percebemos que é importante saber qual é a função de cada componente do bolo para entendermos o
processo como um todo. Caso o bolo saia pequeno, faltou fermento, se ele saiu seco é porque faltou leite, e
assim temos uma noção de causa-efeito. O inverso também é válido: podemos saber tudo sobre como
funcionam os ingredientes do bolo, o nome da levedura usada no fermento, a temperatura ideal para assar o
bolo, qual a importância de cada componente na construção do bolo, mas se não soubermos como mexer o
bolo ou como ligar o forno, o processo simplesmente não funciona!
Assim como fazer um bolo, é de suma importância primeiro entender os conceitos teóricos da extração do
DNA e depois ver como funciona o passo a passo da técnica.
Atenção
Após obter a amostra, é importante atenção ao local de manipulação e ao preparo dos reagentes,
evitando contaminação por material genético de outros organismos ou por enzimas que possam
degradar o material analisado e comprometer os resultados. 
Atividade 1
O fluxo laboratorial é a sequência organizada de etapas que uma amostra percorre desde sua coleta até a
emissão do resultado final. A etapa de extração de DNA ou RNA é classificada em qual tipo de processo
dentro do fluxo laboratorial?
A Processo administrativo
B Etapa pós-analítica
C Etapa qualitativa
D Etapa diagnóstica
E Etapa pré-analítica
A alternativa E está correta.
A extração de DNA ou RNA é uma etapa que ocorre antes da análise propriamente dita. Ou seja, ela faz
parte do preparo da amostra para que o material genético esteja disponível em quantidade e qualidade
adequadas para as etapas analíticas posteriores, como PCR, sequenciamento ou hibridização. Dentro do
fluxo laboratorial, essa preparação inicial é classificada como etapa pré-analítica, pois envolve o manuseio
da amostra, isolamento de componentes específicos (como ácidos nucleicos) e garantia de integridade do
material antes que qualquer teste ou análise seja realizado.
Procedimentos de extração de DNA
Neste vídeo, detalhamos o processo de extração de DNA em tecidos, incluindo ruptura celular, uso de
detergentes, solventes orgânicos, purificação com etanol e aplicação prática do protocolo da Embrapa.
Confira!
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As células eucariontes possuem uma membrana celular, formada por uma bicamada fosfolipídica, além de
diversos elementos dispersos no citoplasma, como as proteínas, os carboidratos, as organelas, os lipídios e os
elementos minerais (sódio, potássio, magnésio, cálcio, entre outros). Além disso, a célula eucarionte também
possui uma membrana nuclear e dentro do núcleo estão as proteínas, DNA e RNA majoritariamente.
Para extrair o DNA,
precisamos separá-lo de
todos esses outros
componentes, considerados
contaminantes, incluindo o
próprio RNA. Apesar de
existirem diferentes métodos
de extração, algumas etapas
são essenciais em qualquer
protocolo.
 O primeiro passo é 
quebrar a membrana
plasmática e, se
houver, a parede
celular (como em
células vegetais e
fúngicas). Isso libera
o material genético
para posterior
purificação.
 Esse
rompimento
pode ser
feito por
diferentes
métodos,
como:
 Uso de
detergentes
que
desestabilizam
as
membranas.
Exemplo:
dodecil sulfato
de sódio
(SDS).
 
Abrasão física,
como
trituração com
gral e pistilo.
Frequente em
amostras
vegetais.
 
Enzimas
específicas
que degradam
a parede
celular.
Exemplo:
lisozima para
bactérias.
 
Pressão
osmótica, que
provoca a
ruptura celular
por variação
da
concentração
de solutos.
 
Aquecimento,
que pode
desnaturar
membranas e
facilitar a
liberação do
DNA.
Atenção
Alguns métodos agressivos de lise podem comprometer a integridade do DNA. Por exemplo, a trituração
excessiva de tecidos vegetais com gral e pistilo pode fragmentar o DNA, tornando-o inadequado para
análises de PCR de fragmentos longos. Da mesma forma, o aquecimento prolongado pode levar à
degradação do DNA, dificultando o sequenciamento. Para evitar esses problemas, é preciso escolher a
abordagem de lise mais adequada, equilibrando eficiência na extração e preservação da estrutura do
material genético. 
• 
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• 
Com o DNA exposto, é fundamental remover proteínas e RNA, pois podem interferir na análise genética. Isso é
feito por meio de:
 
Proteinases (como a proteinase K), que degradam proteínas, incluindo DNases que poderiam destruir o
DNA.
 
RNase, uma enzima que degrada o RNA, removendo essa contaminação.
 
Após eliminar proteínas e RNA, ainda restam lipídios, carboidratos e elementos minerais. O método de
remoção pode variar. Vamos conhecer a seguir as três principais formas de realizar essa etapa.
Adição de solvente orgânico
Podemos usar um solvente como o fenol ou o clorofórmio. É importante lembrar que já degradamos lipídeos e
RNA, rompemos as membranas e, se for o caso, a parede celular. Mas o que acontece?
 
O fenol ou clorofórmio tornam essas moléculas insolúveis, assim como os carboidratos e todos os elementos
minerais. Após a adição dos solventes, seguida da centrifugação, formam-se duas fases:
Fase aquosa: DNA
O DNA, por não ser solúvel em fenol ou
clorofórmio, permanece na fase aquosa
(superior).
Fase orgânica
Todos os outros elementos se transferem para
a fase orgânica (inferior), como proteínas,
lipídeos, RNA degradado, carboidratos e outros
elementos minerais solúveis em fenol/
clorofórmio.
Assim, com auxílio de uma pipeta, podemos transferir a fase aquosa com o DNA para outro tubo. O RNA
degradado se torna insolúvel, pois forma reações de complexação com outros elementos do citoplasma. Se
estiver íntegro, ele pode ir para a fase aquosa, dependendo do pH do solvente orgânico.
Solução concentrada de NaCl
O cloreto de sódio concentrado é capaz de precipitar os elementos degradados do citoplasma, deixando o
DNA íntegro na fase aquosa. Assim, basta centrifugar e remover a fase aquosa do pellet precipitado, ou seja,
recuperar apenas o sobrenadante, pois nele estão nossas substâncias de interesse.
Pellet
Pequena porção precipitada de uma solução.
Coluna de adsorção do DNA
O DNA possui carga negativa devido à presença dos grupamentos fosfato em sua estrutura. Esse princípio é
explorado para sua purificação por meio de colunas de adsorção, que contêm uma matriz carregada
positivamente, geralmente feita de sílica. Quando a amostra é adicionada à coluna e submetida à
centrifugação, o DNA liga-se à matriz devido à atração entre cargas opostas, enquanto outras moléculas e
impurezas passam pela coluna e se depositam no fundo do tubo.
 
Para recuperar o DNA retido, utiliza-se um tampão de eluição carregado negativamente, como Tris-HCl ou
EDTA, que compete com o DNA pela ligação na matriz. Como esses tampões estão presentes em alta
• 
• 
concentração, eles deslocamo DNA, que então se desprende da coluna e é coletado na solução eluída após
nova centrifugação.
Após a eluição, pode haver resíduos
indesejados na amostra. Para garantir
a pureza do DNA, utilizamos
isopropanol, que precipita
seletivamente o DNA, separando-o
dos contaminantes solúveis. Em
seguida, a amostra é centrifugada para
que o DNA precipitado concentre-se
no fundo do tubo, formando um pellet.
 Uma etapa adicional para
remover eventuais impurezas é
a lavagem do pellet com etanol
70%, que elimina os resíduos de
sais e reagentes sem dissolver o
DNA. O etanol é
cuidadosamente removido, e o
tubo pode ser deixado para
secagem por alguns minutos.
Curiosidade
O pellet fica bem aderido no fundo do tubo, mesmo lavando com etanol 70% e secando, o DNA continua
aderido ao tubo. 
A etapa final consiste na ressuspensão do DNA, ou seja, o pellet volta a ficar em solução. Para isso, basta
adicionar um pequeno volume de água ou tampão de eluição e misturar delicadamente para dissolver o DNA.
Ao final de todo o protocolo, teremos um tubo contendo apenas DNA puro, pronto para ser utilizado em
análises moleculares.
 
O processo de extração de DNA nos plasmídeos é bem semelhante ao processo geral de extração de DNA. No
entanto, depois da lise da membrana e precipitação das proteínas citoplasmáticas, é adicionada uma solução
de NaOH com pH bastante básico a ponto de desnaturar o DNA cromossomal e o também o próprio DNA
plasmidial. Em seguida, é adicionada uma solução ácida neutralizadora que regenera o DNA plasmidial, mas
não o cromossomal. Assim, podemos então separar por centrifugação, pois o DNA do plasmídeo fica em
suspensão enquanto o DNA cromossomal precipita.
Procedimento de extração de DNA em laboratório.
Agora que sabemos os princípios teóricos da extração do DNA, vamos simular uma situação em que estamos
no laboratório e temos que extrair o DNA de uma amostra coletada. Para isso, vamos utilizar o protocolo
desenvolvido pela Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) (OLIVEIRA et al., 2007).
Vamos ver se você consegue identificar e entender o passo a passo de um POP utilizado em uma situação
real. Parece desafiador, mas não se assuste, vamos juntos!
A primeira etapa é conferir todos os reagentes que vamos precisar. São eles:
Tampão de digestão. No POP da Embrapa, o tampão de digestão é formado por NaCl 100 mM; Tris-HCl
com pH 8.0 10 mM; EDTA, com pH 8.0 25 mM; SDS 0,5% (usado como detergente) e proteinase K 0,1
mg/mL.). 
 
Solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico - (25:24:1). O álcool isoamílico serve para prevenir a
formação de espuma quando a mistura é agitada, facilitando a separação da fase orgânica da aquosa. 
 
Microtubos de polipropileno; frascos e bastões esterilizados. 
 
Solução Tampão TE (tris-HCL 10 mM; EDTA 1 mM com pH 8.0; tris = hidroximetil aminometano).
Solução em que o pH permanece em determinada faixa de pH, mesmo após a adição de substâncias
ácida ou básica, a não ser que o “tamponamento” seja extrapolado). 
 
Etanol 70%; etanol absoluto; acetato de amônio 7,5 M; micropipetas de 1 mL, 200 μL, 100 μL e 10 μL. 
 
Centrífuga. 
 
Isopor com gelo. 
 
Vidraria de laboratório; banho-maria a 50 °C.
Após conferirmos todo o material, vamos começar a extração do DNA de um tecido de origem animal, e que
por isso não apresenta parede celular. 
Relembrando
A amostra depois da coleta deve ser armazenada no gelo, para manter a temperatura entre 2 °C a 8 °C. 
Vamos entender melhor o processo de extração do DNA, acompanhe!
Primeira etapa
Se o tecido for duro, devemos macerar, usando um bastão de vidro, e se tiver grande quantidade de
líquidos, a amostra deve ser centrifugada para remover o líquido em excesso. Na primeira etapa da
extração, adicionamos o tampão de digestão, na concentração de 1,2 mL de tampão para cada 100
mg de tecido.
Em seguida, devemos deixar o tubo em banho-maria a 50 °C por cerca de 8 a 16 horas, para garantir
a digestão completa das membranas plasmáticas e nucleares e proteínas. No final, o material
apresentará um aspecto viscoso. O tempo de incubação no banho-maria varia de acordo com o
tamanho da amostra.
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• 
Segunda etapa
Extraímos o DNA usando fenol e precipitação dos compostos indesejáveis. Retiramos o tubo do
banho-maria e, quando atingir 37 °C, adicionamos 5 μL de RNase e incubamos por 15 minutos com
leve agitação. A RNase é opcional e deve ser usada se o RNA for contaminante.
Em seguida, adicionamos a solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico na proporção de 1:1 com a
amostra, ou seja, para cada 500 μL de material, adicionamos 500 μL de solução de fenol. O pH do
fenol deve ser verificado: abaixo de 7,0 degrada o DNA e o faz ir para a interface entre as fases,
adequado para extração de RNA. Para DNA, o pH do fenol deve ser em torno de 7.0, e para RNA, entre
4,5 e 5,5.
Após adicionar o fenol, homogeneizamos e centrifugamos o tubo por 10 minutos a 1.700 g. Com as
fases aquosa e orgânica bem separadas, retiramos a fase aquosa contendo o DNA e descartamos a
fase orgânica. É importante separar bem as fases, já que o fenol pode ser contaminante, então
recomendamos centrifugar duas vezes.
Terceira etapa
Realizamos a purificação do DNA por meio da precipitação com etanol. Antes de usarmos o etanol em
si, adicionamos meio volume de acetato de amônio 7,5 M e dois volumes de etanol absoluto.
Nesse POP da Embrapa, o etanol é utilizado como agente precipitante do DNA, entretanto poderíamos utilizar
o isopropanol também.
 
O acetato de amônio facilita a precipitação do DNA pelo etanol e o etanol absoluto, além de concentrar o DNA,
também ajuda a remover os resíduos remanescentes de fenol e clorofórmio. Centrifugamos a amostra a 1.700
g por cerca de dois minutos. Após a centrifugação, será possível visualizar o pellet bem aderido ao fundo do
tubo. Removemos toda a solução alcoólica e depois vamos ressuspender o pellet em etanol 70%. Depois,
centrifugamos novamente a 1.700 g por dois minutos e tiramos o sobrenadante (uma dica é deixar o tubo
aberto por um tempo, para o etanol evaporar por inteiro). Agora com o pellet limpo, a fase final é a adição do
tampão TE, para facilitar a dissolução do DNA, ou ainda podemos deixar o tubo em banho-maria a 50°C por
algumas horas.
 
Vale lembrar que, nesse exemplo, estamos extraindo o DNA a partir de amostras de tecidos. No entanto,
existem variações do protocolo. Mesmo que a amostra também seja proveniente de tecido, o protocolo pode
ser modificado, com a utilização de outros reagentes. Entretanto, esse é o procedimento básico e, em geral,
usado em laboratórios para extração de DNA.
Comentário
A unidade de volume padroniza as quantidades em qualquer sistema. Por exemplo, considerando 500 μL
de fase aquosa, meio volume equivale a 250 μL e dois volumes a 1.000 μL. 
Vamos agora relembrar o passo a passo do processo de extração de DNA.
1 Rompimento das membranas
Quebra da parede celular (se houver), membrana plasmática e membrana nuclear.
 
Métodos: detergentes, abrasão física, enzimas, pressão osmótica ou aquecimento.
2
Desnaturação de proteínas e remoção de RNA
Adição de proteinase K para degradar proteínas.
 
Adição de RNase para eliminar o RNA contaminante.
3
Separação do DNA de outros componentes celulares
Método com solventes orgânicos (fenol/clorofórmio): separa o DNA na fase aquosa.
 
Solução de NaCl concentrado: precipita contaminantes deixando o DNA na fase líquida.
 
Coluna de adsorção: retém o DNA carregado negativamente, promovendo a purificação.
4
Precipitação e purificação do DNA
Isopropanol ou etanol absoluto: precipita o DNA.
 
Centrifugação para formar o pellet de DNA.
 
Lavagem com etanol 70% para remover impurezas.
5
Ressuspensão do DNA
Pode ser ressuspendido em água ou tampão de eluição (Tris-HCl ou EDTA).
 
E assim obtemos DNA puro, pronto para as análises!
Atividade 2
Após a coleta das amostras para extração de DNA e RNA, vários cuidados devem ser tomados para garantir a
qualidade do material genético extraído.Considerando a importância de seguir os procedimentos
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corretamente, qual das alternativas a seguir é a mais adequada para manter a integridade do material
genético durante o processo de extração?
A
A utilização de reagentes de extração de DNA e RNA não precisa ser específica para cada tipo de
amostra, pois os procedimentos são generalistas e funcionam bem para diferentes tipos de material
biológico.
B
A manipulação das amostras em ambientes não estéreis pode ser realizada desde que se siga
rigorosamente o procedimento operacional padrão (POP), responsável por compensar a ausência de
controle ambiental.
C
A preparação e o manuseio das amostras devem ser feitas sempre em locais controlados e livres de
contaminantes, com equipamentos adequados e reagentes preparados para evitar degradação do
material genético, como a ação de RNases e DNases.
DA extração de RNA pode ser feita sem a necessidade de inibidores de RNases, desde que a etapa de
purificação posterior remova qualquer resíduo que possa interferir nas análises subsequentes.
E
A escolha de reagentes e instrumentos de uso comum, sem a necessidade de controle rigoroso de
qualidade, pode ser suficiente para a extração do material genético, uma vez que a experiência do
pesquisador garante a qualidade do resultado.
A alternativa C está correta.
A manipulação de amostras em locais controlados e com equipamentos e reagentes adequados é
fundamental para preservar a integridade do material genético durante a extração. A presença de RNases e
DNases podem degradar rapidamente o RNA e DNA, comprometendo as análises subsequentes. A
alternativa A está incorreta, pois reagentes devem ser específicos para cada tipo de amostra para garantir
uma extração eficiente. A alternativa B também está equivocada, uma vez que a contaminação do ambiente
pode afetar seriamente a qualidade do material genético. A alternativa D está incorreta porque a utilização
de inibidores de RNases é importante na extração de RNA para evitar a degradação. Por fim, a alternativa E
falha ao subestimar a importância do controle de qualidade nos reagentes e instrumentos.
Procedimentos de extração de RNA
Neste vídeo, vamos apresentar as etapas da extração de RNA, destacando cuidados com RNases, uso de
fenol/clorofórmio, centrifugação, formação do pellet, e diferenças entre os protocolos de DNA e RNA. Assista!
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O procedimento de extração de RNA é bem parecido com o método de extração de DNA, mesmo o RNA sendo
mais frágil e demandando mais cuidados. Todo material que entra em contato com a amostra deve ser tratado
com soluções neutralizadoras de RNase e possuir a característica de ser RNase free. A amostra deve sempre
ser refrigerada em nitrogênio líquido ou gelo para evitar a ação de alguma RNase remanescente.
Vamos agora rever as três fases do protocolo de extração de DNA, ressaltando quais são as diferenças entre a
extração do DNA e RNA.
Fase 1
Quebra da membrana: a quebra pode ser feita de forma mecânica ao invés de utilizar o tampão de
digestão, usando um pistilo, bastão ou sonicador, aparelho capaz de utilizar energia das ondas
sonoras para agitar partículas. Esta técnica apresenta uma vantagem: por ser mais rápida, diminui a
chance de degradação do RNA.
Fase 2
Extração do RNA: não são utilizadas as RNases. A solução de fenol/clorofórmio na extração de RNA
deve ter pH ácido (entre 4,5 e 5,5) para que o RNA fique na fase aquosa e o DNA fique na interface
(essa fase intermediária só é formada durante a extração do RNA devido ao pH ácido).
Fase 3
Purificação do RNA: é muito parecida com a do DNA, a diferença está no armazenamento: para RNA é
preferível utilizar nitrogênio líquido.
A seguir, apresentamos o passo a passo da extração e purificação de material genético.
Extração de DNA/RNA
Amostra inicial com as células digeridas.
Adição de solução fenol/clorofórmio
Centrifugação da amostra, formando duas fases: orgânica (em amarelo no
fundo do tubo) e aquosa (em azul acima da fase orgânica). No tubo A, temos
DNA e RNA dissolvidos na fase aquosa e no tubo B o DNA degradado fica na
interface.
Separação da fase orgânica por centrifugação
A fase orgânica é descartada, permanecendo apenas a fase aquosa no tubo.
Adição de acetato de amônio e etanol absoluto
Após centrifugar, ocorre a formação de um pellet no fundo do tubo. Todo o
líquido restante é descartado.
Ressuspensão e armazenamento do material genético extraído
O pellet é ressuspendido em tampão TE e agora o DNA ou RNA pode ser
armazenado.
Atividade 3
Durante a extração de RNA, a solução de fenol/clorofórmio é usada para separar o RNA e o DNA.
Considerando as fases do protocolo e a importância do pH, qual das alternativas a seguir descreve
corretamente o processo de separação do RNA e do DNA?
ADurante a extração de RNA, a solução de fenol/clorofórmio deve ter pH alcalino para que o RNA fique na
fase orgânica e o DNA na fase aquosa, sendo ambos separados após a centrifugação.
BA solução de fenol/clorofórmio utilizada na extração de RNA deve ter pH neutro para garantir que tanto o
RNA quanto o DNA fiquem na fase aquosa, sendo posteriormente separados por centrifugação.
C O pH da solução de fenol/clorofórmio não influencia a separação do RNA e do DNA, uma vez que ambos
os materiais genéticos ficam na fase aquosa após a centrifugação.
D
Durante a extração de RNA, a solução de fenol/clorofórmio deve ter pH ácido (entre 4,5 e 5,5), o que
garante que o RNA fique na fase aquosa e o DNA se localize na interface, com a fase orgânica sendo
descartada.
E
Durante a extração de RNA, a solução de fenol/clorofórmio deve ter pH básico para garantir a separação
adequada do RNA e DNA, com ambos permanecendo na fase aquosa, em que o RNA pode ser
recuperado.
A alternativa D está correta.
Na extração de RNA, o pH ácido da solução de fenol/clorofórmio (geralmente entre 4,5 e 5,5) é essencial
para a separação eficiente entre RNA e DNA. Nessas condições, o RNA permanece solúvel na fase aquosa,
enquanto o DNA, menos solúvel em pH ácido, precipita e se acumula na interface entre as fases aquosa e
orgânica. Dessa forma, o RNA pode ser recuperado de forma mais pura após a centrifugação, descartando
a fase orgânica e a interface contendo o DNA.
Armazenamento do DNA e do RNA purificados
Neste vídeo, explicamos como armazenar DNA e RNA purificados, tratando dos tipos de tubos, tampões,
temperaturas ideais, riscos de degradação por cristais e RNases, e do papel do etanol no RNA. Assista!
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Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.
Após o isolamento (purificação), o DNA e o RNA precisam receber cuidados imediatos. Para o DNA, devemos
armazená-lo em um tubo de plástico (DNA tem afinidade por vidro, por isso o uso de tubos de plástico),
preferencialmente de propileno, vedado a fim de evitar evaporação, em uma temperatura abaixo de 0 °C.
Dessa forma, diminuímos a atividade biológica das DNases.
O DNA purificado é mantido em solução tampão tris-EDTA, com pH 7,2. A validade do DNA nessas condições,
é bastante alta. Confira!
Propileno
Tipo de polímero que não interage com o DNA.
Temperatura Duração
Temperatura ambiente Até 26 semanas
Temperaturas baixas de 2 °C a 8 °C 1 ano
Congelado a -20 °C 7 anos
Congelado a -70 °C + 7 anos
Eldio Santos.
O DNA purificado é bastante resistente, uma vez que a sua solução não contenha água, pois a água quando
congela forma cristais que podem danificar os materiais orgânicos.
 
Após a extração do RNA, o material genético é precipitado utilizando etanol a 70%, o qual ajuda a concentrar o
RNA e a protegê-lo de agentes degradantes. Para ter certeza de que não haja degradação durante o
armazenamento, o RNA deve ser mantido em tubos plásticos estéreis, preferencialmente de plástico RNase-
free, ou tratados com uma solução de dietilpirocarbonato (DEPC) para eliminar qualquer traço de RNase.
Essas precauções evitam a quebra do RNA, mantendo sua integridade ao longo dotempo.
 
Confira a seguir as condições de armazenamento para RNA purificado, considerando temperatura, duração e
observações para manter a estabilidade das amostras.
Temperatura Duração Observações
-20 °C Até 2 meses
RNA pode manter integridade, mas ainda há atividade de
RNases.
-70 °C ou
inferior
Longo
prazo,
por anos
Evita a degradação por RNases.
Nathalia Martins.
O etanol auxilia na precipitação do RNA, ajudando a concentrá-lo. Dessa forma, o RNA fica menos suscetível a
agentes degradantes.
Atividade 4
Após a purificação, o armazenamento adequado dos ácidos nucleicos é fundamental para preservar sua
integridade ao longo do tempo. Qual das opções apresenta uma prática adequada para o armazenamento de
DNA ou RNA purificados?
A Utilizar tubos de plástico estéril para conservar DNA e RNA. 
B Armazenar o RNA diretamente em água destilada, em temperatura ambiente.
C Manter o DNA em tubos de vidro para evitar contaminação por plásticos.
D Conservar o DNA e o RNA em solução salina a temperatura ambiente.
E Guardar o RNA seco, em papel filtro, em refrigerador comum.
A alternativa A está correta.
Tanto o DNA quanto o RNA devem ser armazenados em tubos de plástico estéril, livres preferencialmente
de RNases no caso do RNA. O uso de tubos de vidro não é recomendado, especialmente para o DNA,
devido à sua afinidade com superfícies de vidro, o que pode causar perdas. Além disso, a presença de
água, temperaturas inadequadas e recipientes não apropriados comprometem a estabilidade e a
integridade dos ácidos nucleicos. O uso de tubos apropriados e o armazenamento sob condições
controladas são práticas fundamentais para a conservação dessas moléculas.
Quantificação, análise de pureza e integridade do material
Neste vídeo, vamos explicar como avaliar DNA/RNA extraídos por meio da quantificação por fluorimetria,
análise de pureza por espectrofotometria e verificação da integridade por eletroforese, além da síntese de
cDNA. Não perca!
Conteúdo interativo
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A extração do DNA/RNA é sem nenhuma dúvida um dos processos mais importantes da biologia molecular,
pois esses materiais servem de matéria-prima para diversas outras técnicas da biologia molecular, como a
reação da cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento, clonagem, hibridização, entre outras. Uma boa
extração determina a qualidade do resultado dessas técnicas. O controle de qualidade da extração é dado
pela quantificação, pureza e integridade desses materiais.
Vamos entender melhor esses procedimentos.
Quantificação
Determinamos a quantidade de DNA/RNA extraído da amostra inicial na quantificação. A técnica mais utilizada
é a fluorometria, na qual uma pequena alíquota da amostra é transferida para outro tubo, onde é adicionada
uma solução e um agente fluorescente capaz de se ligar entre as bases do DNA e RNA.
Quando o agente fluorescente (fluoróforo) se liga a algo (DNA ou RNA), ele emite fluorescência e assim
podemos medir, com ajuda de um aparelho (fluorímetro), a quantidade de fluorescência da amostra.
A quantidade de fluorescência da amostra é diretamente proporcional, ou seja, quanto maior for a
fluorescência, maior é a quantidade de DNA ou RNA.
Uma vantagem da fluorometria é que ela é simples e, após a quantificação, sabemos se temos a quantidade
de material suficiente para as próximas etapas. Além disso, podemos utilizar diferentes agentes fluorescentes:
um específico para DNA e outro específico para RNA. Assim, podemos quantificar o quanto temos de cada um
desses materiais moleculares.
Quantificação do DNA fluorescente. Na imagem, temos o gráfico de duas amostras
de DNA diferentes.
Pureza
Em relação à pureza, podemos avaliar se um DNA ou RNA apresenta contaminantes. A pergunta aqui é: será
que com o material extraído temos também fenol, álcool, proteínas, RNA (quando o desejo é DNA) e algum
reagente residual? Para essa análise, a técnica mais utilizada é a espectrofotometria.
Antes de entender a técnica, é importante lembrar que luz visível é uma pequena parte de todo o espectro de
radiação eletromagnética existente, compreendendo comprimentos de onda entre 380-750 nm. Os
comprimentos de ondas inferiores estão na zona de espectro da ultravioleta (UV) e superiores na zona de
infravermelho. Quando uma luz branca passa por um prisma, ela se decompõe em raios de luz de diferentes
comprimentos de onda, variando do vermelho ao violeta. Em um arco-íris, por exemplo, enxergamos 7
diferentes cores, cada uma dessas cores representa uma diferente faixa de comprimento de onda.
Comprimento de onda no espectro da luz.
É importante relembrar que todo o composto químico apresenta a capacidade de absorver, transmitir ou
refletir a luz em determinado comprimento de onda.
Assim, a espectrofotometria tem como princípio básico utilizar a capacidade das moléculas orgânicas de
absorverem (absorbância) ou transmitir (transmitância) luz em determinado comprimento de onda, em um
equipamento chamado de espectrofotômetro.
A partir dela, podemos identificar os componentes em uma solução, pois as biomoléculas apresentam
espectros característicos ao UV, visível ou infravermelho.
Exemplo
Já é estabelecido que as proteínas absorvem comprimentos de onda de 280 nm; o RNA e DNA absorvem
no comprimento de onda de 260 nm e o fenol e outros constituintes no comprimento de onda de 230
nm. 
Além da possibilidade de indicar a biomolécula presente, podemos quantificá-la. Na prática, a quantidade de
luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da substância, assim, quanto maior for a
concentração, maior é a absorção de luz (medido pela densidade óptica – OD).
 
Confira o passo a passo para a realização dessa técnica.
Etapa 1 
Precisamos indicar para o aparelho onde nossa amostra está diluída, em um procedimento parecido
com a tara da balança. Para isso, apenas o tampão usado na extração é colocado em uma cubeta
transparente e limpa, e no aparelho, ajustamos o comprimento de onda desejado.
Etapa 2
Quando a luz incide na cubeta, apenas uma quantidade consegue ultrapassar a amostra e o aparelho
consegue quantificar a luz que é absorvida (absorbância) e isso gera um valor.
Etapa 3
Como nesse momento apenas temos o tampão, informamos ao aparelho que esse é nosso controle e
que essa leitura não deve ser considerada, zerando o aparelho.
Etapa 4
Colocamos a amostra com o material purificado em outra cubeta transparente e limpa, e medimos a
luz absorvida, que representa a quantidade da substância analisada.
Lembre-se de que isso depende do comprimento de onda que estamos pesquisando (280 nm, 260 nm ou 230
nm). Novamente, aqui, quanto maior for a absorção de luz, maior a quantidade de determinado material.
A seguir, vemos um resultado de uma análise espectrofotométrica, mostrando um pico de absorção da luz no
comprimento de onda 260 nm, o que indica a presença de DNA ou RNA.
Gráfico: Resultado de uma análise de espectrofotometria.
Com os resultados, podemos verificar a pureza a partir da razão (divisão) da densidade óptica (OD) no
comprimento de onda 260 nm pela OD no comprimento de onda 280 nm.
Dizemos que o material genético está puro quando essa relação é maior ou igual a 1,8. Valores inferiores a
esse indicam contaminação com proteínas e que o processo extrativo não foi realizado de forma correta.
Outra forma de verificar essa pureza seria pela razão entre a OD 260 nm e OD 230 nm, com material genético
considerado puro quando estiver na faixa entre 1,8-2,2.
Integridade
Avalia se o DNA/RNA extraído está íntegro. Essa avaliação é feita a partir da eletroforese, técnica com uma
enorme quantidade de variações e desdobramentos, utilizada para os mais variados objetivos. Aqui iremos
nos ater ao princípio básico da técnica e a sua aplicação no controle da integridade do material que foi
extraído.
Esta técnica consiste na migração e separação de moléculas de acordo com a carga após a geração de um
campo elétrico. Ela utiliza diferentes meios de suporte, como fitas ou membranas de