biologia molecular PCR

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MÉTODOS INVASIVOS E NÃO INVASIVOS DE COLETA
Varia de acordo com a análise pretendida, a colheita invasiva de amostras é necessária
para alguns testes específicos e é caracterizada por coleta de sangue, lavados
bronquicos, raspagem, punção lombar, biópsias, etc. A colheita de sangue por punção
venosa, arterial ou capilar é o método mais utilizado e menos invasivo que a biópsia.
Exemplos de métodos menos invasivos são a recolha de celulas da boca, recolha de
fezes, swab de liquidos vesiculares ou purulentos, secreções ou de urina podem ser
usados para genotipagem e citogenetica, a colheita de amostras não invasivas é sempre
preferivel por apresentar menos desconforto e riscos tanto para o animal qnto pro
coletador.
ESTABILIDADE DAS AMOSTRAS
Para uma melhor preservação das amostras elas podem ser divididas em
aliquotas(porções) de acordo com diferentes finalidades viabilizando o uso de diferentes
procedimentos e tbem tampões e condições de armazenamento. Os principais fatores que
afetam a estabilidade de amostras são os anticoagulantes, temperatura, tempo de
processamento, esterilidade e as propriedades endogenas como as enzimas degradantes
e a apoptose celular
AGENTES ESTABILIZANTES E ANTICOAGULANTES
São usados geralmente quando o método de congelamento para preservação da amostra
não é possível, são exemplos o EDTA(acido etilenodiaminotetracetico) e o ACD(acido
citrico, citrato de sodio e dextrose) que são anticoagulantes. São escolhidos dependendo
a analise que sera realizada, alguns agentes são melhores ou necessários e outros são
contraindicados, o ACD como agente estabilizante assegura uma maior qualidade do RNA
e DNA extraido já o EDTA é utilizado para manipulação a partir do DNA mas coloca em
risco a analise citogenetica.
Se as amostras não forem processadas logo após a colheita a temperatura e o tempo em
que as amostras forem expostas podem afetar a sua estabilidade, no caso especifico do
sangue a amostra é separada em componentes como soro plasma e celulas
imediatamente após sua recolha e cada componente é mantido na sua temperatura
apropriada, congelar sem separação pode inviabilizar a utilização para pesquisa de dna e
rna pois a hemoglobina libertada devidoa hemolise pode ter um efeito inibidor da pcr.
*TEMPERATURAS
DNA: durante semanas a 4 graus, meses a -20 graus e anos a -80 graus.
RNA: semrpe manter a -80 graus
CELULAS: temperatura ambiente até 48 horas e após criopreservado a -196 graus em
azoto liquido.
ESTERILIDADE
Condições assepticas durante a colheita e processamento da amostra é essencial para o
isolamento do dna ou rna porque a contaminação devido a bacterias, fungos e outros
organismos pode ser prejudical a integridade da amostra.
DEGRADAÇÃO
A digestão enzimatica pode afetar muitos biomarcadores, o rna é sensível a enorme
quantida de ribonucleases (rnases) então é add inibidores de rnases como o
dietilpirocarbonato(DEPC). Já o dna é mais estavel sendo que a sua exposição a 37 graus
por uma semana não afeta o rendimento da extração de dna essa estabilidade permite a
analise de fluidos corporais secos, sangue coagulado, manchas de sangue seco em
laminas e amostras embebidas em parafina, etc.
APOPTOSE CELULAR
As amostras originais precisam ser tratadas com cuidadoe sob condições que assegurem
que as celulas permanecerão intactas, se o objetivo for o armazenamentoe m baixas
temperaturas é aconselhavel adicionarum agente crioprotetor como o glicerol ou uma
solução de dimetilsulfoxido(dmso) a 10%.
TRANSPORTE DAS AMOSTRAS
O transporte de substancias infecciosas é coberto por regulamentação internacional e a
OMS possui diferentes normas relativas ao transporte, o envio de amostras biologicas por
correio postal é viavel e não compromete a qualidade do DNA, no entanto praticas de
segurançapostal recentes incluindo a irradiação das embalagens pode afetar de forma
irreversivel as amostras.
As responsabilidades do transporte das amostras são divididas entre o remetente que
deve acondicionar de forma segura as amostras e com informações pertinentes na
embalagem, o transportador que deve garantir uma infraestrutura para realizar o
transporte de forma rapida e eficiente e assegurar que a documentação esta em ordem
bem como a embalagem, e o destinatario deve fazer a abertura da embalagem de forma
segura e a manutenção da integridade bem como conferir as condições do momento da
recepção.
SISTEMA DE EMBALAGENS
A embalagem apropriada serve para assegurar a integridade dos materiais enviados e 
minimizar o risco potencial de danos durante o seu transpor te.
As amostras biológicas devem ser acondicionadas para transporte num sistema de 
embalagem tripla. Esse sistema consiste de três recipientes:
Recipiente primário
É um recipiente à prova de vazamento, etiquetado, que contém a amostra, como um tubo 
de cultura, um tubo 
de sangue, um frasco de vidro ou outros recipientes similares.
O recipiente primário é envolvido em material com capacidade para absorver todo o fluido 
em caso de ruptura e deve ser selado para impedir vazamentos. As tampas de rosca 
devem ser envolvidas com fita adesiva ou filme plástico.
Recipiente secundário
É um segundo recipiente à prova de vazamentos, que encerra e protege o(s) recipiente(s)
primário(s). Podem ser colocados vários recipientes primários num recipiente secundário. 
Nesse caso, cada recipiente primário deve ser envolvido individualmente em material 
absorvente, evitando o choque entre os recipientes.
Embalagem externa
Serve para proteger o recipiente secundário e o seu conteúdo de fatores externos como o 
impacto físico e umidade durante o transporte, além de identificar o conteúdo através da 
sinalização adequada e outras informações obrigatórias.
CATALOGAÇÃO DE AMOSTRAS PARA TRANSPORTE
As definições que são seguidas são baseadas no manual de transporte de substancias
infecciosas da OMS e essas substancias são classificadas em duas categorias
A: substancia que quando ocorre a exposição pode causar danos muito graves e até a
morte.
B: outras substancias que não se encaixam na categoria A, que são a maioria das
amostras.
EXTRAÇÃO DE ACIDOS NUCLEICOS
Deve se levar em conta a natureza da amostra porque algumas possuem inibidores que
podem interferir no proceso de extração, por exemplo o EDTA ou Heparina que interferem
na reação de ampliação da amostra nesse caso o anticoagulante ACD sera a melhor
escolha quando se pretende isolar DNA a partir de uma amostra de sangue.
A seleção do metodo de extração depende de vários fatores: natureza da amostra,
preparação da amostra, amplificação por PCR e suas variantes, qntidade de amostra,
eficiencia e rendimento da estração, qualidade e pureza do acido nucleico extraido e
capacidade da remoção de contaminantes.
MÉTODOS
*MÉTODO DE FERVURA: tecnica mais simples para isolamento de acidos nucleicos
particularmente de DNA, consiste em incubar as amostras a temperaturas elevadas entre
90 e 100 graus envolvendo uma digestão com proteinase k seguida de centrifugação, é
uma tecnica rapida mas o dna extraido tem baixo grau de pureza havendo o risco de
falsos negativos pela alta presenã de proteinas.
*SALTING OUT: tecnica convencional que origina a precipitação das proteínas e dos
outros constituintes celulares utilizando altas concentrações de sais como o acetato de
potássio ou de amonia, os precipitados são removidos por centrifugação e o dna é
recuperado após uma precipitação com alcool. O rendimento e a pureza são variaveis
devido o DNA obtido estar contaminado com proteínas e outros restos celulares sendo
necessario um tratamento com rnases e repetição da precipitação com alcool. 
*SOLVENTE ORGANICO>FENOL-CLOROFORMIO: É a tecnica eferencia para extração
de acidos nucleicos, as celulas são lisadas utilizandoum detergente e posteriormente o
DNA é extraido atraves da utilização de solventes organicos. A utilização do fenol na
extração e do etanol na precipitação é um metodo apropriado para a purificação de DNA a
partir de pequenos volmes e baixas concentrações, o cloroformio é um bom desnaturante
de proteínas.
*TECNOLOGIA DE TROCA IONICA: Bseia-se na interação especifica entre grupos
fosfatos carregados negativamente do acido nucleico e moleculas carregadas
positivamente na superficie de um substrato, não utiliza substancias toxicas.
*EXTRAÇÃO COM COLUNAS DE SILICA: Baseia-se na adsorção seletiva de acidos
nucleicos a uma camada de silica na presença de altas concentrações de sais caotropicos
e a utilização de tampoes otimizados durante a lise celular garante a adsorção exclusiva
do DNA a silica enquanto as proteinas e outros contamiantes permanecem na solução e
serão eliminados atraves de lavagens.
*SEPARAÇÃO MAGNETICA: Baseia-se na ligação reversiveldo DNA a uma superficie
solida (particula magnetica) que está revestida com um anticorpo de ligação ao dna ou a
um grupo funcional que interage especificamente com este acido nucleico.
*METODO DIRETO DE LISE: Realiza-se uma lise direta da amostra por incubação da
mesma juntamente com um tampão de lise, no final a amostra está pronta sendo a
purificação facultativa, é rápido e facil mas tem baixo grau de pureza e baixo rendimento
na extração.
QUANTIFICAÇÃO E CONTROLE DA QUALIDADE DOS ACIDOS NUCLEICOS
Os metodos mais frequentemente utilizados na estimativa da concentração de acidos
nucleicos baseiam-se em espectrofotometria, fluorimetria e geis de agarose, as bases
nitrogenadas absorvem fortemente no espectro ultravioleta, as medições de amostras são
comparadas com os padroes para determinara concentração de DNA.
A espectrofotometria pode ser definida como toda técnica analítica que usa a luz para
medir as concentrações das soluções, através da interação da luz com a matéria. 
Fluorimetriaé um método de análise usado na determinação quantitativa ou qualitativa de
substâncias que são capazes de emitir fluorescência. 
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e
então gelifica quando esfria como a gelatina. Para realizar uma eletroforese, um gel de
agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma
corrente elétrica é aplicada através do gel. Como o DNA é negativamente carregado, ele é
atraído pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve
migrar através do gel de agarose.
CAPÍTULO 3
Quais são as vantagens e desvantagens do diagnóstico biomolecular quando comparado 
por análises microbiológicas
 Na microbiologia convencional, as amostras são processadas de forma a ser 
possível isolar, em culturas puras, os diferentes microrganismos presentes, os 
quais são depois submetidos a testes de identificação baseados nas suas 
características microscópicas (tintoriais e morfológicas), culturais, fisiológicas e 
bioquímicas, designadas no seu conjunto por características fenotípicas. Em 
contraste com estas, a identificação molecular baseia-se principalmente na análise 
dos ácidos nucléicos e não no produto da sua expressão, ou seja, baseia-se nas 
características genotípicas dos microrganismos.
Defina um falso positivo e um falso negativo
 O falso positivo surgem quando o ác nucleico do agente a ser detectado é 
introduzido involuntariamente na amostra a ser testada ou quando o teste não 
possui a capacidade de amplificar apenas o alvo molecular pretendido, 
introduzindo as amplificações de outras regiões genéticas além do alvo. Problemas
dessa natureza estão relacionados com a contaminação cruzada, no caso de 
presença de DNA externo e/ou falta de especifidade analítica do teste. 
 O falso negativo em ensaios de diagnóstico molecular, especialmente os baseados 
na técnica de PCR, podem surgir devido a problemas encontrados em vários 
estágios do procedimento de diagnóstico molecular sendo os mais comuns a 
quantidade insuficiente do material genético extraído e a inibição da reação. A PCR
é muito sensível a presença de certas substâncias. Esses inibidores de PCR 
podem ter origem na própria amostra ou nos reagentes usados na colheita e na 
preparação da mesma. Substancias como os grupos heme presentes no sangue 
total, bilirrubina, bílis e sais, podem inibir uma reação de amplificação de ácidos 
nucleicos, realizada a partir de amostras biológicas, tais como tecidos animais e 
fluídos corporais. A polimerase de DNA também é muito sensível a uma variedade 
de compostos orgânicos e inorgânicos, que incluem proteinase K, ureia, 
detergentes, heparina, fenol, acetato de sódio, EDTA e isotiocianato de guanidina.
Quais são os parâmetros para precisão estatística nos procedimentos de biologia 
molecular?
 A precisão estatística de um procedimento analítico é expressa pela variância, o 
desvio padrão ou o coeficiente de variação de uma série de medições obtidas em 
testes de repetição. Expressa o grau de concordância entre uma série de medidas 
obtidas através da amostragem múltipla de uma mesma amostra homogênea. 
Precisão estatística não é sinônimo de exatidão, pois um teste pode ser muito 
preciso, dando sempre o mesmo resultado com uma variância muito baixa entre 
ensaios, mas pode dar um resultado repetidamente sem exatidão ou incorreto. 
CAPÍTULO 4
Descrever sobre os requisitos essenciais para biossegurança
 Os laboratórios de biologia molecular devem ser, no mínimo, nível 2 de segurança 
biológica, conforma a classificação da organização mundial da saúde. 
 Instalações: o espaço deve ser amplo sem existir superlotação de pessoal e 
equipamento. As paredes, pavimento e bancadas devem ser de material 
impermeável e resistente a produtos químicos entre outras substâncias. A 
iluminação deve ser adequada para todas as atividades. Os sistemas de ventilação
mecânica devem injetar um fluxo de ar sem recirculação e as janelas devem ser de
abrir e devem estar equipadas contra vetores. O fornecimento de energia deve ter 
potência de 30% acima da dos equipamentos instalados e é desejável que esteja 
ligado a um gerador para o equipamento essencial. O espaço de armazenamento 
deve ser apropriado para guardar materiais de uso corrente. Armários de 
segurança para armazenamento e manipulação segura de solventes, álcoois e 
álcalis. Roupas e objetos pessoais devem ficar fora do laboratório. Devem ser 
equipados com dispositivos de proteção e prevenção de fogo, equipamentos de 
segurança (ducha, pia).
 Pessoal: o laboratório deve ter uma lista com o nome do pessoal autorizado a 
entrar. O pessoal deve estar equipado com material de proteção individual 
apropriado. Todo o pessoal deve estar ciente de que não pode colocar nenhum 
material que esteja no laboratório na boca (pipetas, material de escrita, etc) e 
também ciente das regras básicas como não comer, fumar, beber, etc. O 
equipamento de proteção não deve circular fora do laboratório. Não pode usar 
sapatos abertos. Proibida a entrada de crianças no laboratório. 
 Procedimento: Todos os procedimentos devem estar escritos e aprovados pelo 
responsável do laboratório ou orientador do estudo. Devem ser previstos 
procedimentos operativos para as condições de funcionamento de equipamentos, 
manutenção interna, limpeza e eliminação de resíduos. Nos procedimentos 
técnicos, devem estar descritas as operações técnicas a realizar associada a cada 
equipamento, além de conter instruções detalhadas de execução de forma a 
minimizar a produção de aerossóis e gotículas. Todos os equipamentos, recipientes
e materiais devem ser identificados de forma a prevenir contaminações. 
Quais são os fatores de contaminação na biologia molecular
 As contaminações relevantes em laboratórios com técnicas moleculares 
implementadas prendem-se com apresença indesejada de produtos de ácidos 
nucleicos que poderão servir de molde em reações de amplificação in vitro. As 
origens mais frequentes dessas contaminações provém de produtos de PCR 
obtidos em reações anteriores, purificação dos clones de plasmídeo, isolamento 
repetido de ác nucleicos que, mesmo em quantidades vestigiais, poderão servir de 
molde em subsequentes reações indesejáveis de amplificação in vitro. 
 Os produtos de PCR ou DNA molde difundem-se por aerossóis quando os tubos 
são abertos, podendo ser vinculados com canetas, materiais de proteção 
individual, entre outros que em contato eventual com novas amostras e reagentes, 
poderão ser fatores de contaminação de difícil remoção.
 A probabilidade de contaminação por produtos de PCR decresce nas reações 
utilizadas na investigação, dado o menor número de ensaios com as mesmas 
características e a variabilidade de modelos e das amplificações desenvolvidas. 
 Contaminação cruzada entre amostras em fase de preparação e extração de 
ácidos nucleicos que poderá inviabilizar a análise de resultados e/ou dar origem a 
resultados errados.
Esquematizar o fluxo para processamento de amostras em análises de PCR

Descreva os procedimentos operacionais no laboratório de biologia molecular
 Na zona pré PCR: equipar-se antes de entrar na sala com a bata e outros 
equipamentos de proteção individual; mudar de luvas entre cada procedimento; 
conservar os reagentes para mistura reacional exclusivamente nesta sala, por 
colaborador; preparar as alíquotas dos reagentes de trabalho no volume adequado 
para um determinado ensaio de PCR evitando em absoluto a reutilização em 
ensaios posteriores; utilizar água ultrapura estéril ou água comercial livre de 
desoxirribonucleases em alíquotas de volume adequado; não introduzir nenhum 
equipamento da área pós PCR; nos laboratórios que não possuam uma separação 
física entre atividades, utilizar sempre a câmara de fluxo laminar com lâmpadas de 
luz UV; transportar as misturas reacionais em tubos hermeticamente fechados; 
manter fechado o tubo de controle branco durante a fase de adição das amostras 
as misturas reacionais; não manusear nem conservar produtos de PCR nesta área;
não utilizar os produtos e utensílios desta área para outros fins; as amostras com 
grandes concentrações de agentes biológicos ou de ác nucleicos molde devem ser 
diluídas antes de entrarem na sala de preparação.
 Zona pós PCR: equipar-se antes de entrar na sala com a bata e outros 
equipamentos de proteção individual; mudar de luvas entre cada procedimento; 
utilizar utensílios e equipamentos desta área; manipular os tubos com os produtos 
de PCR com cautela para não alterar os resultados; descartar os produtos de PCR 
fechados nos respectivos tubos de reação nos contentores apropriados.
Qual a diferença entre PCR e PCR em tempo real
 Reação em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR) é 
um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido 
desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo 
 A PCR em tempo real associa a metodologia de PCR a um sistema de detecção e 
quantificação de fluorescência produzida durante os ciclos de amplificação. A 
metodologia permite a detecção, quantificação e amplificação de DNA em uma 
única etapa, agilizando a obtenção de resultados e minimizando o risco decorrente 
de possíveis contaminações. Para realização do PCR em tempo real, utilizamos 
um termociclador a um detector de fluorescência capaz de medir a luz fluorescente 
de uma reação de amplificação. A metodologia utiliza os mesmos reagentes de 
uma PCR convencional acrescido de fluorocromos intercalados em cadeias de 
DNA ou pesentes em sondas de hibridização específicas. O PCR em tempo real, 
apresenta maior reprodutibilidade, sensibilidade e precisão comparado ao PCR 
convencional, além de reproduzir resultados quantitativos, enquanto o PCR 
convencional reproduz resultados qualitativos.