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INTRODUÇÃO E FILOSOFIA DE TRABALHO o hemograma é o exame que avalia quantitativa e qualitativa- mente os elementos celulares do sangue. É o exame complementar mais requerido nas consultas, fazendo parte de todas as revisões de saúde. Levantamentos feitos pelo autor evidenciaram repetidamente sua presença na lista de exames em cerca de 48% dos pacientes que coletaram sangue no laboratório. Essa preferência universal denota que o hemograma, além de fundamental na triagem de saúde, é co- adjuvante indispensável no diagnóstico e no controle evolutivo das doenças infecciosas, das doenças crônicas em geral, das emergências médicas, cirúrgicas e traumatológicas, e no acompanhamento de qui- mio e radioterapia, relacionando-se com toda a Patologia. Além disso, o hemograma é a Hematologia. O autor, com consul- tório de hematologia clínica anexo ao laboratório, sempre fez o hemo- grama contemporaneamente às consultas; com a tecnologia atual, em minutos. Inúmeras vezes, fez o diagnóstico pelo resultado do hemo- grama antes de questionar e examinar o paciente. Dispondo-se de facilidades para esse procedimento, uma longa elaboração diagnós- tica é abortada por um relance ao monitor do contador eletrônico, complementado ou não por um minuto de microscopia. A história e o exame físico, direcionados pela hipótese fundamentada, tornam-se rápidos e eficientes. Outros exames, se necessários, são escolhidos dentre os exatamente apropriados ao caso e geralmente feitos com o sangue já coletado; não há perda de tempo nem despesas inúteis. O paciente passa uma hora no consultório e, já da primeira consulta, e tendo gasto apenas com exames específicos para o caso,retorna para. casa com o diagnóstico e o tratamento. No caso de tratar-se de uma 22 Renato Foilace & cols. hemopatia séria, sai, no ato, com pedido de internação no hospital escolhido; quando as alterações hematológicas causais da consulta confirmarem-se decorrentes de doença de outra especialidade, é de- volvido com um laudo ao colega que o enviou ou aos especialistas apropriados. Essa prática simplista de hemograma no ato, tão gratificante, econômica e difícil de se igualar em outras especialidades, pois em nenhuma a biópsia é tão pouco invasiva e o exame tão rápido, deve ser feita com especial atenção, já que o hemo grama varia com a hora e com as condições da coleta, discutidas na p. 28. O hemograma atual é feito em contadores eletrônicos, que aspi- ram o sangue e fazem automaticamente todas as determinações em múltiplos canais. As câmaras para contagem de glóbulos ao micros- cópio, a centrífuga de hematócrito, o colorímetro para hemoglobina, mesmo os contadores eletrônicos com um só canal de contagem e diluição externa do sangue a examinar são peças históricas, relegadas ao museu do laboratório. Apesar da generalização da tecnologia eletrônica, ainda há sig- nificativa variação interlaboratorial, pois o hemo grama depende da qualidade do equipamento, do grau de especialização do pessoal téc- nico, da filosofia de trabalho do laboratório e das tradições locais. Pode variar até por decisões político-econômicas, de acordo com a procedência das requisições: em uma instituição fechada, pode haver um hemograma para o corpo clínico (p. ex., apenas o laudo original da máquina eletrônica) e outro para pacientes e médicos de fora da instituição. Para interpretar o hemograma, há necessidade do conhe- cimento da tecnologia empregada, dos parâmetros" fornecidos, da maneira de expressar os resultados e da correlação com a Patologia - so- bre isso versa o presente livro. Os contadores eletrônicos fornecem um hemograma com todas (ou várias dentre) as determinações feitas diretamente (Tabela 1.1, A) e os parâmetros delas derivados por cálculo, pelo computador (Tabela 1.1, B). Algumas determinações só são fornecidas por equi- • Os dados numéricos, tanto os gerados pelo contador eletrônico (p. ex., conta- gens de glóbulos, VCM, dosagem de hemoglobina), como os calculados a partir destes pelo computador da máquina (p. ex., hematócrito, HCM, histogramas), foram inapropriadamente denominados parâmetros pelos fabricantes desse equipamento. O termo consagrou-se pelo uso. Hemogromo 23 TABELA 1.1 Componente~,do hemograma A) Determinações feitas diretamente pelos contadores eletrônicos Eritrograma Contogem de eritrócitos (E) em milhões (M)IIlL Dosagem de hemoglobina (Hgb) em g/dL Medida do volume dos eritrócitos em fL (média = VCM) Medido da concentração hemoglobínica individual dos eritrócitos (linho Advia) Contagem de reticulócitos (Retics) em % e IIlL (vários modelos top of fine) índices reticulocíticos: maturidade (pela corga de RNA), volume, concen- tração hemaglabínica (idem) Contagem de eritroblastos 1100 leucócitos e IIlL (idem) Leucograma Contagem de leucócitos IIlL Fórmula leucocitária % e IIlL Por volumetria (3 tipos celulares, em contadores de pequeno porte) Por volumetria e citometria em fluxo (5-9 tipos celulares e flags ou estimativas para células anormais, em contadores de grande porte) Determinação da fração leucocitária vióvel (WVF) (top of fine da linha Cell-Dyn) Imunofenotipagem restrita (software especial em alguns modelos top of fine) Ploquetogramo Contagem de plaquetas (Plaq.) IIlL Medida do volume plaquetário (média = VPM) em fL Contagem imunofenotípica das plaquetas (top of fine da linha Cell-Dyn) Contagem de plaquetas reticuladas (top of fine da linha Sysmex) B) Parâmetros derivados pelo computador Hematócrito (Hct): VCM x E Hemoglobina corpuscular média (HCM): Hgb 7 E Concentração hemoglobínica corpuscular média (CHCM): HCM 7 VCM (ou Hgb 7 Hct) Média (CHCM) e desvio-padrão (HDW) das concentrações hemoglobínicas corpusculares individuais (linha Advia) Conteúdo hemoglobínico dos reticulócitos (HCr) (linho Advia) Histogramas: curvas de frequência do volume corpuscular (dos eritrócitos) e de diversos outros parâmetros (Continuo) 24 Renato Foilace & cols. TABELA 1.1 (Continuação) Amplitude de distribuição do volume corpuscular (RDW) Scatterplots da distribuição dos leucócitos Amplitude de distribuição do volume plaquetário (PDW) Plaquetócrito (Pct): VPM x Plaq (geralmente deletado) Alarmes ou avisos (flags) relativos às três séries pamento de uma procedência ou só pelos modelos mais sofisticados (top ofline) de uma ou várias linhas. Algumas são eletivas (feitas sob comando do operador), outras exigem software especial. Apesar da excelência da tecnologia, a microscopia persiste necessária em signifi- cativa fração de casos; as máquinas apontam suas próprias dúvidas (jlags = avisos), tanto na exatidão das cifras como na identificação das células, e todas devem ser esclarecidas; e as máquinas não veem tudo, e algo do que não veem pode ser clinicamente relevante. Déca- das de prática diária e amplo conhecimento de Patologia são requisi- tos indispensáveis para o hernatologista-laboratorista desincumbir- se a contento dessa tarefa. Todos os contadores atuais fazem um conjunto de determina- ções básicas, que inclui eritrograma completo e contagens de Ieucóci- tos e plaquetas. Quase todos os modelos de pequeno porte fazem, ao mesmo tempo, uma fórmula leucocitária simplificada (de três tipos celulares), que deve ser completada pela microscopia. Contadores eletrônicos de grande porte (e alto preço) fazem uma fórmula leuco- citária completa, com cinco ou seis tipos celulares e outros, apresen- tados como flags; usando-se esses contadores, a microscopia é restrita a hemo gramas alterados. A visão abrangente de um médico-hematologista, com vida pro- fissional dividida entre a clínica e o laboratório, adiciona um toque de especialista à numerologia de alta precisão das máquinas eletrônicas: uma sequência de hemogramas transforma-se em uma poderosa lista que suscita hipóteses clínicas e complementações diagnósticas. Médi- cos com essa ambivalência estão se tomandoraros; a pós-graduação em Hematologia não contempla a Patologia Clínica respectiva, dedi- cando-se quase que exclusivamente à oncologia hospitalar. Nos Esta- dos Unidos e Europa, há hemo patologistas, que fazem, a um tempo, Hemogroma 25 anatomia patológica e patologia clínica do sangue e dos órgãos hema- topoéticos; essa especialidade até hoje não se desenvolveu no Brasil. No laboratório, a presença desse hematologista em extinção gera uma filosofia de trabalho: o fornecimento sistemático de resulta- dos elucidativos, não apenas de listas de números a interpretar. He- mo gramas anormais só são fornecidos após elaborada tentativa de esclarecimento ou com sugestões de como esclarecê-los. Para tal fim, esse workaholic não se importa de ultrapassar os limites da requi- sição do médico e dos horários de trabalho. Na falta de dados que permitam interpretação total, telefonemas aos médicos requisitantes, para discussão, são largamente utilizados. Telefonemas aos pacientes, entretanto, devem ser usados com muita parcimônia e somente se o médico não for encontrado. Por exigirem diplomacia e autoridade, na opinião do autor, somente devem ser feitos pelo próprio médico- hematologista; como regra, geram gratidão e confiança, porém, nos casos em que são ma1conduzidos ou envolvem pacientes emocional- mente instáveis, podem gerar apreensão e desconfiança. A otimização dos serviços prestados nos termos dessa filosofia de trabalho não é subjetiva nem teórica; o autor a viu comprovada diariamente em seus 50 anos de atividade profissional. As horas e os insumos gastos com exames feitos a mais, com repetições para confir- mação, com telefonemas e informações, com discussões internas com o pessoal da hematologia, não elevam o preço cobrado pelos exames, elevam só o custo. O ganho de qualidade é obtido às expensas da rentabilidade financeira. Gastar-se o mesmo em marketing, ou no es- tabelecimento de relações participativas com médicos ou instituições, talvez fosse mais lucrativo, mas, na opinião do autor, a prática não se coaduna com uma patologia clínica ética e produtiva: a rentabilidade financeira na prestação de serviços médicos não deve ser visada como um fim, mas como um efeito colateral do inevitável sucesso dessa filosofia. Do lado do médico requisitante, por sua vez, cria-se o dever da escolha consciente does) laboratório(s) que indicará aos pacientes. Sabendo que a referida filosofia, sustentada por uma tecnologia de ponta, é tradicional em um laboratório e que não custa mais, é racio- nal e ético indicá-Io, preterindo outros. Afinal, é seu dever escolher o que há de melhor para os pacientes! A comunicação frequente, escrita, fonada ou pela internet, gera um bom relacionamento recíproco, com compreensão e receptivida- de do médico aos resultados do laboratório. Resultados considerados 26 Renala Failace & cais. pelo médico requisitante como duvidosos, improváveis ou incompatí- veis com os previstos, serão reconferidos após diálogo telefônico com o patologista-clínico, fora da presença do paciente. Correções deverão ser aceitas com tolerância pelos médicos requisitantes se decorrerem de má transcrição das cifras originais; em um laboratório, onde tran- sitam milhões de dígitos por dia, inevitavelmente algum terá emissão errônea não notada. Repetições serão combinadas quando se concluir pela improbabilidade de resultados; todas as reconferências deverão ser gratuitas. Ampliações de requisições médicas, com acréscimo de exames não pedidos, mas percebidos necessários pelo patologista-clí- nico, são éticas e recomendáveis, mas só serão cobradas do paciente com aquiescência do médico e por interferência deste. REGISTRO E PROCESSAMENTO DE DADOS A manutenção da qualidade total nos laboratórios de patologia clínica exige permanente controle, do cuidado nos registros iniciais e na identificação das amostras à conferência final e entrega dos resul- tados. O registro de ingresso dos pacientes deve incluir nome comple- to e data de nascimento, telefone para contato, médico requisitante (digitado pelo número do Conselho Regional de Medicina), lista dos exames pedidos, observações ou comentários do médico (se houver), e os dados contábeis pertinentes. A identificação por código de barras é sempre recomendável e indispensável em laboratórios grandes. O computador abre um registro numerado para o paciente, distribui os registros contábeis pelas contas das respectivas instituições requisi- tantes e mantém a lista dos exames pedidos acessível no sistema a todas as seções técnicas. Exames anteriores do paciente, buscados no computador pelo nome e conferindo-se a data de nascimento para evitar erros de homonímia, devem ser mantidos acessíveis por 3 a 5 anos para permitirem comparações quando pertinentes. A transferência de resultados do contador eletrônico para o computador do laboratório, que emite os laudos finais, no caso de he- mo gramas integralmente dentro dos limites de referência arbitrados e sem flags, deve ser feita por interfaciamento direto com as máqui- nas, sem interferência humana. Com limites precisos e sensatamente definidos para hemogramas cujos resultados auto matizados dispensem melhor esclarecimento, esse procedimento zera os erros humanos de Hemograma 27 transcrição e impede a manipulação perigosa dos dados por pessoal menos qualificado. No caso de hemogramas com interfaciamento rejeitado pela pre- sença deJlags ou por cifras fora dos limites arbitrados, o autor sugere que o programa faça imprimir pela máquina um resultado completo (algumas fornecem uma laboratory worksheet detalhada), a ser en- viado para conferência por técnico sênior; este define a necessidade de microscopia e responsabiliza-se por todas as manipulações com- plementares que lhe parecerem necessárias, até o fornecimento do resultado final. Alguns laboratórios preferem incluir as correções ej ou observações diretamente no resultado no sistema, outros, na cópia impressa, com digitação para o sistema do novo resultado final. Em qualquer caso, há possibilidade de erro humano. Para mínimizá-lo, o autor faz algumas sugestões: • Acrescentar observações nos resultados por meio de códigos que geram legendas. Exemplos: código POLI faz imprimir "policrorna- tose", GTOX, "granulações tóxicas nos neutrófilos", etc., com a respectiva semiquantificação, descrita adiante neste capítulo. Isso evita erros da digitação de frases longas ou palavras complexas, como anomalia de Pelger-Huet, Códigos numéricos são mais fáceis de usar, mas também mais fáceis de serem trocados por engano. • Incluir no programa do computador uma série de limites e correla- ções numéricas lógicas entre os parâmetros do hemograma. Exce- ções a essa regra arbitrária passam a ser aceitas no programa, por digitação ou modificação de resultados no sistema, somente quando acompanhadas de dígitos de controle preestabelecidos, anotados pelo técnico sênior, Isto é, pela inclusão do dígito de controle, o técnico confirma a veracidade do dado alterado; na falta do dígito, o pro- grama rejeita-o. Exemplos: o programa "sabe" que VCM = Hct .;- E; se o VCM for maior que 110 (número arbitrado), é exigido um dígito de controle significando macrocitose; se o VCM alto dever- se a erro de digitação ou modificação involuntária na contagem de eritrócitos ou hematócrito, o resultado é rejeitado por falta do dígito. • Delimitar extremos para o possível de cada parâmetro ou de suas correlações. Exemplos: o resultado absurdo causado pela presença de crioaglutininas, como o da Figura 5.4 (p. 139), não é aceito pelo sistema nem que o técnico deseje fomecê-lo. Um Hct = 24% é in- 28 Renato Failace & cais. compatível com uma Hgb = 14,0 g/dl.; a rejeição é automática e irreversível. Se Hct, HCM, CHCM não corresponderem às respectivas fórmulas de cálculo, nunca serão aceitos. • Digitação feita em duplicata é um método de segurança muitousa- do, mas insatisfatório: erros feitos pelo técnico no boletim original são digitados igualmente nas duas versões. Salvaguardas incluídas no sistema são sempre mais fáceis e seguras, portanto preferíveis a controles por tarefa humana. COLETA DE MATERIAL Apesar de haver diminuição do volume plasmático ao passar-se do repouso, na horizontal, à posição vertical, por acúmulo gravitacional e transudação nos membros inferiores, o que aumenta as cifras eri- troides do amanhecer ao entardecer em 2-3% (pode chegar a 5-10% em obesos e cardiopatas), e de haver uma elevação circadiana, da ma- nhã para a tarde, na contagem de leucócitos, as diferenças costumam ser clinicamente irrelevantes, de modo que a coleta de sangue para hemo grama pode ser feita a qualquer hora. Evita-se apenas coletá-lo após exercício físico, que causa considerávelleucocitose (neutrofilia), e nas duas horas que sucedem refeições lautas ou ricas em gordu- ra. Neutropenia em hemo grama coletado em condições basais exige confirmação com coleta no fim da manhã ou na segunda metade da tarde. Poliglobulia em hemo grama coletado no fim do dia exige con- firmação em coleta de manhã cedo. Para hemo grama, usa-se sangue coletado de veia superficial da dobra do cotovelo, com agulha de calibre compatível com o volume a coletar. O autor recomenda os calibres (0) seguintes: • 0 0,6 mm para coletas até 2 mL (berçário e veias afetadas por qui- mioterapia) • 00,7 mm para coletas até 5 mL (dorso da mão e pulso, pediatria) • 00,8 mm (é o usual) para coletas até 20 mL (para 20 mL comple- tos, melhor 00,9 mm). Volumes maiores, que não costumam ser necessários para patologia clínica, exigem butterfly. A jugular externa é segura e útil para crianças pequenas e pa- cientes com veias difíceis ou esclerosadas. O risco de punção arterial Hemograma 29 ou de veia profunda é dificilmente justificável para exames rotineiros de patologia clínica. Só se faz hemo grama de sangue capilar em uni- dades de oncopediatria, com coletador e tecnologia especializados. A dor da picada da agulha diminui com o aumento do ângulo de penetração, mas o risco de ultrapassar a veia aumenta na mesma proporção. Reação vasovagal por coleta de sangue é infrequente, mas ocorre. O coletado r deve estar atento; se notar palidez, ou o paciente queixar-se de tontura, imediatamente fazer com que se deite. A rea- ção é fugaz e inócua; o risco é a queda. Contenção do paciente só se faz com autorização do responsável, sendo, assim, só aplicável a crianças ou pessoas mentalmente inválidas; pacientes anestesiados ou comatosos fazem exceção óbvia. O sangue é recebido em um tubo contendo 1 a 2 mg de EDTA sódico ou potássico por mL coletado. O volume recomendado para o tubo deve ser respeitado; desproporção sangue/EDTA causa erro pré- analítico. Se houver preferência por tubo contendo EDTAem solução, a gota deve ser insignificante para o volume de sangue coletado; vo- lume de sangue inferior ao recomendado toma significativa a diluição pelo anticoagulante, com diminuição das cifras hematimétricas. Ma- terial insuficiente exige nova coleta. Como há tubos pediátricos para hemo grama, com minidose de EDTA, compatíveis com a coleta de 0,5 a 1 mL de sangue, convém tê-los à mão para uma eventual coleta escassa. Coleta lenta e difícil, por falta de fluxo na veia punciona- da, favorece a agregação plaquetária e a coagulação: nunca aceitá-Ia! É necessário trocar o material e puncionar outro local. A heparina não se presta como anticoagulante para leucograma e contagem de plaquetas; ela destrói os leucócitos e causa uma coloração de fundo violeta nas lâminas, mas é tolerável para o eritrograma, desde que em mínima quantidade para evitar diluição. A diferença entre o he- mograma do sangue de veias e de artérias periféricas é insignificante; o eritrograma pode ser feito com o sangue coletado para gasometria arterial desde que não seja diluído com excesso de heparina. A coleta de sangue de cateteres profundos é necessária em mui- tos pacientes, especialmente nos que estão recebendo quimioterapia. Necessária, mas tecnicamente indesejável. É preciso aspirar inicial- mente um volume significativo de sangue e desprezá-lo, porque esta- va em estase e com heparina no cateter. Com esse cuidado, o sangue obtido é satisfatório para eritrograma e leucograma; a contagem de plaquetas, entretanto, sempre será insegura pela perda inevitável no 30 Renata Failace & cols. trajeto. Em pacientes internados, é recomendável que a coleta seja feita por pessoal próprio da unidade. A coleta no recém-nascido é discutida no Capítulo 19. A coleta com seringas e agulhas descartáveis é mais fácil para o coletador e causa menos hematomas nos pacientes do que a coleta com tubos a vácuo e agulhas bipolares, mas implica em maior risco de ferimento acidental com a agulha. O uso de luvas de borracha é recomendado, mas é certo que o prejuízo ao tato interfere no traba- lho e que as luvas não protegem contra o risco citado, de modo que a recomendação não é universalmente seguida. O uso de luvas é re- gulamentar e obrigatório para todo o pessoal que manipula materiais biológicos nas seções técnicas do laboratório. Como o coletador trabalha só e tem as mãos ocupadas, cabe ao próprio paciente ou a um acompanhante comprimir o local da punção para o estancamento. Mesmo instados com insistência (nas salas de coleta do laboratório do autor havia um pôster mostrando a maneira correta de pressionar), geralmente não o fazem com a pressão e o tempo adequados. A consequência é um hematoma local, pois o es- paradrapo, sem firme compressão prévia por 3-4 minutos, é ineficaz para evitá-lo. Mesmo com pessoal de coleta capacitado e experiente, a coa- gulação incipiente ou total de uma amostra de sangue a cada 500 a l.000 costuma ocorrer em todos os laboratórios, tornando-se neces- sária nova coleta. A distensão sistemática de lâminas com gotas de sangue nativo, da ponta da agulha, era recomendada por alguns patologistas-clínicos para que as células sempre fossem vistas ao microscópio sem alte- rações causadas pelo anticoagulante. O risco de trocas, o atraso na sequência da coleta, o desvio da atenção dos coletadores do paciente para esse trabalho, o aumento do risco de acidentes e a lenta secagem das lâminas pela dificuldade de se usar um secador na sala de coleta fazem preferir-se, hoje, a distensão de lâminas a partir do sangue já anticoagulado. Deve ser feita, sempre que possível, antes de quatro horas, no máximo em seis; se o transporte para um laboratório central demandar maior prazo, é necessário distendê-las na origem. Amostras de sangue enviadas devem ser transportadas a '=' 5°C e com um mínimo de agitação. Lâminas já distendidas não devem ficar no ambiente refrigerado junto com as amostras, pois podem hernoli- sar pela umidade. Deve-se embrulhá-Ias separadamente e transportá- Ias, evitando exposição a temperaturas >32°C. O sangue transporta- Hemograma 31 do deve ter recepção preferencial no laboratório de destino de modo a passar imediatamente à seção técnica para processamento. CONTADORES ELETRÔNICOS A contagem eletrônica de glóbulos começou com a patente por Wallace Coulter e seu irmão, nos anos 1950, de um dispositivo capaz de contar e medir os pulsos de condutividade (impedância) causados pela passagem de partículas através de um orifício pelo qual flui uma corrente elétrica. O contador primitivo tinha uma haste oca, com o interior comunicado com o exterior por um orifício de pequeno diâ- metro, com um eletrodo metálico interno e outro externo, e uma fon- te geradora de corrente contínua. Uma bomba pneumática aspirava o sangue, apropriadamente diluído em solução eletrolítica, de fora para dentro pelo estreito orifício, até um volume exato predetermina- do. Ao cruzarem individualmente o orifício, os glóbulos, pela menor condutividade, desencadeavam pulsos de impedância,sentidos pelo galvanômetro do instrumento. Os pulsos eram contados e medidos, e a calculadora, levando em conta a diluição e o volume aspirado, con- vertia o resultado em número de glóbulos por J.lL de sangue. 31 )::'6/11 O método mostrou-se adequado à finalidade a que se propu- nha: contagem e medida dos glóbulos sanguíneos. Os instrumentos primitivos, que exigiam um diluidor manual externo para as amostras de sangue a examinar, evoluíram nos anos 1960 e começo dos anos 1970 para instrumentos capazes de aspirar o sangue, distribuí-Ia em alíquotas apropriadamente diluídas para canais separados, um para contar e medir plaquetas e eritrócitos, outro para contar e medir leu- cócitos e dosar hemoglobina por espectrofotometria, após hemólise pelo líquido diluidor. Aperfeiçoados na mecânica, na eletrônica e, principalmente, no software do computador de apoio, os contadores eletrônicos por impedância, isto é, com tecnologia baseada no princípio Coulier, tornaram-se reprodutíveis e seguros, fornecendo cifras hema- timétricas fidedignas; são fabricados e muito utilizados até hoje, com a designação usual de contadores eletrônicos de pequeno porte. No fim dos anos 1970, a tecnologia de impedância foi acrescida de citometria em fluxo, maravilha tecnológica com inúmeras perspec- tivas e variantes para identificação celular, dando origem aos atuais contadores eletrônicos de grande porte. As novas máquinas são capazes de fornecer a multiplicidade de parâmetros listados na Tabela 1.1, e 32 Renato Failace & cols. são utilizadas na generalidade dos grandes laboratórios. A mecânica dos instrumentos, nos anos 1980, foi automatizada pela técnica de perfuração sequencial, com uma agulha aspiradora (probe), da tampa dos frascos de sangue, dispostos em raques móveis, identificados por código de barras. Essa automação elimina o risco da manipulação do sangue pelos operadores e diminui a perspectiva de troca de material por erro humano. No fim dos anos 1990, foram criados sistemas ro- botizados, com a anexação aos modelos top of line de algumas linhas, de equipamento automático capaz de distender e corar lâminas ele- tivamente, sob comando de critérios incluídos no software de uma central inteligente. Essa melhoria torna o equipamento muito caro, sendo, por isso, pouco difundida no Brasil até hoje. Nos países desen- volvidos, com o elevado custo da mão-de-obra, está se generalizando rapidamente. A robotização acrescenta rapidez e certo aumento de segurança contra erro humano ao procedimento, mas não interfere na qualidade do produto final: o resultado do hemograma. O hemograma feito em contadores de grande porte é o que terá resultados transcritos, discutidos e interpretados neste livro. Hemograma em contadores eletrônicos de pequeno porte Todos os fabricantes fornecem aparelhos de pequeno porte e de baixo custo de aquisição, manutenção e insumos, com tecnolo- gia restrita à contagem e medida de pulsos de impedância (princípio Coulter). No Brasil são usados na virtual totalidade dos laboratórios pequenos, com até 100 hemogramas por dia. Como não performam automaticamente uma fórmula leucocitária completa, laboratórios com essas máquinas precisam sempre completar o hemo grama com uma fórmula feita ao microscópio (fórmula visual, ou "manual"). Nesses contadores, o resultado fornecido é uno e indivisível. Pedidos parcelados de leucograma, hematócrito ou contagem de leu- cócitos pertencem à tecnologia extinta. Há uma exceção aceitável. Havendo interesse só na série vermelha - como na seleção de doa- dores em banco de sangue, em exames periódicos da gravidez ou de pacientes renais crônicos em diálise - e sabendo-se que o laboratório do serviço (ou contratado) trabalha com contador eletrônico de pe- queno porte, isto é, sem fórmula leucocitária auto matizada, justifica-se o pedido isolado de eritrograma. Nessa eventualidade, o laboratório economiza o trabalho de distender lâmina e fazer a tediosa fórmula Hemograma 33 ao microscópio, fornecendo só o eritrograma desejado com econo- mia de custo ou preço. Também não tem sentido o pedido isolado de contagem de plaquetas*, pois a máquina não se presta a fazê-Ia sem as demais contagens; a contagem de plaquetas é sempre parte do hemo grama. Um resultado típico de contador de pequeno porte (Coulter TI MD) é visto na Figura 1.1. A REL NO. WBC 50 50 100 SAMPLE ANALYSIS NORMAL DISTRIBUTlON OS/25/90 128 ID 89217783742 LAB 120 WBC 4.3 LY 56.7 MO 9.2 GR 54.1 EO # (.7 BA# (.2 100 400200 300 3.98 12.9 37.0 93.0 32.4 34.9 15.0 200 PLT 10 20 FIGURA 1.1 Resultado de hemograma no Coulter T/MD. * Em algumas localidades do Brasil, ainda se mantém uma ridícula disputa entre entidades (públicas e privadas) tomadoras de serviços médicos e laboratórios de patologia clínica. Aquelas mantêm a contagem de plaquetas e o hemograma separados nas tabelas de preços, exigem requisição médica, especificando um, outro, ou ambos, e pagam de acordo. Os laboratórios, em contrapartida igual- mente ridícula e antiética, sonegam do resultado do hemo grama a contagem de plaquetas, e vice-versa, quando não pedidos ambos especificamente. 34 Renato Failace & cais. o histograma superior é o do leucograma; a medida das células, simultânea à contagem, mostra um pico entre 35 e 95 fl., que corres- ponde aos linfócitos (inclui os basófilos), e uma elevação rasa entre 160 e 400 fl., que corresponde aos granulócitos. Entre ambas, aos 90- 160 fl., situam-se rnonócitos, alguns granulócitos não-segmentados e eosinófilos e, quando presentes, granulócitos imaturos e linfócitos ativados. A fórmula numérica, vista na coluna à direita, é incomple- ta e imprecisa, mas permite distinguir neutrofilias de linfocitoses. A fórmula ao microscópio é indispensável para um resultado completo, com eosinófilos e basófilos; essa trabalhosa necessidade, por outro lado, faz com que esses hemogramas de "tecnologia pobre" mante- nham a característica histórica de evidenciar dados citológicos não mais notados pela eletrônica (por exemplo, pequenos desvios à es- querda, eliptocitose sem anemia e outros). O 22 histograma é o do volume corpuscular eritroide. É similar ao obtido nos contadores de grande porte, que será discutido adiante. Os resultados numéricos relativos ao eritrograma são vistos na coluna à direita. São satisfatoriamente reprodutíveis e exatos. O 32 histograma é o do volume plaquetário; a curva é semilo- garítmica. A contagem de plaquetas, definidamente inferior em fide- dignidade à oriunda de contadores maiores, e o VPM estão anotados à direita. Hemograma em contadores eletrônicos de grande porte Os contadores eletrônicos de grande porte atuais, capazes de fa- zer as determinações da Tabela 1.1, são variados, de múltiplas proce- dências e com extensa gama tecnológica. O autor teve ampla experi- ência pessoal com os instrumentos MAX'M e STKS (Coulter), Cell-Dyn 3500 e 4000 (Abbott) e Sysmex XE 2100; teve, também, oportunida- de de familiarizar-se com a tecnologia e os resultados do Advia 120 (na ocasião Bayer, agora Siemens). São as linhas de instrumentos de maior expressão internacional, e todas estão representadas no Brasil; as empresas fabricantes e/ou distribuidoras locais oferecem contratos de leasing e comodato, que incluem o fornecimento de insumos e as- sistência técnica, com pagamento por exame, com um número mínimo preestabelecido e preços variando favoravelmente de acordo com o número mensal atingido. Hemogramo 35 Segue-se uma lista simplificada, mas abrangente, da tecnologia dessas quatro linhas de instrumentos: 1. Medida e contagem dos pulsos de impedância, causados pelos gló- bulos, ao cruzarem um orifício pelo qual flui uma corrente contínua (princípio Coulter): contagem e medida do volume de eritrócitos e plaquetas em todos os instrumentos; contagem de leucócitos na maioria. 2. Medida da condutividadeelétrica dos glóbulos, em radiofrequência, no orifício de impedância: sensível à estrutura interna das células, usada para diferenciação dos tipos de leucócitos na fórmula das linhas Beckrnan Coulter e Sysmex. 3. Análise, em vários ângulos, da dispersão" da luz (foco luminoso de tungstênio ou laser) focalizada nos glóbulos em citometria em fluxo: identificação (em alguns, contagem) dos tipos celulares em todas as linhas de instrumentos. 4. Dispersão e absorvância da luz (laser) após reação da mielope- roxidase: identificação dos granulócitos (peroxidase +) na linha Advia. 5. Idem, após efeito lítico preferencial do solvente sobre o citoplasma dos leucócitos: identificação dos basófilos, resistentes à lise, em várias linhas de instrumentos; identificação de células imaturas (resistentes por falta de lipídios na membrana) na linha Sysmex. 6. Idem, após coloração supravital do ácido ribonucleico (RNA): identificação dos reticulócitos na linha Beckman Coulter. 7. Dispersão de luz polarizada: identificação dos eosinófilos pelo efeito despolarizante, em várias linhas de instrumentos. 8. Avaliação da fluorescêncía após marcação do RNA citoplasmático com derivados da fluoresceína: identificação dos reticulócitos nas linhas Cell-Dyn, Sysmex e Advia. 9. Avaliação da fluorescêncía do DNA nuclear após marcação com io- deto de propidium: identificação de leucócitos inviáveis (membrana permeável ao marcador) e eritroblastos na linha Cell-Dyn. 10. Avaliação da fluorescência em leucócitos após permeabilização da membrana por solvente e marcação com um corante fluorescente de *Dispersão da luz (light scatter ou laser scatter) tem aqui o sentido de "dispersão por reflexão e refração", não de abertura do espectro cromático. 36 Renalo Failace & cais. polimetina: identificação dos leucócitos e de plaquetas reticuladas na linha Sysmex. 11. Avaliação da fluorescência após marcação das células com anticor- pos monoclonais fluorescentes (imunofenotipagem limitada), feita com software especial por alguns modelos top ofline: contagem de plaquetas (com anti-CD61) e de linfócitos CD3, CD4 e CD8 na linha Cell-Dyn. Outras aplicações ainda em estágio experimental. 12. Espectrofotometria: é usada de modo universal para a dosagem de hemoglobina; as diversas linhas de instrumentos diferem quanto à conversão da Hgb antes da colorimetria: cianometemoglobina (Beckman Coulter), hemoglobína-lauril-sulfato de sódio (Advia e Sysmex), meternoglobina-imidazol (Cell-Dyn). Todos as linhas de contadores utilizam-se do princípio Coul- ter (item 1, acima) como método básico das contagens; eritrócitos e plaquetas, distinguidos por limiares de volume, geralmente compar- tilham um mesmo canal de impedância. Da mesma forma, o hemoli- sado destinado à dosagem espectro foto métrica da hemoglobina (item 12, acima) também é usado para a contagem de leucócitos. As linhas Coulter e Sysmex usam o trajeto de impedância para a medida de condutividade dos leucócitos (ver item 2, na página anterior). Os demais princípios para identificação celular (itens 3 a 11, aci- ma) dependem da técnica de citometria em fluxo (jlow cytometry); os glóbulos são direcionados para uma tubuladura delgada, onde fluem um atrás do outro, envoltos em uma bainha de solvente e focados por técnica hidrodinâmica. Ao entrarem nos múltiplos canais do siste- ma, alíquotas são diluídas, e as células, suspensas em uma variedade de fluidos, com características específicas de tonicidade, de atividade como solvente, com ou sem corantes, sejam de impregnação, enzimá- ticos ou imunológicos, alguns fluorescentes. Finalmente passam por um ponto do trajeto (jlow cell) onde são contados e submetidos aos diversos processos de identificação. Naflow cell, os glóbulos em coluna são alvejados individualmen- te por raios luminosos em diversos ângulos para analisar a difração da luz e por lasers para estimular fluorescência nos que tomaram os co- rantes marcados com fluoresceínas. Múltiplos fotodetectores recebem a luz difratada, outros identificam a fluorescência em um ou vários comprimentos de onda. A energia é convertida em pulsos elétricos, que são digitalizados e enviados ao computador. O software recebe as informações dessas dezenas de milhares de células que passam pelo Hemogramo 37 trajeto em segundos e distribui a imensa quantidade de dados em clusters de identificação predeterminados, permitindo uma avaliação qualitativa e quantitativa integral das populações em teste. O termo 'fantástico" é extrapolado por essa tecnologia. Os instrumentos das quatro linhas discutidas fornecem, de modo idêntico, embora por tecnologia variada, contagens e volumetria de eritrócitos e plaquetas, contagem e fórmula diferencial de leucócitos, dosagem de hemoglobina, índices hematimétricos, histogramas do volume corpuscular (eritroide e plaquetário), scatterplots leucocitá- rios usados para a diferenciação celular, flags e comentários codifica- dos ou escritos sobre anormalidades. A tecnologia empregada nas contagens de glóbulos em cada linha é resumida na Tabela 1.2. A da fórmula leucocitária, pela grande dis- paridade entre os instrumentos, é descrita individualmente no texto correspondente, junto com inovações, características e parâmetros únicos de cada linha. Para uma discussão técnica detalhada, o leitor deve consultar, na internet, os sites das empresas fabricantes e os manuais de instru- ção de cada instrumento em particular, obtidos com os distribuidores locais. TABELA 1.2 Tecnologia usada nas contagens de glóbulos pelas quatro linhas de instrumentos discutidas no texto Beckman Cell-Dyn Sysmex Advia Coulter Abbott Roche Siemens Eritrócitos Impedância Impedância Impedância Impedância e óptica Leucócitos Impedância Óptica e Impedância Óptica fluorescência e óptica Plaquetas Impedância Óptica e Impedância; Óptica impedância; óptica/fluo- irnunofluo- rescência rescência (alternativa) (opcional) Reticulócitos Coloração Fluorescência Fluorescência Fluorescência (opcional) com novo- com CD4K530® com polimetina com oxazina azul-de- 750 metileno 38 Renato Failace & cais. Linha Beckman Coulter (Coulter STKS, GEN""Se LH750) No eritrograma, destaca-se a alta qualidade do histograma, alongado na abcissa, baixo na ordenada e com traçado firme, porque o software edita pulsos aberrantes. Na opinião do autor, é mais fácil de interpretar do que os histogramas das demais linhas e, por isso, predomina nas ilustrações deste manual. O leucograma é feito com a tecnologia que a Coulter denomina "VCS": • Volume (medido por impedância); • Condutividade (em frequência de ondas de rádio); • Laser Scatter. A figura plana do scatterplot do leucograma é o plano frontal de uma imagem tridimensional, um cubo, elaborada pelo computador do aparelho, com as medidas VCS distribuídas pelas três arestas que partem da origem. Os resultados obtidos para cada célula são plo- tados e geram conglomerados espaciais, que a máquina separa por planos móveis, vistos em frontal como linhas. Há um conglomerado de linfócitos (LY), de neutrófilos (NE), de monócitos (MO) e de eosi- nófilos (EO) ; os basófilos (BA), atrás dos linfócitos, só são vistos em outra incidência. No display do instrumento, o scatterplot é colorido com um código de cores correspondente ao número de eventos em cada ponto (Figura 1.2, A). São listadas as porcentagens de cada tipo celular (fórmula relativa) bem como sua conversão em números por ul, (fórmula absoluta). Há flags na série leucocitária para desvio à esquerda e granu- lócitos imaturos, linfócitos atípicos e blastos, e um mais amplo slide review; na plaquetária, há flags para excesso de pulsos junto aos ex- tremos do intervalo volumétrico e presença de agregados. A máquina fornece uma interpretação de fábrica, que imprime macrocitose ou microcitose, hipo ou hipercromia, etc., de acordo com os limites de referênciaque atribui às cifras; identifica e aponta até população di- mórfica pela análise do histograma. O canal de reticulócitos (determinação opcional) fornece a conta- gem, o volume médio dos reticulócitos e a fração reticulocítica imatura. O mais avançado e recente modelo (top of line) da série, o Coul- ter LH7S0, pode ser fornecido anexado a equipamento capaz de dis- tender e corar lâminas (Figura 1.3) em obediência a critérios de uma central inteligente. Hemograma 39 A Eosinophils B FIGURA 1.2 Scatterplots vistos no monitor, de leucogramas do Coulter STKS (A) e do Cell- Dyn 4000 (B). O pontilhado verde excessivo em (B) indica eosinofilia. FIGURA 1.3 Contador Coulter LH750, acoplado a equipamento automatizado para dis- tender e corar lâminas. (Cortesia do Laboratório do Hosp. St. Louis, Paris, 2007.) 40 Renala Foilace & cais. Linha Cell-Dyn Abbott (Cell-Dyn 4000 e Sapphire) A linha tem as seguintes características, algumas inovadoras: • Óptica com laser de argônio, com potência capaz de excitar fluores- cência nas células marcadas com iodeto de propidium para o DNA, e com uma fluoresceína própria (CD4K530®) para o RNA, o que permite identificar a fração de leucócitos inviáveis, os eritroblastos, e fazer a contagem de reticulócitos. • Leitura simultânea de todos os dados naflow cell, com laser scatter em quatro ângulos e fluorescência. Impedância aperfeiçoada por fluxo forçado. As células são marcadas com códigos de cor. Um exemplo do scatterplot no monitor é visto na Figura 1.2 (B); o pon- tilhado verde excessivo ilustra presença de eosinofilia. Um exemplo completo da worksheet em cores, fornecida como opção para uso no laboratório, de hemo grama muito alterado de um recém-nascido, pode ser visto na Figura 19.1, p. 312. • Contagem de leucócitos reprodutível até 250.000/~L. • Contagem de plaquetas por dupla tecnologia, automaticamente es- tendida em casos com trombocitopenia; mantém satisfatória precisão entre 5.000 e 2 milhões/ul., Há, ainda, uma contagem ímunofeno- típica opcional, com marcação fluorescente do CD61, considerada como método de referência para contagem de plaquetas. • A mesma coloração imunofluorescente permite, de modo opcional, a contagem de linfócitos CD4 e CD8. o modelo Cell-Dyn 4000 saiu de linha, substituído pelo novo modelo Cell-Dyn Saphire visto na Figura IA. A Abbott fornece outros dois modelos de contadores de grande porte, mais simples e econômi- cos: Cell-Dyn 3500 e 3700. Linha Sysmex Roche (Sysmex XE 2100) o uso de tecnologia de impedância com corrente elétrica de dupla frequência assemelha-se ao da linha Coulter. O sistema é ali- nhado em foco hidrodinâmico, com bainha de solvente, impedindo falsos pulsos. Os leucócitos são contados no sistema de impedância e, novamente, na citometria em fluxo. A identificação é feita por light scatter frontal (mede o tamanho) e lateral (avalia o conteúdo, princi- palmente as características nucleares). A fluorescência é avaliada em fotodetector lateral. Hemograma 41 FIGURA 1.4 Cell-Dyn Saphire. (Cortesia do Laboratório Richet, Rio de Janeiro, 2008). o canal de reticulócitos, com um software apropriado fornecido com o instrumento, permite uma avaliação em unidades arbitrárias (RET Y e RBC Y) do volume dos reticulócitos e dos eritrócitos e uma contagem de plaquetas reticuladas (ver Capo 18, p. 301). A linha Sysmex é bem aceita no Brasil na competição por qua- lidade/preço. A Sysmex-Roche também oferece um modelo com tec- nologia de preparo automático de lâminas em casos selecionados por uma central inteligente (ver Figura 1.5) e um modelo, também de grande porte, mas mais simples e econômico (XS-l 000). Linha Advia Siemens (Advia 120) Desde os primeiros modelos nos anos 1970, essa linha original- mente japonesa de contadores eletrônicos utiliza duas técnicas únicas: • Coloração cito química de mieloperoxidase para identificação de granulócitos no leucograma; o canal de peroxidase é eficaz na dife- renciação e permite o diagnóstico imediato da deficiência genética, não-rara, de mieloperoxidase. 42 Renato Failace & cols. FIGURA 1.5 Dois conjuntos Sysmex XED-SP 1000 com dispositivos automáticos para distensão e coloração de lâminas. (Cortesia do Laboratório Weinrnann, Porto Alegre, 2008.) FIGURA 1.6 Instrumento Advia 120 na bancada de trabalho. (Cortesia do Laboratório da Santa Casa de Misericórdia, Porto Alegre, 2008.) Hemogromo 43 • A contagem e a medida de eritrócitos (após esferação isovolumétrica) e de plaquetas é feita por laser scatter em dois ângulos; o índice de refração correlaciona-se com a densidade celular e permite a deter- minação da concentração hemoglobínica individual dos eritrócitos. A máquina fornece a média (CHCM = cell hemoglobin concentration mean) e uma curva de frequêncía dos valores individuais, quantifi- cando hipocromia e hipercromia com números estatísticos. A técnica é extensiva ao canal de reticulócitos: obtém-se o volume (VCMr) e o conteúdo hemoglobínico (HCr) reticulocíticos médios. A Figura 1.6 mostra o instrumento Advia 120. O preço e a di- ficuldade de manutenção da linha Advia no Brasil tornam-na menos competitiva do que a Sysmex; daí ser menos difundida. MICROSCOPIA Embora a observação tradicional ao microscópio persista in- substituível em casos particulares, a impossibilidade de manter um staJf, com técnicos experientes, capazes de examinar centenas ou milhares de lâminas por dia, venceu a resistência e os escrúpulos dos mais ferrenhos adeptos da microscopia universal. Em todos os grandes laboratórios que usam contadores com fórmula leucocitá- ria completa, o exame ao microscópio atualmente só é feito em ca- sos selecionados. Em locais onde essa política, agora geral, ainda compete com hemo gramas feitos à moda antiga, com contadores de pequeno porte e fórmula visual (manual), essa orientação deve ser anotada no resultado. Com exceção do hemograma de instituições fechadas (como hospitais universitários), em que o corpo clínico está formalmente informado dos novos tempos, cabendo inclusive ao médico requisitante solicitar exame microscópico complementar quando julgar necessário. Em muitos hospitais, os médicos recebem o resultado direta- mente do contador, on-line, com o sistema de computadores da enti- dade. O requisitante sabe o que vai receber ao solicitar o hemograma. Mas, em laboratórios abertos ao público e aos médicos em geral, tem sido difícil difundir o conhecimento de que receberão um hemograma inacreditavelmente exato quanto aos números, mas limitado à visão das máquinas na identificação celular. Apesar da maravilhosa tecnolo- gia eletrônica, as máquinas não veem tudo, e o que não veem pode ~er clinicamente significativo ou, ao menos, biologicamente relevante. 44 Renato Foilace & cols. Critérios para indicação de microscopia A consulta a vários laboratórios de grande porte em Porto Alegre mostrou certa homogeneidade de critérios; costumam ir à microsco- pia lâminas dos hemo gramas que se enquadram em certos critérios de identificação e procedência, que tenham flags das máquinas ou resultados numéricos fora dos limites de referência, todos discutidos a seguir: 1. Idade: <5 anos. Motivo: a frequência de desvio à esquerda por diarreia ou viroses e a dificuldade de definir valores de referência nesse grupo etário. 2. Idade: >75 anos. Motivo: a grande prevalência de doenças crônicas subclínicas; mesmo com números normais poderá haver policro- mato cito se (anoxemia?), rouleaux, neutrófilos hipersegmentados, etc. 3. Procedência: hemogramas vindos de clínicas onco-hematológícas, todos os pacientes internados ou apenas os da UTI, ou de outros setores em que predominem pacientes graves. 4. Em laboratório de hospital ou clínica em que a informática permita delta-check: fazê-lo, limitando-o a 30 dias e tolerando ± 10% de variação. 5. Pedidos médicos específicos:pesquisa de linfócitos atípicos, de esferócitos, pedido de mono teste, etc. 6. Flags emitidos pelo aparelho: não costumam diferir muito entre os diversos contadores eletrônicos. Geralmente são: ImmGrans/ bands, Blasts, Variant lymphs, NRBC, Plt.Clumps, Review slide. Todos exigem microscopia. 7. Limites de referência dos parâmetros numéricos: variam pouco en- tre os laboratórios consultados. Os números do quadro apresentado na página seguinte são os recomendados pelo autor: A concordância de critérios entre os laboratórios locais não impli- ca em concordância internacional. Seguem-se exemplos ilustrativos. O laboratório do Hospital Saint Louis (Paris) opta por uma políti- ca simplista: os médicos recebem apenas uma transcrição interfaciada dos dados numéricos fornecidos pelas máquinas, sem qualquer parti- cipação humana, salvo no controle de qualidade; só é feita microsco- pia mediante solicitação escrita do médico requisitante. Por outro lado, os laboratórios do St. Mary's Hospital (Londres) e do New York-Presbiterian (Cornell Medical Center, New York) cara c- Hemograma 45 Eritrócitos < 3,8 >6 M/J.!L Hemoglobina <11 > 17 g/dl, VCM < 78 > 100 fL CHCM < 31 > 36 % RDW > 15 % Leucócitos < 3500 > 12000 /J.!L Neutrófilos < 1500 > 7000 /J.!L < 30 > 75 % Linfócitos < 1000 > 4000 /J.!L Monócitos > 1500 /J.!L Eosinófilos > 1500 /J.!L Basófilos >2 % Plaquetas < 120000 > 400000 /J.!L terizam-se por detalhar extensos procedimentos operacionais-padrão para essa escolha. * No St. Mary's, o procedimento começa pelo exame do resultado na tela por técnico do laboratório (Registered Biomedical Scientist). Cabe-lhe decidir pela validade das contagens; dispõe dos resultados anteriores do paciente, se houver. Tem autoridade para aceitar ou mandar repetir as contagens da máquina, mas há critérios recomen- dados: alterações da CHCM, valores inesperados ou inexplicados para Hgb alta ou baixa, diminuição desta (em relação a anteriores), idem para VCM, contagens de leucócitos e plaquetas (nesse caso, examina a amostra para coagulação), basofilia. O técnico, nessa etapa, tem autoridade para indicar e fazer proceder a microscopia de lâmina, ou dispensá-Ia. Há, entretanto, critérios obrigatórios de microscopia: requisição do médico, dados numéricos alterados em casos novos (plaquetas < 60.000/J.!L, Hgb < 12,5 [d'] e < 10,5 [9] /dL, leucó- citos < 3.500/J.!L], índices hematimétricos improváveis, linfocitoses inexplicadas e jlags. Também são examinadas lâminas em casos com anotação clínica de linfonodomegalias, suspeita de linfoma, pedidos de contagem de bastonados e pré-eclâmpsia. No New York Presbiterian, o procedimento-padrão inclui as ações que devem ser tomadas em relação a cada jlag da extensa lista do *Comagradecimentos à Dra. Barbara Bain (St. Mary'sHospital) e ao Dr.Ricliard Silver (New YorkHospital). 46 Renato Failace & cais. Beckmann-Coulter e à igualmente extensa lista de achados anormais nas contagens. Exige-se microscopia em todas as anemias com micro ou macrocitose ou RDW > 20. No leucograma, leucócitos < 2.000 ou > 20.000/I-1L, linfócitos > 60%, monócitos > 15%, basófilos > 5%, eosinófilos > 30%, eritroblastos > 5% e plaquetas < 20.000 /1-1L. Laboratórios consultados em Buenos Aires optam por critérios similares aos usados em Porto Alegre. Com os critérios descritos, no laboratório do autor eram feitas e examinadas lâminas em 20 a 30% dos hemogramas dos pacientes de ambulatório. A porcentagem era alta, porque o laboratório atendia a clínica de vários hematologistas e serviços de oncologia. Em labo- ratórios para pacientes oriundos de ambulatórios de atendimento de massa, a porcentagem a examinar, com esses critérios, costuma estar entre 10 e 20%. Se levar-se em conta que, na verdade, essas porcentagens são coerentes com o número de hemo gramas efetivamente anormais, as medidas tomadas parecem estatisticamente corretas. O problema é que os 20% (por hipótese) anormais não são exatamente os mesmos 20% examinados: há falso-positivos e falso-negativos em ambos os grupos! Sempre são examinados desnecessariamente alguns normais, em de- trimento de alguns anormais não examinados. Na experiência do autor, após uma década (anos 1990) de uso contínuo dos contadores eletrônicos descritos, com observação micros- cópica complementar feita em todos os hemogramas, as alterações da Ta- bela 1.3 costumam passar despercebidas pela tecnologia. Embora a lista de "dados perdidos" seja extensa, há que se re- conhecer que: 1. A maioria das alterações listadas costuma acompanhar-se de alte- rações numéricas (p. ex., anemia), que indicariam necessidade de microscopia complementar. 2. Algumas, embora biologicamente relevantes, não têm significação clínica. A ovalocitose sem anemia e a anomalia de Pelger-Huêt são estigmas curiosos, sem consequências para os portadores; mas justifica-se fazer hemo grama num laboratório de alto conceito e receber um resultado sem a percepção dessas anomalias? É o que ocorre agora, com a vitória da automação sobre o artesanato. 3. O fato de fazer-se observação microscópica complementar como rotina não significa, por outro lado, que as alterações citadas serão notadas. Da Tabela 1.3, algumas são quase sempre notadas (ovalo- Hemograma 47 TABELA 1.3 O que as mÓ~uinas não veem No eritrogramo Policromatocitose Pecilocitose (de um modo geral) Pecilócitos específicos Inclusões (Jolly, pontilhado basófilo, outras) Eritroblastos < 5% (salvo alguns modelos top of line) Rouleoux No leucograma Desvio à esquerda (há flag /mm GranslBonds em 80% dos casos com neutrofilio, mas em menos de 40% dos casos sem neutrofilia); a anomalia de Pelqer-Huét nunca é notada Granulações tóxicas e corpos de Dõhle Plasmócitos Linfócitos atípicos (há flag Variant /ymphs em 80% dos casos com linfocitose, mas, em menos de 30%, sem linfocitose; identificam muitos como monócitos) Linfócitos linfomatosos ou leucêmicos em pequeno número (há Flog Blasts quando mais de 5- 10%) Linfócitos com granulação ou vacuolização anormais Hoiry cells geralmente aparecem como monócitos No plaquetograma Agregação, quando discreta (agregação acentuada sempre causa Flag P/t oggregation) Satelitismo plaquetário (há trombocitopenia sem flog) citose, rouleaux, desvio à esquerda e Pelger, granulações tóxicas, linfócitos atípicos e plasmocitose); outras, menos vezes. Por outro lado, nos exemplos a seguir, os dados perdidos teriam grande importância se fossem notados: 1. Policromatocitose sem anemia: com hemoglobina próxima ao limite superior da normalidade, é sinal de anoxemia; próxima ao limite inferior, sugere perda sanguínea recente. 2. Esferocitose, mesmo sem anemia, é um diagnóstico relevante; explicaria litíase, subicterícia, etc. Às vezes, a máquina nota-a pela elevação da CHCM. 48 Renato Failace & cols. 3. Acantocitose e corpos de Howell-Jolly indicam hipofunção esplê- nica. Se forem notados em paciente esplenectomizado,.o achado é irrelevante (porque já sabido); em paciente não-esplenectomizado, entretanto, é altamente relevante, pois sugere doença inflamatória crônica do trato digestivo, geralmente de difícil diagnóstico. 4. Leptocitose indica doença hepatobiliar; rouleaux indica eritrossedi- mentação elevada. S. A presença de eritroblastos e de mielócitos pode ser sinal de me- tástases ósseas de tumor, mas é rara sem anemia. 6. O desvio à esquerda, as granulações tóxicas e os corpos de Dôhle são discutidos no leucograma. A plasmocitose e os linfócitos atípicos são fundamentais para o diagnóstico de viroses. 7. É desnecessário comentar a importância do achado de células linfomatosas e leucêmicas. Não é raro vê-Ias em pequeno número, ainda sem linfocitose significativa nem alterações numéricas das demais séries. A lista de exemplos poderia ser infindavelmente alongada. É fá- cil compreender que o ganho geral na precisãodos números acompa- nhou-se de certo retrocesso na citologia de casos pontuais. Técnica e cuidados para a microscopia São distendidas lâminas para exame das amostras incluídas nos critérios anteriores. Nos laboratórios de grande porte, com centenas de hemogramas/dia, os parâmetros de referência para esse fim costu- mam estar incluídos no sistema: resultados que dispensarem mícros- copia são liberados por interfaciamento com o computador central, sem interferência humana. Naqueles que não passarem no crivo, o resultado é impresso para avaliação pelo técnico sênior, e lâminas são requisitadas. Havendo uma central inteligente e equipamento automa- tizado, as lâminas são distendidas e coradas automaticamente a man- do do sistema. Laboratórios menores imprimem todos os resultados para aprecíá-los e julgá-los um a um. O autor recomenda identificar as lâminas com o número do registro do paciente, escrito na extremidade fosca da lâmina, a lápis ou com tinta indelével. A coloração é feita em equipamento auto ma- tizado ou manualmente, se o número de lâminas for pequeno, com corantes Wright-Giemsa ou May-Grünewald-Giernsa. A procedência Hemograma 49 e a qualidade dos microscópios depende da disponibilidade financei- ra do laboratório, mas o autor recomenda que todos sejam equipa- dos com objetivas de imersão de 50 aumentos e oculares Wide Field de 10 aumentos. Essa combinação gera um campo microscópico no- tavelmente amplo e nítido. O alto preço dessas objetivas é amplamen- te compensado pelos resultados. Objetivas a seco não permitem igual qualidade de visão; objetivas de imersão de 100 aumentos, mesmo em microscópios de ótima qualidade, perdem em nitidez o que se ganha em ampliação, limitam a extensão do campo examinado e aumentam o tempo gasto para observar um número significativo de células. O autor utiliza-as raramente, e só para ver células especiais ou inclusões celulares. O exame microscópico exige rigorosa disciplina. Começa-se pela inspeção da série vermelha; para isso, devem ser focados campos onde os eritrócitos tocam-se quase sem superposição; observam-se a forma, as dimensões e a anisocitose (comparando com o VCM, o RDW e examinando o histograma), a coloração (com especial atenção para policromatocitose) e o empilhamento; deve-se julgar se os dados nu- méricos, que devem estar sempre disponíveis ao observador, são con- dizentes com o que é visto. A seguir, estima-se o número de plaquetas e compara-se com a cifra contada. Passa-se à série branca; para iniciar, comparando a contagem fornecida com o número de leucócitos vistos por campo. Se o equi- pamento não fornecer a fórmula, ou fornecer só fórmula simplificada (de três elementos), a fórmula é feita, identificando-se e anotando-se 100 leucócitos, mas o exame é prorrogado a 200 se houver leucoci- tose, porcentagem elevada de células de baixa frequência (basófilos, plasmócitos) ou células anormais. Anotam-se os neutrófilos basto nados em separado dos segmentados; como a fórmula é visual, cabe registrar desvio à esquerda, se houver. Deve-se atentar para atipias linfocitárias (especialmente se houver linfocitose ou neutropenia). Observa-se se a fórmula é compatível com o grupo etário do paciente e com a fórmula de três elementos fornecida pela máquina, se for o caso. A experiência do observador não deve ser invocada para justificar um encurtamento aquém de 90 segundos do tempo de observação. Ha- vendo fórmula automatizada completa, analisam-se da mesma maneira a série vermelha e as plaquetas e, se a fórmula for normal e o scatterplot mostrar boa separação dos tipos celulares, observa-se (sem contar) ao menos 20 neutrófilos para excluir desvio à esquerda (já que a máquina não distingue bastonados e segmentados). A seguir, revisa-se a mor- 50 Renato Failace & cais. fologia dos linfócitos; se for normal, sem plasmócitos, mielócitos ou células mais raras, libera-se a fórmula fornecida pela máquina para o computador do laboratório; o tempo gasto com essa microscopia sem fórmula cai a cerca de 30 segundos. As alterações notadas à microscopia devem ser transcritas nos resultados. Dentre as usuais, algumas são objeto de quantificação pelo próprio contador eletrônico: macro e microcitose pelo VeM, anisoci- tose pelo RDW, etc. Outras, como a presença de leucócitos imaturos (mielócitos, blastos) ou inconstantes (plasmócitos) transcrevem-se incluindo-os nos 100 leucócitos da fórmula leucocitária. Há alterações, entretanto, que não se relacionam com os dados fornecidos pelas máquinas, e que é impossível ou inviavelmente tra- balhoso converter em números ou porcentagens, como a policromato- citose, a frequência dos vários tipos de pecilócitos entre os milhões de eritrócitos, de linfócitos atípicos dentre os linfócitos normais - pois há formas de transição - e várias outras. E não basta anotar, de modo simplista, presença de policromato- citose: identificar um eritrócito policromático a cada 10 campos mi- croscópicos não é o mesmo que notar 10 eritrócitos policromáticos a cada campo! Até a gravidez pode causar o primeiro achado; só uma anemia hemolítica, raramente uma pós-hemorrágica, causa o segun- do. Anotação idêntica em ambos os casos é um desserviço: há que anotar a policromatocitose quantificada. A adjetivação da magnitude de uma alteração ou da frequên- cia de um elemento anormal é prática corrente e tradicional. Termos como (para grau da alteração) (para frequência do elemento) leve discreta moderada nítida acentuada considerável raros ocasionais alguns vários muitos (as) numerosos (as) são amplamente empregados. A grandeza expressa por esses adjeti- vos, entretanto, é subjetiva: depende demais dos olhos e da imagina- ção dos que veem a lâmina e dos que leem os resultados. O problema não é só brasileiro ou da língua portuguesa. Em inglês são usados os seguintes termos: Hemogromo 51 slight mild moderate marked rare occasional afew many Além deles, até a indesejável observação high band (ou low band) é usada para dispensar a numeração de 100 leucócitos na fórmula visual (manual), para obtenção de um valor percentual para os neu- trófilos bastonados. Publicações internacionais e uma recomendação antiga da OMS preconizam semiquantijicação de 1+ a 4+ como critério mais repro- dutível e uniforme. Os fabricantes das principais linhas de contadores eletrônicos já a adotaram nos comentários sobre os resultados; pre- feriram, entretanto, simplificá-Ia para 1+ a 3+. O autor recomenda esse procedimento nos termos da Tabela 1.4. I TABELA 1.4 Semiquontificcçõo de 1+ a 4+ "-... 1+ = olteração notada só com especial atenção (p. ex., policromatocitose em gróvida) 2+ = alteração notada no exame de rotina, mas não chamativa (p. ex., acantócitos em esplenectomizados) 3+ = alteração óbvia, imediatamente notada (p. ex., granulações tóxicas em paciente recebendo filgrastima) 4+ = alteração móxima, presente em grande número de células (p. ex., policromatocitose em anemia hemolítica autoimune, eritrócitos em alvo na hemoglobinopatia C homozigótica) (No preferência por apenas 1+ o 3+, os conceitos 1+ e 2+ acima corresponderão o 1+, e os demais serão idênticos, só que poro 2+ e 3+.) ERROS MAIS COMUNS Há erros, ditos pré-analíticos, que decorrem de imperfeição da amostra de sangue levada à máquina, não de mau processamento. São numerosos e comuns: 1. Sangue coagulado: a demora na aspiração do sangue à coleta permite ativação das plaquetas e da coagulação antes da ação do EDTA.Quando a coagulação no tubo é completa, é facilmente 52 Renata Failace & cais. notada pelo operador; o sangue é desprezado e nova coleta solici- tada. Quando a coagulação é parcial, há consumo progressivo das plaquetas, formação de filamentos dispersos de fibrina, às vezes pequeno coágulo junto à rolha, e pode não ser notada. Algumas vezes, a fibrina impede a aspiraçãoou entope a agulha aspiradora do instrumento, e o resultado é rejeitado com o flag apropriado. Outras vezes, a máquina aspira soro, com mais ou menos glóbulos, variavelmente retidos na fibrina; o resultado é totalmente errado, mas enganoso, pois mostra pancitopenia, porém a anemia tem índices eritroides coerentes. Qualquer citopenia sem causa óbvia exige cuidadosa inspeção da amostra de sangue. 2. Plasma derramado: a perda de plasma, por derramamento ao abrir-se a rolha ou por vazamento, quando os glóbulos estão sedimentados, causa um aumento harmônico das contagens e da hemoglobina que facilmente passa despercebido. O operador deve atentar para tubos sujos por fora, e o técnico sênior deve estranhar valores hematimétricos elevados sem razões óbvias. 3. Material hemolisado in vitro: causa desproporção entre a dosa- gem de hemoglobina, que permanece correta, e a contagem de eritrócitos, erroneamente diminuída, com aumento impossível da concentração hemoglobínica corpuscular média (CHCM). Deve-se observar a cor do plasma, no sangue sedimentado ou centrifugado, sempre que CHCM > 35%. Quando há hemólise significativa, os estromas interferem na contagem de plaquetas, com resultados aberrantes, geralmente comflag. O julgamento caso a caso pode permitir que resultados de amostras com hemólise leve, com CHCM ainda normal, sejam aceitos. 4. Anticoagulante (EDTA) em excesso, geralmente por volume de sangue inferior ao apropriado ao tubo, causa desidratação dos eritrócitos, só parcialmente corrigida pelo solvente usado no contador eletrônico, e há diminuição do volume corpuscular e dos parâmetros dele derivados. Quando o tubo contém EDTA em solução, o sangue dilui-se excessivamente, com baixa paralela das contagens e da hemoglobina. O hemo grama, feito do sangue coletado em tubo para testes de coagulabilidade (nove partes para uma de solução de citrato de sódio), expressa essa diluição; a contagem de plaquetas baixa desproporcionalmente, porque o citrato não impede a agregação. Hemograma 53 5. Sangue velho ou malconservado: o sangue, in vitro, tem durabilidade limitada. A temperatura alta e a trepidação no transporte aceleram a deterioração: há hemólise, cariólise, cariorrexe e citólise dos leucó- citos e agregação e lise das plaquetas. Conservado a mais de 20°C, começa a putrefação após 48 horas. Os prazos usuais de conservação adequada para contagens eletrônicas em sangue coletado em tubo es- téril, mantido sem agitação, são: 26 a 35°C = 4 horas, 8 a 25°C = 12 horas, 1 a 7°C = 24 a 48 horas. O laboratório deve ser informado da hora de coleta e das condições de transporte de materiais enviados. Em postos de coleta afastados, a coleta tardia (após a passagem do transporte diário) é possível: coleta-se o sangue, distendem-se duas lâminas (identificadas e guardadas em caixa fechada, à temperatura ambiente) e conserva-se o sangue em refrigerador até o transporte e o processamento na manhã seguinte. O contador Cell-Dyn 4000 identifica no canal de fluorescência e conta os leucócitos em necro- biose, pois a permeabilidade alterada das membranas permite-lhes absorver fluoresceína, que marca os núcleos. A fração leucocitária viável (WVF) aparece no resultado como decimal da unidade; nos sangues recentemente coletados, WVF > 0,980. 6. Falta de homogeneização do sangue ao entrar na máquina: causa aspiração incorreta, com excesso de plasma ou de glóbulos. O resultado é totalmente errado, mas, como há compatibilidade entre as cifras e os índices hematimétricos são coerentes, o erro facilmente passa despercebido. Há necessidade de alto grau de des- confiança para estranhar eritrocitoses ou anemias sem justificativa aparente ou contagens de leucócitos incompatíveis com o aspecto à microscopia. Nos aparelhos atuais, com transporte automático das amostras e agitação incluída no sistema, o erro por falta de homogeneização geralmente decorre de um excesso de sangue no tubo, faltando espaço aéreo para a agitação apropriada. 7. Crioaglutinação: é um defeito intrínseco do sangue em exame, mas pode ser dito pré-analítico, porque o fenômeno ocorre pelo resfriamento à temperatura da sala (ou do refrigerador), antes da entrada na máquina. A aglutinação dos eritrócitos faz contar dou- blets ou triplets como um só glóbulo, a contagem é grosseiramente falseada para menos, e o VCM para mais, gerando uma CHCM impossível. Um resultado do Coulter STKS é visto na Figura 5.4, p. 139. Para corrigir o problema, geralmente basta aquecer o sangue 54 Renato Failace & cols. em banho-maria a 37°C e processá-lo imediatamente. Em salas frias, pode haver necessidade de aquecer os solventes com estufas sob as mesas. Em casos extremos (crioaglutininas com título> 1.000), as contagens podem ser impossíveis. Crioglobulinas em concentrações altas podem causar gelificação do plasma e interferir na aspiração da amostra; alguns instrumentos geramflag nessa eventualidade. Podem também interferir na contagem de plaquetas, raramente na de leucócitos. Em todos os casos em que o problema pré-analítico gera defeito irreversível na amostra (itens 1 a 5, anteriores), a repetição do exa- me repetirá o erro. Nova coleta torna-se indispensável. A diplomática função de pedir o retorno do(a) paciente para esse fim é uma tarefa diária em laboratório que coleta mais de mil hemogramas por dia. Há erros analíticos, decorrentes de mau funcionamento ou ma- nipulação inadequada dos contadores eletrônicos e de interpretação incorreta dos resultados da máquina e dos achados da microscopia. Para notá-los, persiste a necessidade do alto grau de desconfiança, dos operadores aos técnicos seniores, até a liberação dos resultados. Mes- mo porque há erros inexplicáveis: a máquina fornece uma série de hemo gramas impecáveis e, no meio deles, um, com a série vermelha erroneamente elevada e/ou leucocitopenia espúria; repete-se, e tudo está normal. Os erros analíticos serão discutidos com as determina- ções hematimétricas especificamente afetadas. Além desses erros, podem ocorrer trocas de material, erros na iden- tificação, na transcrição, no fornecimento verbal, telefônico, por fax ou intemet dos resultados, no processamento de dados, etc. Não há uma solução geral para esse problema; sempre haverá uma previsão de erros e consequente tolerância das partes envolvidas, quando ocorrerem. Assim, qualquer resultado que suscite dúvidas na interpretação exige reconferência e/ou repetição does) exame(s). O autor recomen- da uma linha telefônica de ligação gratuita com esta frase impressa nos resultados: dúvidas na interpretação ou inconformidades, consulte- nos pelo fone 0800 ... Quando um resultado duvidoso for proveniente de um labora- tório que mereça confiança, deve ser repetido no mesmo, após con- tato direto entre o médico requisitante e o patologista-clínico, para esclarecimentos. Os pedidos de reconferência devem ser recebidos no laboratório com o maior respeito e, naturalmente, a preço zero. Hemogroma 55 EXPRESSÃO DOS RESULTADOS A Figura 1.7 mostra o layout recomendado pelo autor. HEMOGRAMA linha e modelo do contador eletrônico usado (informar, aqui ou no fim) ERITROGRAMA Eritrócitos' Hemoglobina Hematócrito VCM HCM CHCM RDW milhões/f.ll g/dl % fl pg % (ou g/dl) % AQUI: observações (se houver) sobre a série vermelha, interpretação do histograma (se alterado), reticulócitos % e If.ll (se foram contados) lEUCOGRAMA leucócitos If.ll Neutrófilos % If.ll (distinguir bostonodos e segmentados, se for notado desvio à microscopio) linfócitos % If.ll Monócitos % If.ll Eosinófilos % If.ll Basófilos % If.ll (mielócitos, blostos e outros, se houver) Com (ou sem) observação microscópica complementar (anotar o opção havido no caso) AQUI: observações sobre o série bronco (se pertinentes) If.ll fl (se o laboratório tiver comprovação da estabilidade do VPM e valores de referência próprios) AQUI:observações sobre as plaquetas (se pertinentes) PLAQUETAS VPM FIGURA 1.7 Layouf recomendado para resultado de hemograma . • Eritrócitos, hemácias e glóbulos vermelhos são sinônimos perfeitos. O autor prefere eritrócitos pela derivação grega coerente com leucócitos e demais nomes de células, e pelo uso consagrado de derivados, eritrocitose, eritrocitopenia, eritropoese e outros, impossíveis de derivar de hemácias. Glóbulo vermelhõ é uma tradução popular de eritrócito. 56 Renato Failace & cols. Salvo em instituições fechadas, com médicos iniciados na tecno- logia do hemo grama automatizado, os laboratórios não fornecem aos pacientes e/ou médicos requisitantes os resultados originais, gerados nas impressoras dos contadores eletrônicos. As razões são várias: • As abreviações e siglas, em inglês, os gráficos eflags são ininteligíveis para os não-iniciados nessa tecnologia. Mesmo o aprendizado da interpretação dos resultados de um tipo de máquina não implica na compreensão dos resultados de outras; são todas diferentes. • A entrega do resultado original, junto com uma transcrição para a forma convencional, curioso costume de alguns laboratórios bra- sileiros que usam contadores de pequeno porte, não deve ser feita. Causa confusão ou a preferência pela transcrição com desprezo da original; trabalho perdido. A inserção de células não descritas pela máquina na fórmula, mas notadas à microscopia, geraria um resultado duplo e ambíguo com risco de decisões médicas errôneas por interpretação afoita de resultados incompreendidos. • O interfaciamento entre os contadores e os computadores do la- boratório permite a transmissão automática de todos os valores numéricos originais para um layout próprio, com terminologia por extenso, em português. A transmissão dos histogramas, por outro lado, mantém-se difícil ou impossível. As valiosas curvas são sone- gadas nos resultados, daí a necessidade de substituí-Ias por frases esclarecedoras.