ROTEIRO DE AULA

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 FACULDADE DE INHUMAS		
	ROTEIRO DE AULA	
Pipetagem
OBJETIVOS: 
- Executar corretamente a operação de pipetagem, utilizando pipetas de diferentes volumes. 
- Manipular com segurança o pipetador ou pêra de borracha. 
- Efetuar diluições utilizando pipeta volumétrica e balão volumétrico
MATERIAIS:
- Béquer
-1 pipeta graduada de 5mL.
- 1 pera de borracha.
- 1 proveta
-Água.
-Solução de permanganato de Potássio 0,1N
-Tubos de ensaio
-Estante para tubo de ensaio
-Espectrofotômetro
-Cubeta.
METODOLOGIA 1: pipetagem
1. Transferir 250mL de água para um béquer.
2. Acoplar a pera de borracha na pipeta graduada.
3. Pipetar 4 ml de água em no tubo 1
4. Pipetar 3 ml de agua no tubo 2
5. Pipetar 5 ml de água no tubo 3.
METODOLOGIA 2: Curva de calibração
1. Em tubos de ensaio identificar de 1 à 5.
2. Para cada tubo transferir 1mL de água. 
3. Após isso, adicionar no tubo identificado com o número 1, 1mL da solução de permanganato de Potássio 0,1N.
4. Após, transferir 1mL das solução do tubo 1 para o tubo 2.
5. Após, transferir 1mL da solução tubo 2 para o tubo 3. 
6. Assim sucessivamente, ate que no tubo 5 fique com 2 ml
7. Leitura no espectrofotômetro. 
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DOSAGEM DE GLICEMIA DE JEJUM (Kit Bioclin)
· PRINCÍPIO:
Para a realização do exame de glicemia de jejum, utiliza-se uma amostra de soro e o kit correspondente. A técnica aplicada baseia-se no método colorimétrico enzimático (leitura de absorbância em espectrofotômetro).
Os valores de referência para glicemia de jejum estão entre 60 a 99 mg/dL. Valores menores indicam um quadro agudo de hipoglicemia. Valores maiores podem indicar um pré-diabetes ou até mesmo um diabetes.
Enzimática Colorimétrica - GOD - PAP. A Glicose é oxidada enzimaticamente pela Glicose Oxidase (GOD) de acordo com a seguinte reação: 
O Peróxido de Hidrogênio, em presença da Peroxidase (POD) reage com a 4 - Aminoantipirina e Fenol, formando um cromógeno vermelho cereja cuja intensidade de cor é proporcional à concentração de Glicose.
REAGENTES:
- Reagente enzimático (R1)
- Reagente padrão (R2)
AMOSTRA:
-A amostra de sangue deve ser obtida após o jejum de no mínimo 8 horas ou de acordo com as recomendações do médico.
 
METODOLOGIA:
1. Após a coleta de sangue do paciente colocar a amostra para centrifugar.
2. E em 3 tubos de ensaio marcar com os seguintes nome: B ( Branco), P (padrão) e A (amostra).
3. Pipetar conforme descrito na tabela abaixo
4. Homogeneizar bem.
5. Colocar os tubos em banho-maria a 37ºC durante 10 minutos.
6. Zerar o equipamento com o Branco.
7. Ler e anotar a absorbância da amostra e do padrão em 505 nm.
8. CÁLCULO:
9. Valores de referência para diagnóstico de diabete.
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DOSAGEM DE URÉIA
· PRÍNCIPIO
A uréia é hidrolisada pela urease, gerando amônia e dióxido de carbono.
		 Urease
Uréia + H2O			2 NH3 + CO2
A amônia reage com o 2 cetoglutarato e NADH em uma reação catalisada pela glutamato desidrogenase (GLDH), ocorrendo oxidação da NADH a NAD. A consequente redução da absorbância, medida em 340 ou 365 nm, é proporcional à concentração de uréia na amostra.
					GLDH
2 cetoglutarato + NH3 + NADH			 L-Glutamato + NAD
· AMOSTRA
Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas.
Tipos de amostra
Usar soro ou plasma (fluoreto, heparina, EDTA) e urina. 
Não usar anticoagulantes contendo amônia. A concentração de fluoreto na amostra não deve ser maior que 3 mg/mL, pois o fluoreto em altas doses é inibidor da urease. O uso do anticoagulante Glistab (Labtest Cat. 29) permite a colheita de uma só amostra para as dosagens de uréia, glicose e creatinina.
A urina de 24 horas deve ser colhida em frasco contendo 2,0 mL de HCl a 50% (V/V) e centrifugada antes de usar.
· REAGENTES:
1- Padrão - Contém uréia 70 mg/dLe azida sódica 7,7 mmol/L. 
2- Tampão - Contém tampão fosfato 100 mmol/L pH 6,9, salicilato de sódio 312 mmol/Le nitroprussiato de sódio 16,8 mmol/L. 
3- Urease - Contém urease 268 KU/L em tampão fosfato 10 mmol/L – Armazenar 2-8ºC.
· METODOLOGIA
1. Identificar 3 tubos de ensaios “Branco”, Teste e padrão e proceder:
	TUBOS
	BRANCO
	TESTE
	PADRÃO
	Amostra
	 ----------
	10µL
	 ----------
	Padrão (1)
	 ----------
	 ----------
	10µL
	Urease Tamponada 
	1000µL
	1000µL
	1000µL
2. Homogeneizar e incubar os tubos por 5 minutos a 37ºC.
3. Leitura realizada no espectro, zerando o aparelho com o branco em 600nm.
· CÁLCULOS:
Como a metodologia obedece à lei de Lambert-Beer, pode-se efetuar os cálculos através do 
· Fator de Calibração (FC).
· CP= Concentração do Padrão = 70 mg/Dl
· CT= Concentração do Teste em mg/dL
FC = CP÷AP
CT= FC x AT
· VALORES REFERENCIAS
· 
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Quantificação de colesterol.
· Principio da técnica:
Os ésteres do colesterol são hidrolisados pela colesterol esterase (CHE) formando colesterol livre que após oxidação pela colesterol oxidase (CHOD) forma peróxido de hidrogênio. Este, reagindo com o fenol e 4- aminoantipirina, através de copulação oxidativa catalisada pela peroxidase (POD), produz uma quinonimina de cor vermelha. A absorbância do complexo formado, medida em 500 nm, é diretamente proporcional à concentração de colesterol da amostra. 
· Amostra: Soro ou plasma.
· Metodologia
1. Leitura em espectrofotômetro 
Comprimento de onda: 500 nm. 
Cubeta: 1cm. 
Temperatura: 37°C.
2. Reagentes
Reagente de cor; Padrão de Colesterol 200 mg/dL. 
3. Procedimento
 	Aguardar os reagentes atingirem temperatura ambiente.
	Tubos
	Reagentes Branco (RB)
	Padrão/ Amostra
	Padrão/ Amostra
	Sobrenadante
	---
	100µl
	---
	Padrão de colesterol 
	---
	---
	100µl
	Reagente de cor
	1000µl
	1000µl
	1000µl
Homogeneizar gentilmente e incubar por 10 minutos em banho-maria 37°C.
Ler a absorbância do Padrão (P) e das amostras em 500nm.
4. Cálculo dos Resultados
CP= 40 mg/dL= Concentração Equivalente indicada no rótulo do frasco.
CT= Concentração do Teste
AP= Absorbância do Padrão
AT= Absorbância do Teste
FC = CP ÷AP
CT(mg/dL) = FC x AT
5.Valores recomendados:
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DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS:
· Princípio da técnica:
As ligações peptídicas das proteínas (-HN-CO-) reagem com ions cúpricos em meio alcalino (Reagente do Biureto) formando um complexo de coloração violeta, cuja absorbância medida em 545 nm é diretamente proporcional à concentração de proteínas na amostra.
· Amostras: Soro ou plasma.
· Metodologia
1. Leitura em espectrofotômetro
Comprimento de onda: 545 nm.
Cubeta: 1cm.
Temperatura: Ambiente.
2. Reagentes
Padrão: Contém albumina bovina
Biureto: Contém acetato de cobre 6 mmol/L, iodeto de potássio 12
mmol/L, hidróxido de sódio 1,15 mol/L e lauril sulfato de sódio 1g/L.
3. Procedimento
1. Pipetar:
	Tubos
	Branco
	Teste
	Padrão
	Água destilada
	20µl
	---
	---
	Amostra
	---
	20µl
	---
	Padrão (1)
	---
	---
	20µl
	Biureto 
	1000µl
	1000µl
	1000µl
2. Agitar bem e deixar os tubos durante 10 minutos na temperatura
ambiente.
3. Ler a absorbância do padrão (Ap) e do teste (At) zerando o aparelho
com o Branco em 545 nm.
4. A cor é estável durante 2 horas.
. 
· Cálculo dos Resultados
Concentração do Padrão = Cp (4,0g/dL)
Absorbância do Padrão = Ap
Concentração do Teste = Ct
Absorbância do Teste = At
Fc=
Ct= FC x At 
· Valores de referência.
Soro: 6,4 a 8,3 g/dL = 64 a 83 g/L 
Plasma: 6,8 a 8,3 g/dL = 68 a 83 g/Lv
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Determinação das transaminases (TGO)
· Principio da técnica
Determinação cinética (UV) da AST, segundo a reação:
 L-Aspartato + -Cetoglutarato Oxaloacetato + L-Glutamato 
Oxaloacetato + NADH + H+ L-Malato + NAD+ 
· A AST catalisa a transferência de grupos Amina do Aspartato para o - Cetoglutarato, levando à formação de Glutamato e Oxalacetato. O Oxalacetato em presença do MDH reage com o NADH, reduzindo-se a Malato e o NADH oxida-se a NAD+. A velocidade de oxidação é proporcional à atividade da AST na amostra.
· Amostra: Soro ou plasma (EDTAou Heparina) livres de hemólise.
A amostra deve ser protegida da luz. O analito é estável 03 dias quando a amostra armazenada entre 2 e 8°C e protegida da luz.
· Materiais e métodos: 
Tubos de Ensaio
Relógio / Cronômetro
Pipeta de 1000 µL
 Pipeta de 100 µL
Caneta para Marcação dos Tubos
Ponteiras 100 - 1000µL
Descarte para Ponteiras
Descarte para Tubos
Estante para Tubo de Ensaio
Kit para determinação da Transaminases (AST - TGO);
Reagente Nº 1 - Substrato - Conservar entre 2 e 8ºC. Contém: Tampão Tris (pH 7,8), LDH, MDH, L-Aspartato, Azida Sódica, e estabilizante.
Reagente Nº 2 - Coenzima - Conservar entre 2 e 8ºC. Contém: Alfa-Cetoglutarato, NADH, Azida Sódica e estabilizante. 
 Preparo do Reagente de trabalho: Misturar 4 partes do Reagente Nº 1 com 1 parte do Reagente Nº 2. O Reagente de Trabalho é estável 72 horas entre 15 e 30ºC e 14 dias entre 2 e 8ºC.
· Metodologia
1) Adicionar 100µl de amostra em 1 ml do reagente de trabalho
2) Misturar
3) Transferir um tubo adicionar ao banho Maria a 37°C por 1 minuto.
4) Fazer a leitura inicial (340nm), disparando simultaneamente o cronômetro, marcar 1, 2 e 3 minutos e anotar os valores.
5) Repetir por 3 vezes a leitura e Calcular a média (A/min) 
· Cálculo:
 ST (U/L) 340 nm = A/min. x 1746
Os resultados serão expressos em U/L.
ROTEIRO DE AULA PRATICA
Determinação da Transaminases ALT (TGP) Cinética
· Principio da técnica
Determinação cinética ( UV ) da ALT, segundo a reação:
 L - Alanina + - Cetoglutarato Piruvato + L – Glutamato
 Piruvato + NADH + H+ L - Lactato + NAD +
· A ALT catalisa a transferência do grupamento Amina da Alanina para - Cetoglutarato,
levando à formação de Piruvato e Glutamato. O Piruvato em presença do LDH reage com o NADH, reduzindo-se a Lactato e o NADH oxida-se a NAD+. A velocidade de oxidação é proporcional à atividade da ALT na amostra
· Amostra: Soro ou plasma (EDTA ou Heparina) livres de hemólise. A amostra deve ser protegida da luz. O analito é estável 03 dias quando a amostra armazenada entre 2 e 8°C e protegida da luz.
· Materiais 
Tubos de Ensaio
 Relógio / Cronômetro
Pipeta de 1000 µL
Pipeta de 100 µL
Caneta para Marcação dos Tubos
Ponteiras 100 - 1000µL
Descarte para Ponteiras
Descarte para Tubos
Estante para Tubo de Ensaio
Kit para determinação das transaminases (ALT) Bioclin;(TGP)
· Metodologia
Preparo do Reagente de trabalho: Misturar 4 partes do Reagente Nº 1 com 1 parte do Reagente Nº 2. O Reagente de Trabalho é estável 72 horas entre 15 e 30ºC e 14 dias entre 2 e 8ºC.
1) Adicionar 100 µL de Amostra a 1,0 mL do Reagente de Trabalho.
2) Misturar 30 segundos 
3) Transferir para tubo termostatizada à 37ºC e esperar 1 minuto. 
4) Fazer a leitura inicial, disparando simultaneamente o cronômetro. 
5) Repetir as leituras após 1, 2 e 3 minutos.
· Cálculo
	ALT (U/L) 340 nm = A/min. x 1746
				
ROTEIRO DE AULA
Determinação das atividades da Lipase
· Principio da técnica.
A Lipase atua hidrolisando os ésteres de Glicerol de Ácidos Graxos de cadeias longas (Triacilgliceróis) em Diglicerídeos, Monoglicerídeos e Ácidos Graxos livres. Durante a reação o substrato, em meio tamponado e estabilizado, adquire uma forma emulsificada (micelas) formando interfaces (lípídes-água) necessárias a ação da Lipase que em presença do Ácido Ditionitrobenzóico (DTNB) forma um cromógeno de cor amarela sendo proporcional à atividade da Lipase no soro.
· Amostra: Soro ou plasma (EDTA ou Heparina) livres de hemólise. A amostra deve ser protegida da luz. O analito é estável 03 dias quando a amostra armazenada entre 2 e 8°C e protegida da luz.
· Materiais 
Tubos de Ensaio
Equipamento Semi-Automático de Análise Bioquímica
Pipeta de 1000 µL
Pipeta de 50 µL
Caneta para Marcação dos Tubos
Ponteiras 50 - 1000µL
 Banho Maria
Centrífuga 50mL 
Água destilada 
Descarte para Ponteiras 
Descarte para Tubos 
Estante para Tubo de Ensaio
Kit para determinação da Lipase; 
 Água Destilada.
· Metodologia
Rotular 2 tubos de ensaio com as letras C (Controle) A (Amostra ). 
Seguir as orientações conforme descrito na tabela:
	
	C
	A
	Reagente n°1
	1000µL
	1000µL
	Amostra
	50µL
	50µL
	Reagente n°2
	--------
	50µL
	Reagente n°3
	100µL
	100µL
Colocar os tubos em banho-maria a 37ºC por 2 minutos para equilibrar a temperatura. Em seguida adicionar:
	
	C
	A
	Reagente n°4
	----------
	0,1mL
Homogeneizar e incubar a 37ºC por exatamente 30 minutos. Em seguida adicionar:
 
	
	C
	A
	Reagente n° 5
	1000µL
	1000µL
Homogeneizar bem e deixar em repouso por 3 minutos a temperatura ambiente.
Transferir os conteúdos dos tubos Controle e Amostra para 2 tubos de centrifugação.
Centrifugar a 3.500 rpm por 5 minutos.
 Transferir os sobrenadantes límpidos para cubetas secas do colorímetro ou do espectrofotômetro e determinar as absorbâncias dos tubos.
Controle e Amostra em 410 nm (400 - 415 nm), acertando o zero com água destilada ou deionizada. A cor formada é estável por 30 minutos.