CARDIOPROTEÇÃO PROMOVIDA PELO MIRTENOL NA LESÃO DE ISQUEMIA-REPERFUSÃO É MEDIADA POR AÇÕES ANTIOXIDANTES E ANTIAPOPTÓTICAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE 
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA 
DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE 
 
 
 
 
RAQUEL MOREIRA DE BRITTO 
 
 
 
 
CARDIOPROTEÇÃO PROMOVIDA PELO MIRTENOL NA LESÃO DE 
ISQUEMIA-REPERFUSÃO É MEDIADA POR AÇÕES ANTIOXIDANTES E 
ANTIAPOPTÓTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ARACAJU 
2018 
 
 
 
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RAQUEL MOREIRA DE BRITTO 
 
 
 
 
 
 
 
 
CARDIOPROTEÇÃO PROMOVIDA PELO MIRTENOL NA LESÃO DE 
ISQUEMIA-REPERFUSÃO É MEDIADA POR AÇÕES ANTIOXIDANTES E 
ANTIAPOPTÓTICAS 
 
 
 
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde da 
Universidade Federal de Sergipe como 
requisito parcial à obtenção do grau de Doutor 
em Ciências da Saúde 
 
Orientadora: Profa. Dra. Sandra Lauton 
Santos 
 
 
 
 
 
ARACAJU 
2018 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA BISAU 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE 
 
 
 
B862c 
 
Britto, Raquel Moreira de 
 Cardioproteção promovida pelo mirtenol na lesão de 
isquemia-reperfusão é mediada por ações antioxidantes e 
antiapoptóticas / Raquel Moreira de Britto ; Orientadora Sandra 
Lauton Santos. – Aracaju, 2018. 
104 f. : il. 
 
Tese (doutorado em Ciências da Saúde) – Universidade 
Federal de Sergipe, 2018. 
 
 1. Monoterpenos. 2. Plantas medicinais. 3. Isquemia 
Miocárdica. 4. Estresse Oxidativo. 5. Apoptose. I. Santos, 
Sandra Lauton, orient. II. Título. 
 
CDU 61 
 
 
RAQUEL MOREIRA DE BRITTO 
 
 
 
CARDIOPROTEÇÃO PROMOVIDA PELO MIRTENOL NA LESÃO DE 
ISQUEMIA-REPERFUSÃO É MEDIADA POR AÇÕES ANTIOXIDANTES E 
ANTIAPOPTÓTICAS 
 
 
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde da 
Universidade Federal de Sergipe como 
requisito parcial à obtenção do grau de Doutor 
em Ciências da Saúde 
 
Aprovada em ____/____/___ 
 
 
______________________________________________________________________ 
Profa. Dra. Sandra Lauton Santos 
Orientadora 
 
______________________________________________________________________ 
Profa. Dra. Carolina Rosa Gioda 
 
______________________________________________________________________ 
Prof. Dr. Luciano dos Santos Aggum Capettini 
______________________________________________________________________ 
Prof. Dr. Ricardo Luiz Cavalcanti de Albuquerque Junior 
______________________________________________________________________ 
Prof. Dr.Vitor Ulisses de Melo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À minha mãe Marta Cavalcante, minha tia 
Marylou Brito por todo amor, dedicação e 
orações. 
 Às minhas irmãs Ana Paula, Jéssica e 
Renata Santana pelo companheirismo e 
orações. 
Ao presente que DEUS nos deu Matheus, 
meu sobrinho tão desejado e querido. 
 
A G R A D E C I M E N T O S 
 
A DEUS, pelo milagre visto e sentido nesse doutorado, por todo amor, cuidado, 
misericórdia e direcionamento para comigo; 
À MINHA FAMÍLIA, por estar sempre presente em minha vida, pelo amor, pelas 
orações, e companheirismo eterno; 
A THÁSSIO RICARDO RIBEIRO MESQUITA, por todo empenho e dedicação 
ímpar em me ajudar sanando minhas dúvidas, alicerçando meu conhecimento acerca do 
tema, guiando-me no amadurecimento científico, culminando na publicação do tão 
almejado artigo; 
À Prof
a
. Dra. CARLA LINS DE VASCONSELOS, responsável por meu ingresso na 
área da pesquisa desde o mestrado, no doutorado abriu as portas de seu laboratório 
ajudando e colaborando em tudo o que foi possível, disponibilizando seu tempo, 
conhecimento e alunos para o desenvolvimento e finalização desse projeto; 
À JULIO ALVES DA SILVA-NETO, sempre disposto a realizar comigo os 
experimentos a qualquer hora do dia, por várias horas, abnegando muitas vezes de seu 
tempo de descanso e lazer para estar durante a semana, finais de semana e até mesmo 
feriado na bancada, além de discutir resultados e auxiliar nas análises dos dados; 
À Prof
a
. Dra. SANDRA LAUTON, pelo apoio e confiança desde o inicio, sendo 
receptiva para minha orientação, a qual foi de grande valia para o enriquecendo da 
minha formação; 
AO LABCEO, todos os alunos Jucy, Peligres, Rodrigo, Lucas, Grace, pela grande 
ajuda nos experimentos concernentes ao estresse oxidativo. Mardem, Miriam, Maraisa, 
Iolanda e Jeferson pela ajuda sempre que possível; 
AO LBC, em especial a Diego pela ajuda nas análises e discussões eletrocardiográficas, 
Evaldo, Carol, Andreza, Michael pelo companheirismo; 
AO LMPE, na pessoa do Prof. Dr. Ricardo Luiz Cavalcanti Albuquerque-Júnior, pela 
disponibilidade em ajudar sempre que solicitado em relação ao estado da arte de sua 
linha de pesquisa, além de Rose Nely Pereira-Filho e Fanildes Silva Moraes dos Santos 
duas excelentes profissionais, tendo, como consequência dessa parceria, lindos 
resultados; 
Ao Laboratório de Sinalização Intracelular em Cardiomiócito, principalmente a Prof
a
. 
Dra. SILVA GUATIMOSIN por ceder seu aluno COUTO GUEDES para realização 
de experimentos moleculares. 
A Couto Guedes agradeço pela grande amizade e profissionalismo incrível; 
À UFS pelos programas de Pós-Graduação e Pesquisa em Ciências da Saúde e Ciências 
Fisiológicas, pela estrutura conseguida disponibilizada e pelos animais utilizados; 
À UNIT pela concessão de parte dos animais para realizar este trabalho; 
AOS ANIMAIS, pela perda da vida em prol do desenvolvimento científico e para a 
elaboração deste trabalho; 
À UFS, FAPITEC, CNPq e CAPES pelos financiamentos das pesquisas e que de 
forma direta e indireta foram cruciais para o desenvolvimento deste trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Entrega teu caminho ao Senhor 
confia nele e o mais ele fará. 
(Salmos 37:5) 
 
RESUMO 
 
Cardioproteção promovida pelo mirtenol na lesão de isquemia-reperfusão é 
mediada por ações antioxidantes e antiapoptóticas. Raquel Moreira de Britto, 
2018. A lesão de isquemia-reperfusão cardíaca representa um grande dano à saúde 
humana contribuindo para efeitos cardiovasculares adversos. Embora a reperfusão do 
coração isquêmico seja essencial para reduzir o dano miocárdico em processo de 
isquemia, a restauração do fluxo sanguíneo pode, paradoxalmente, amplificar o dano 
celular. Não existem metodologias de intervenção clínica que tratem a origem dos 
eventos celulares que levam ao dano celular observado. Neste contexto, o mirtenol é um 
monoterpeno com múltiplas atividades farmacológicas e estudos sugerem que esta 
molécula possa atuar em eventos que culminam na prevenção da lesão tissular. Assim, o 
objetivo deste estudo foi avaliar se o mirtenol promove a cardioproteção contra a lesão 
de isquemia-reperfusão cardíaca (IR) e os mecanismos envolvidos nesses efeitos. Para 
este estudo, ratos Wistar machos foram pré-tratados por via oral durante sete dias 
consecutivos com solução salina (NaCl 0,9% 0,20 ml + DMSO 0,05 mL), mirtenol (50 
mg / kg) ou N-acetil cisteína (NAC) (1.200 mg / kg). Posteriormente, os corações foram 
submetidos à lesão de IR cardíaca, por meio do sistema de perfusão aórtica de fluxo 
constate do tipo Langedorff. Foram obtidos os parâmetros contráteis tais como pressão 
ventricular esquerda (PVE), derivadas máxima (+dP/dt) e mínima (-dP/dt) da PVE, 
frequência cardíaca (FC), parâmetros eletrocardiográficos, como FC, intervalo PR e a 
duração do complexo QRS. Além disso, foi mensurado a atividade da lactato 
desidrogenase (LDH) determinado o índice de severidade das arritmiascardíacas (ISA) 
e a área de infarto. O estresse oxidativo foi avaliado com base na determinação de 
hidroperóxidos totais, grupamento sulfidrilas totais, ainda foram mensuradas as espécies 
reativas de oxigênio (EROs), as proteínas carboniladas e determinada a atividade das 
enzimas antioxidantes endógenas: superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), 
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), e a área de infarto. A apoptose 
celular foi investigada mediante a expressão das proteínas Bax e Bcl-2 e a apoptose in 
situ foi avaliada pelo método TUNEL. Mostramos que o comprometimento severo do 
desempenho contrátil induzido pela IR foi prevenido de forma significativa pelo 
mirtenol e NAC. Além disso, que o mirtenol preveniu a forma de onda 
eletrocardiográfica discrepante (elevação do segmento ST), bem como, reduziu as 
arritmias fatais e o tamanho da área do infarto induzido pela lesão de IR. 
Relevantemente, o mirtenol impediu o aumento de superóxido e danos cardíacos que 
poderiam ser causados pelo estresse oxidativo. Consequentemente, o mirtenol restaurou 
a atividade das enzimas antioxidantes endógenas e o equilíbrio das vias pró e 
antiapoptóticas (Bax e Blc-2), associado à diminuição das células apoptóticas TUNEL-
positivas. Em conjunto, nossos dados mostram que o mirtenol promove a 
cardioproteção contra lesão de IR através da atenuação do estresse oxidativo e inibição 
da via pró-apoptótica. 
 
Descritores: Monoterpenos. Plantas medicinais. Isquemia Miocárdica. Estresse 
Oxidativo. Apoptose. 
 
 
ABSTRACT 
Cardioprotection promoted by mirtenol in ischemia-reperfusion injury is mediated 
by antioxidant and antipopotic actions. Raquel Moreira de Britto, 2018. 
Cardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide, and myocardial 
infarction (MI) is one of the most devastating. Cardiac ischemia-reperfusion injury 
represents a major threat to human health, contributing to adverse cardiovascular 
effects.However, although reperfusion of the ischemic heart is essential to reduce 
myocardial damage, restoration of blood flow may, paradoxically, amplify cellular 
damage.The recognition that pathological events occurring both in ischemia and 
reperfusion contribute to tissue injury leads to accelerated efforts to identify 
mechanisms of IR injury in the hope of identifying new treatments that may limit injury 
induced by blood reduction flow and / or damage produced by reperfusion.Myrtenol is a 
monoterpene with multiple pharmacological activities. However, although 
monoterpenes have been proposed to play beneficial roles in a variety of cardiac 
disorders, pharmacological actions of myrtenol in the heart are not yet reported. Hence, 
the aim of this study was to evaluate whether myrtenol promotes cardioprotection 
against myocardial ischemia-reperfusion (IR) injury, and the mechanisms involved in 
these effects. Male Wistar rats were orally treated for seven consecutive days with 
solution (NaCl 0.9% 0.20 ml + DMSO 0.05 ml), myrtenol (50 mg/kg) or N-acetyl 
cysteine (1.200 mg/kg, NAC).Subsequently, the hearts were submitted to cardiac IR 
injury, through the aortic perfusion flow system of the langedorff type, contractile 
parameters such as left ventricular pressure (PVE), maximum rise/down velocity of left 
intraventricular pressure (dP/dt), heart rate (HR), electrocardiographic parameters, HR, 
PR interval and duration of the QRS complex, measured the activity of Lactate 
Dehydrogenase (LDH), determined the severity of cardiac arrhythmias (ASI). The 
oxidative stress was evaluated on the basis of the determination of total hydroperoxides, 
total sulfhydryl (SH) groups, measurements of the reactive oxygen species (ROS) 
generation, the carbonylated proteins, the activity of the endogenous antioxidant 
enzymes: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) , glutathione peroxidase (GPx) 
and glutathione reductase (GR), and the infarct area. The apoptosis pathway was 
investigated by the expression of Bax and Bcl-2 proteins and in situ apoptosis was 
studied from the TUNEL assay. Here, we show that the severe impairment of contractile 
performance induced by IR was significantly prevented by myrtenol or NAC. 
Moreover, Myrtenol abolished aberrant electrocardiographic waveform (ST-segment 
elevation), as well as reduced life-threatening arrhythmias and infarct size induced by 
IR injury. Importantly, myrtenol fully prevented the massive increase of cardiac reactive 
oxygen species generation and oxidative stress damage. Accordingly, myrtenol restored 
the impairment of endogenous antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase, 
glutathione peroxidase and reductase) activities and balance of pro- and anti-apoptotic 
pathways (Bax and Blc-2), associated with decreased TUNEL-positive apoptotic cells. 
Taken together, our data show that myrtenol promotes cardioprotection against IR 
injury through attenuation of oxidative stress and inhibition of pro-apoptotic pathway 
 
Keywords: Monoterpenes. Plants, Medicinal. Myocardial injury. Oxidative stress. 
Apoptosis. 
 
 
LISTA DE QUADROS 
 
Quadro 1. Reações de Fenton e Haber Weiss................................................................36 
Quadro 2. Solução de Krebs-Henseleit.........................................................................52 
Quadro 3.Determinação do Índice de Severidade de Arritmia (ISA)............................54 
Quadro 4. Constituintes dos Tampões Utilizados na Preparação dos Tecidos Cardíacos 
para os Ensaios Bioquímicos...........................................................................................55 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
Figura 1. Mecanismos celulares da contração muscular................................................24 
Figura 2. Eletrocardiograma normal, mostrando as ondas de despolarização (P, QRS) e 
repolarização (T), e os principais intervalos (PR, QT e RR) e segmentos 
(ST)..................................................................................................................................25 
 
Figura 3. Registro típico da pressão ventricular esquerda obtido por meio de um 
balonete de látex (inflado a 150 mmHg) e acoplado a um transdutor de 
pressão.............................................................................................................................25 
 
Figura 4. Principais componentes envolvidos na lesão de isquemia-reperfusão 
cardíaca............................................................................................................................31 
Figura 5. Esquema do sistema de defesa antioxidante...................................................37 
Figura 6. Via intrínseca de ativação da apoptose...........................................................42 
Figura 7. Myrtus communis L.........................................................................................45 
 
Figura 8. Estrutura química do (-) mirtenol....................................................................45 
Figura 9. Representação esquemática do sistema de perfusão aórtica de fluxo constante 
do tipo Langendorff.........................................................................................................52 
 
Figura 10. Representação esquemática do protocolo experimental...............................53 
Figura 11. Medida de malonaldeido (MDA)..................................................................64 
Figura 12. Tratamento com mirtenol previne o comprometimento da contratilidade 
miocárdica induzida por lesão por IR.............................................................................67 
Figura 13. Mirtenol impede a elevação do segmento-ST e atenua a gravidade das 
arritmias cardíacas induzidas por lesão de IR.................................................................70 
Figura 14. Tratamento com mirtenol inibe o dano de estresseoxidativo por diminuir a 
formação de EROs e biomarcadores de dano celular na lesão cardíaca induzida por 
IR.....................................................................................................................................72 
Figura 15. Mirtenol inibe o dano do estresse oxidativo por restaurar a atividade de 
enzimas antioxidantes endógenas na lesão cardíaca induzida por 
IR.....................................................................................................................................73 
Figura 16. Mirtenol promove a cardioproteção prevenindo o infarto do miocárdio 
induzido na lesão de IR...................................................................................................74 
Figura 17. Tratamento com mirtenol suprime a apoptose do miocárdio induzida na 
lesão IR............................................................................................................................76 
 
 
SIGLAS E ABREVIAÇÕES 
Akt - Proteína Quinase B 
ANP- Peptídeo Natriurético Atrial 
ATP - Adenosina Trifosfato 
Bcl-2 -B Célula CLL/Linfoma 2 
Bcl-xL- B-Célula Linfoma Extra Grande 
Bax -Bcl-2-associado à proteína X 
Bak - Bcl-2 relativo bak 
BVP - Batimentos Ventriculares Prematuros 
Cyt c - Citocromo c 
CAS - Serviço Químico de Resumo 
CAT- Catalase 
DATASUS - Departamento de Informação do SUS 
DHE- Dihidroetídio 
DMSO - Dimetilsulfóxido 
 DNPH - 2,4-Dinitrofenilhidrazina 
+dP/dt - Derivada Temporal de Pressão Ventricular Máxima 
-dP/dt - Derivada Temporal de Pressão Ventricular Mínima 
ECG - Eletrocardiograma 
ERNs - Espécies Reativas de Nitrogênio 
EROs - Espécies Reativas de Oxigênio 
FC- Frequência Cardíaca 
Fe
3+ 
- Ferro oxidado 
Fe
2+
 - Ferro reduzido 
FV- Fibrilação Ventricular 
GAPDH-Gliceraldeído 3-Fosfato Dehidrogenase 
GIK- Glicose Insulina e Potássio 
GLP-1 -Péptido-1 do tipo Glucagon 
GSH-Px - Glutationa Peroxidase 
GSH-Rd - Glutationa Redutase 
 GSH - Glutationa Reduzida 
GMPc - Monofosfato Cíclico de Guanosina 
GMPc/PKG-GMPc-Dependente da Proteína Quinase G 
H2O - Água 
IM - Infarto do Miocárdio 
IAM - Infarto Agudo do Miocárdio 
IAMEST-Infarto Agudo do Miocárdio com Elevação do Segmento ST 
ICPP - Intervenção Coronária Percutânea Primária 
IR - Isquemia-Reperfusão 
I.P- Intraperitonial 
LDH- Lactato Desidrogenase 
NAC- N-acetilcisteína 
NADH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzida 
NADPH Oxidase - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase 
NCX - Trocador Na
+
/Ca
2+ 
O2 - Oxigênio 
OMV - Obstrução Microvascular 
OH
−
- Radical Hidroxila 
•OH- Ânion hidroxila 
O2
•-
 - Ânion Superóxido 
NO - Óxido Nítrico 
NOS - Óxido Nítrico Sintase 
ONOO
-
 - Peroxinitrito 
H2O2 - Peróxido de Hidrogênio 
PDE - Inibidores Da Fosfodiesterase 
PDE5 - Inibidores Da Fosfodiesterase 5 
PTPm - Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial 
PVE- Pressão Ventricular Esquerda 
PAGE- Gel dePoliacrilamida para Electroforese 
PKG - Proteína Quinase G 
RyR - Receptores de Rianodina 
RS - Retículo Sarcoplásmico 
SDS - Dodecilsulfato de sódio 
SERCA - Ca
2+
 ATPase do Retículo Sarcoplasmático 
SOD- Superóxido Dismutase 
TRO40303 - (3,5-seco-4-nor-colestan-5-on oxima-3-ol) 
TV- Taquicardia Ventricular 
TTC - Cloreto de Trifeniltetrazólio 
TUNEL-Deoxinucleotidil Terminal Transferase 
VE - Ventrículo Esquerdo 
V.O - Via Oral 
XO - Xantina Oxidase 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 17 
2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 20 
2.1 Infarto agudo do miocárdio ....................................................................................... 20 
2.1.1 Acoplamento excitação-contração ............................................................................. 21 
2.1.2 Eletrocardiograma ...................................................................................................... 24 
2.1.3 Função do ventriculo esquerdo .................................................................................. 25 
2.1.4 Arritmias .................................................................................................................... 26 
2.2 Fisiopatologia da lesão de isquemia-reperfusão cardíaca .......................................... 30 
2.3 Mediadores da lesão de reperfusão cardíaca .............................................................. 34 
2.4 Lesão tardia da reperfusão: estendendo a janela de cardioproteção .......................... 39 
2.5 Apoptose .................................................................................................................... 40 
2.6 Considerações sobre o myrtus communis l. e o monoterpeno (-) mirtenol ................ 43 
3. OBJETIVOS .................................................................................................................... 49 
3.1 Objetivo geral............................................................................................................. 49 
3.2 Objetivos específicos ................................................................................................. 49 
4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 50 
4.1 Aspectos éticos da pesquisa ....................................................................................... 50 
4.2 Animais, dose da substância utilizada no tratamento e grupos experimentais .......... 50 
4.3 Protocolo de isquemia reperfusão cardíaca............................................................... 51 
4.3.1 Modelo de isquemia/reperfusão ................................................................................. 52 
4.3.2 Determinação dos parâmetros contráteis e eletrocardiográficos ............................... 53 
4.4 Mensuração da atividade da lactato desidrogenase (LDH) ....................................... 54 
4.5 Determinação do índice de severidade das arritmias cardíacas (ISA) ....................... 54 
4.6 Ensaios de estresse oxidativo ..................................................................................... 55 
4.6.1 Preparação da amostra ............................................................................................... 55 
4.6.2 Ensaio de peroxidação lipídica .................................................................................. 55 
4.6.3 Determinação de hidroperóxidos ............................................................................... 56 
4.6.4 Medida de grupamentos sulfidrilas totais .................................................................. 57 
4.6.5 Mensuração da geração de espécies reativo ao oxigênio(EROs) ............................... 58 
4.7 Atividades das enzimas antioxidantes endógenas ....................................................... 58 
4.7.1. Determinação da concentração total de proteínas ...................................................... 58 
4.7.2 Atividade da superóxido dismutase (SOD)................................................................ 58 
4.7.3 Atividade da catalase (CAT) ...................................................................................... 58 
4.7.4 Atividade da glutationa peroxidase (GPX) ................................................................. 59 
4.7.5 Atividade da glutationa redutase (GR) ...................................................................... 59 
4.8 Determinação da área de infarto ................................................................................. 60 
4.9 Determinação da expressão de proteinas reguladoras da apoptose ............................ 60 
4.9.1 Expressão do BAX, BCL-2 ........................................................................................60 
4.9.2 Mensuração das proteínas carboniladas.................................................... .................. 61 
4.10 Avaliação do índice de apoptose (IA) in situ utilizando o método tunel . ................. 62 
4.11 Análise estatística......................................................................................................... 63 
5. RESULTADOS ................................................................................................................ 64 
5.1 Dose do mirtenol a ser utilizada no pré-tratamento dos animais.... ................................ 64 
5.2 Mirtenol previne o comprometimento da contratilidade cardíaca induzida por 
lesão de IR.......................................................................................................... .................. 65 
5.3 Mirtenol impede a elevação do segmento-ST e atenua a gravidade das arritmias 
cardíacas induzidas por lesão de IR ...................................................................................... 68 
5.4 Mirtenol inibe o dano do estresse oxidativo por diminuir a formação de EROs e os 
biomarcadores de dano celular na lesão cardíaca induzida por IR ....................................... 71 
5.5 Mirtenol inibe o dano do estresse oxidativo por restaurar a atividade de enzimas 
antioxidantes endógenas na lesão cardíaca induzida por IR ................................................. 72 
5.6 Mirtenol promove a cardioproteção prevenindo infarto do miocárdio induzido por 
lesão de IR............................................................................................................................. 74 
5.7 Mirtenol suprime a apoptose cardíaca induzida por lesão de IR ................................... 75 
6. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 72 
7. CONCLUSÃO. ................................................................................................................. 85 
8. PERSPECTIVAS. ............................................................................................................ 85 
REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 86 
ANEXO A - CEPA ............................................................................................................104 
 
 
 
17 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
A doença cardíaca é um dos maiores problemas de saúde em todo o mundo 
(DONGLING et al., 2017). O infarto agudo do miocárdio (IAM) é a principal causa de 
morbidade e mortalidade no mundo ocidental, e, de acordo com a Organização Mundial 
de Saúde, será a principal causa de morte no mundo até 2020 (LOPEZ AD E MURRAY 
CC, 1998). A lesão de isquemia-reperfusão (IR) cardíaca representa uma grande ameaça 
à saúde humana, contribuindo para efeitos cardiovasculares adversos, tais como: 
aumento do risco de infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, insuficiência 
cardíaca, insuficiência renal e hipertensão arterial (BING F. WANG E JUN 
YOSHIOKA, 2016). 
No Brasil, segundo o DATASUS (Departamento de informação do SUS), 90.811 
pessoas morreram em hospitais decorrentes do IAM em 2015, sendo a região nordeste o 
segundo estado com maior índice de notificação, 25.231 casos, ficando atrás somente da 
região sudeste, com 41.824. Em Sergipe foram 786 mortes no ano de 2015. 
Considerando que as doenças cardiovasculares constituem a principal causa de 
incapacidade, morbidade e morte no Brasil e no mundo , o Ministério da Saúde, através 
da Portaria nº 2.994/2011, aprovou a Linha de Cuidado do Infarto Agudo do Miocárdio 
e o Protocolo de Síndromes Coronarianas Agudas (BRASIL, 2011), com o intuito de 
otimizar o atendimento, avaliação da assistência e tratamento preconizado pelas 
diretrizes vigentes aos portadores de doenças cardiovasculares. 
Desse modo, a compreensão dos eventos patológicos que ocorrem durante 
períodos de isquemia, assim como, durante a reperfusão não somente representam um 
avanço no conhecimento, mas também alimenta a esperança de identificar novos 
fármacos ou terapias que possam limitar as lesões cardíacas induzidas pela IR 
(THEODORE et al., 2017). No entanto, embora a reperfusão do coração isquêmico seja 
essencial para reduzir o dano no miocárdio, a restauração do fluxo sanguíneo pode, 
paradoxalmente, amplificar o dano celular, um fenômeno conhecido como lesão de IR 
cardíaca (ELTZSCHIG E ECKLE, 2011; MOENS et al., 2005). 
Conquanto várias manobras venham sendo utilizadas na clínica para contornar 
ou prevenir a lesão de reperfusão, nenhuma delas apresenta um efeito satisfatório. A 
18 
 
utilização de antioxidantes, especialmente os antioxidantes naturais, na prevenção e cura 
de doenças tem atraído um interesse enorme pois eles podem intervir e ajudar na 
limitação das lesões de reperfusão (ZHAO E ZHAO, 2010). 
Numerosos estudos demonstraram que os produtos naturais são uma vasta fonte 
de moléculas com ações benéficas e reconhecidas contra uma grande variedade de 
distúrbios cardíacos (SANTOS et al., 2011; SHUKLA et al., 2010). Entre as moléculas 
com atividades farmacológicas promissoras, os monoterpenos, que pertencem ao grupo 
dos fitoquímicos, amplamente encontrados em óleos essenciais de várias plantas 
medicinais, demonstraram um efeito cardioprotetor notável contra a remodelação 
cardíaca induzida por pós-carga pressórica (ZHOU et al., 2013), IAM (HAN et al., 
2016) e cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina (LI et al., 2016). 
Dentre os monoterpenos podemos citar o mirtenol, um representante do grupo 
químico dos alcoóis monocíclicos, que possui numerosas propriedades farmacológicas, 
destacando-se a atividade antioxidante (GOMES et al., 2017; SEPICI- DINCEL et al., 
2007). Apesar das múltiplas ações biológicas do mirtenol, os efeitos farmacológicos no 
coração, bem como, sua potencial relevância terapêutica cardiovascular, ainda não 
foram descritos. 
A coadjuvação entre a pesquisa pré-clínica e clínica foram essenciais para todas 
as intervenções que existem até hoje. Mas, ainda é necessário avançar nesse sentido e 
assim progredir na melhora clínica desses pacientes minimizando os efeitos adversos 
advindos dos fármacos atualmente ultilizados. Existe, deste modo, também uma 
necessidade disponibilizar formas eficazes de prevenção para limitar as lesões. E as 
propriedades do mirtenol, tais como potencial antioxidante, fazem desta substância uma 
forte candidata na prevenção e ou tratamento de danos e patologias cardíacas causadas 
pelo desencademaneto do estresse oxidativo. Ao longo dos últimos anos, estudos 
mostraram que a geração excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs), sobrecarga 
de cálcio (Ca
2+
), ativação das vias pró-inflamatórias e de apoptose agravam a lesão de 
IR cardíaca(LESNEFSKY et al., 2017; MURPHY E STEENBERGEN, 2008; TURER 
E HILL, 2010; ZHAO et al., 2003). 
De fato, a produção excessiva de EROs durante os eventos de IR pode superar os 
mecanismos de eliminação delas, sendo, as enzimas antioxidantes endógenas, a primeira 
19 
 
linha de defesa. Portanto, o desequilíbrio de mecanismos pró e antioxidantes podem 
levar à ativação de várias vias de sinalização deletérias, que estão associadas a 
disfunções elétricas e contráteis do coração (O’GARA et al., 2013; TURER E HILL, 
2010). Assim, o presente trabalho propôs, estudar em um modelo de isquemia e 
reperfusão (I/R) global ex vivoo efeito cardioprotetor do mirtenol, antioxidante natural, 
contra a lesão de I/R. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
2. REVISÃO DA LITERATURA 
 
2.1 INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO 
 
O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma das mais prejudiciais doenças 
cardiovasculares (CHAOLIAN et al., 2013). De forma geral, a maioria dos fatores de 
risco são: maus hábitos alimentares, sedentarismo, obesidade e o aumento doestresse 
cotidiano que contribuem para a grande mortalidade da população. Além disso, o 
tabagismo é altamente prevalente e juntamente aos fatores de risco acima citados 
contribui para o desenvolvimento precoce de doenças cardiovasculares (PANWAR et 
al., 2011; RAMAHI, 2010). 
O IAM, uma das patologias mais antigas descritas, é definido como um processo 
patológico ocasionado por um desequilíbrio entre a demanda de oxigênio e o 
suprimento sanguíneo oferecido pelas artérias coronárias, resultando em morte de 
cardiomiócitos (THYGENSEN et al, 2007). Assim, o prognóstico desses pacientes 
depende fundamentalmente da agilidade em alcanar um serviço médico e na 
eficiência desse serviço em obter a reperfusão coronariana o mais rápido possível. 
 
O diagnóstico é feito com base no quadro clínico, nas alteraçõrs 
eletrocardiográficas e na elevação dos marcadores bioquímicos de necrose. Tendo em 
vista que os sintomas são extremamente variados tais como ansiedade e agitação em 
geral devido ao débito cardíaco decorrente do processo abrupto de interrupção de fluxo 
sanguíneo ao miocárdio, sudorese, sinais de choque, com hipotensão arterial, 
diminuição de amplitude de pulso devido a necrose maciça com grande déficit de 
contratilidade, sinais de falência ventricular esquerda, arritmias e vômitos e que a 
elevação dos marcadores inicia-se cerca de seis horas após o inicio da dor, o principal 
instrumento diagnóstico e determinante da conduta é o eletrocardiograma. Ele dever 
apresentar o supradesnível do segmento ST ou o bloqueio agudo de ramo esquerdo, 
critérios suficientes para desencadear a tentativa imediata de reperfuão em um paciente 
com história sugestiva (PESARO, A et al ., 2004) 
 
21 
 
A isquemia é uma condição caracterizada pela diminuição momentânea ou 
prolongada no fluxo sanguíneo para o tecido. A principal consequência da isquemia é o 
fornecimento insuficiente de oxigênio e nutrientes, o que, por sua vez, induz a falha 
bioenergética. A isquemia causa ainda um estresse metabólico profundo que provoca 
graves danos teciduais. Devido à natureza da alta demanda metabólica, tanto o cérebro 
quanto o coração são órgãos particularmente suscetíveis à lesão isquêmica (BING et al., 
2016; MARGHERITA et al., 2017). 
Embora a restauração do fluxo sanguíneo para o miocárdio isquêmico seja um 
pré-requisito importante para sua sobrevivência celular, está bem estabelecido que a 
reperfusão, além de seus efeitos benéficos, também causa efeitos adversos (EBEL et al, 
1999; ANAYA-PRADO et al., 2002). Algumas complicações, como a arritmia 
ventriculares, que ocorrem durante a reperfusão tecidual, conduzem para disfunção 
cardíaca (GONCA, 2015). Deste modo, sugeriu-se que não somente a isquemia, mas 
também a reperfusão, contribuem para a lesão de IR cardíaca (SHIMIZU et al., 2016). 
A lesão de IR cardíaca é considerada o principal evento adverso que contribui 
para a morbidade e mortalidade associada à oclusão das artérias coronarianas. O dano 
do miocárdio causado pela lesão constitui a principal manifestação patológica da doença 
arterial coronariana, tendo como causadoras principais as alterações metabólicas durante 
esses eventos (XIANCHI et al., 2016). Agudamente, pacientes com IAM também 
apresentam alterações nas propriedades elétricas do coração, estando intimamente 
associadas à excitabilidade do tecido cardíaco e sua função contrátil (MARGHERITA et 
al., 2017; CALLENDER et al., 2014). 
2.1.1 Acoplamento Excitação-Contração (AEC) 
A capacidade contrátil da célula cardíaca está diretamente associada à 
homeostasia do Ca
+2
 no processo que vai da excitação elétrica do cardiomiócito até a 
contração do coração, fenômeno denominado acoplamento excitação-contração (AEC) 
(Bers, 2001). O Ca
+2
 está envolvido tanto na excitabilidade dos cardiomiócitos, quanto 
na ativação final dos filamentos contratéis, causando a contração (Bers, 2002). 
A despolariazação do sarcolema durante o potencial de ação cardíaco faz com 
que haja um influxo de Ca
+2
 para o interior da célula (Fabiato and Fabiato, 1975). O 
influxo de Ca
+2
 para o interior do cardiomiócito ocorre por meio da abertura de duas 
22 
 
classes de canais dependentes de voltagem (Figura 1), os canais para Ca
+2
 do tipo-L e 
do tipo-T (Bers, 2001). Tal movimentação de Ca
+2
 gera uma corrente de entrada de Ca
+2
 
(ICa) (Mitra and Morad, 1986), que nos cardiomiócitos de ratos representa 
principalmente a ICa do tipo-L (Bers, 2002). Os canais para Ca
+2
 do tipo-L, também 
chamados de receptores de dihidropiridina (DHPR), estão expressos em sua maior parte 
nos túbulos transversos da membrana plasmática, com sua porção intracelular voltada 
para o retículo sarcoplasmático (RS) (Scriven et al., 2000). 
Na membrana do RS está a unidade liberadora de Ca
+2
, que compreende um 
grupo específico de receptores chamados de rianodina (RyR). Atualmente, foram 
identificados três tipos de genes (ryr1, ryr2 e ryr3) que expressam diferentes isoformas 
de RyR, sendo que a isoforma RyR2 localiza-se principalmente no músculo cardíaco. 
Tal arranjo funcional entre os DHPR e os RyR2, juntamente com o subespaço entre eles 
formam a unidade liberadora de cálcio (ULC), complexo estrutural e funcional do AEC 
(Cheng and Lederer, 2008; Franzini-Armstrong et al., 1999). O influxo de Ca
+2
 através 
do DHPR para o subespaço promove a liberação de Ca
+2
 pelo RS, processo conhecido 
como liberação de Ca
+2
 induzida por Ca
+2
, do inglês calcium-induced calcium release – 
CICR (Fabiato, 1985). 
A ativação dos RyR2 provoca aumentos transitórios na concentração 
citoplasmática do Ca
+2
. Estes eventos elementares, representados por aumentos 
transitórios de Ca
+2
, podem variar desde eventos mais discretos, como, por exemplo, as 
sparks de Ca
+2
, que ocorre em apenas uma ULC (Cheng and Lederer, 2008), como em 
toda a unidade celular, transiente intracelular global de Ca
+2
 (Bers, 2001). Neste último, 
a ativação dos RyR2 pelo Ca
+2
 é suficiente para aumentar as concentrações deste íon, 
fazendo-o variar de 100 nM a 1 μM na fase sistólica. O cálcio livre liga-se a troponina-
C que é parte do complexo de regulação ligado aos filamentos finos. Quando o cálcio se 
liga a troponina-C, este induz uma alteração conformacional no complexo de regulação 
de tal forma que a troponina I expõe um local na molécula de actina, que é capaz de se 
ligar a miosina ATPase localizada na cabeça da miosina. Esta ligação provoca a 
hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) que está ligado à cabeça leve da miosina, em 
difosfato de adenosina (ADP), esta hidrólise fornece energia para que ocorra mudança 
conformacional no complexo actina-miosina. Estas mudanças promovem um 
movimento tipo "catraca" entre as cabeças de miosina e actina, de tal forma que os 
23 
 
filamentos de actina e miosina deslizam umas sobre as outras encurtando assim o 
comprimento do sarcômero (de Tombe, 2003). 
Por outro lado, para que o músculo cardíaco relaxe é necessário a dissociação do 
Ca
+2
 dos sítios de ligação com a troponina C e sua remoção do citoplasma (Khan et al., 
2004). A remoção do Ca
+2
 citosólico ocorre por meio de quatro processos: pela ATPase 
de cálcio do RS (sarco(endo)plasmic reticulum Ca
2+
 -ATPase - SERCA2a), ativação da 
Ca
+2
-ATPase do sarcolema (plasma-membrane Ca
2+
-ATPases -PMCAs), do trocador 
Na
+
/Ca
+2
 (Na
+
/Ca
+2
 exchangers - NCXs) e recaptação do Ca
+2
 para mitocôndria. A 
atividade da SERCA2a é o principal destes mecanismos (Tada and Katz, 1982), 
correspondendo por aproximadamente 92% da recaptação do Ca
+2
 em cardiomiócitos de 
ratos (Bassani et al., 1994). 
A atividade da SERCA2a é regulada pela fosfolambam (PLB), o qual, em estado 
desfosforilado, inibe a SERCA2a. Assim, a fosforilação do PLB acelera a captação de 
Ca
+2
 pelo RS. A concentração de Ca
+2
 intracelular é impotante para determinar a 
afinidadeda atividade da SERCA2a. Em concentrações de Ca
+2
 de 100 nM a 1 μM, 
ocorre diminuição da atividade da SERCA2a. No entanto, a atividade pode ser 
aumentada pela fosforilação da PLB por qualquer PKA (como ocorre por estimulação 
β2-adrenérgica), PKC (estimulação α1- adrenérgica) ou proteína quinase dependente de 
Ca
+2
/calmodulina (CaMK II) (Bassani et al., 1995; MacLennan and Kranias, 2003). 
Assim sendo, a diminuição da concentração citosólica do cálcio para valores 
inferiores a 100 nM, promove a dissociação do cálcio que está ligado a troponina C. Os 
locais ativos da actina com a miosina se inativam, ADP é substituído por outra molécula 
de ATP na cabeça da miosina, até que um novo evento aconteça (Grimm et al., 2015). 
 
24 
 
 
Figura 1. Esquema geral da sinalização intracelular de cálcio no miócito cardíaco. Observa-se o 
fenômeno da liberação de Ca
2+
 induzido por Ca
2+
 (CICR) envolve canais de cálcio tipo L sarcolemais e 
receptores de rianodina (RyR) da membrana do RS. Na figura inserida, estão curvas relativas a escala 
temporal do potencial de ação cardiaco (PA), o aumento da concentração intracelular de cálcio [Ca
2+
]i e a 
contração muscular cardiaca; NCX: trocador sódio/cálcio; PLB: fosfolambam ( adaptado de Bers 2002). 
 
2.1.2 Eletrocardiograma 
O eletrocardiograma é o registro gráfico da atividade elétrica cardíaca, resultante 
do tráfego da corrente elétrica ao longo do coração, provendo informações sobre a 
frequência, o ritmo e a morfologia cardíaca, tendo-se um tipo padrão de traçado (DALE 
DUBIN, 2004; DING et al., 2015; NASARIO-JUNIOR et al., 2013). Nele, uma onda P 
representa a despolarização atrial, um complexo QRS representa a despolarização 
ventricular e uma onda T que representa a repolarização ventricular conforme a 
frequência cardíaca (Figura 2) (WANG et al., 2008). 
A perfusão aórtica retrógrada, do tipo Langendorff, em coração isolado, 
representa um bom modelo para uma grande diversidade de descobertas acerca da 
fisiologia, patologia e farmacologia cardíaca, uma vez que grandes foram as 
contribuições obtidas com este modelo nos últimos cem anos, sendo considerado como 
contração 
PA 
Túbulo T 
miofilamento
s 
sarcolema 
25 
 
um dos modelos mais populares em pesquisas com enfoque cardiovascular e 
farmacológico (SKRZYPIEC-SPRING et al. 2007). 
 
Figura 2. Eletrocardiograma normal, mostrando as ondas de despolarização (P, QRS) e repolarização (T), 
e os principais intervalos (PR, QT e RR) e segmentos (ST) (HALL, 2010). 
 
 
2.1.3 Função do ventrículo esquerdo 
 
A câmara ventricular esquerda recebe o sangue das veias pulmonares e ejeta 
para a aorta por meio de uma contração. Este processo garante o aporte de sangue para o 
corpo inteiro; sendo assim, alguns parâmetros frequentemente são empregados para 
medir a eficiência e a eficácia deste processo (CAMPOS-FILHO, 1976; GUYTON E 
HALL, 1997). As extremidades do registro da contração ventricular demonstram uma 
pressão sistólica com o valor máximo da contração e uma pressão diastólica final 
(Figura 3), que é o momento em que o ventrículo esquerdo relaxa e se enche de sangue 
para a próxima sístole (KATZ, 1977). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 – Registro típico da pressão ventricular esquerda obtido por meio de um balonete de látex 
(inflado a 150 mmHg) e acoplado a um transdutor de pressão 
26 
 
A sístole pode ser dividida em pelo menos 2 momentos: um inicial em que não 
ocorre alteração no volume da câmara ventricular (contração isovolumétrica) seguida de 
uma fase de ejeção onde o sangue atravessa a válvula aórtica para ser distribuído por 
todo o corpo. A diástole também apresenta um comportamento isotônico e 
isovolumétrica. O comprometimento desta capacidade contrátil do coração corresponde 
um sinal de doenças como a insuficiência cardíaca (ALBAGHDADI, GHEORGHIADE 
E PITT, 2011; BARBATO et al., 2004; FUKUTA E LITTLE, 2007).A dinâmica dos 
íons cálcio no citosol do cardiomiócito, a capacidade de encurtamento das células 
ventriculares, a formação das pontes cruzadas pelos microfilamentos contráteis e a 
responsividade das válvulas cardíacas participam da regulação da contração e do 
relaxamento ventricular (HINKEN E SOLARO, 2007). 
 
Dentre os parâmetros originários desse registro (Figura 3) temos: 
 
(A) Pressão ventricular esquerda: tensão máxima que o ventrículo desenvolve 
frente uma pós-carga, capaz de abrir a válvula cardíaca e ejetar o sangue via 
aorta, 
 
(B) Pressão diastólica final: é um nível basal de tensão que permite inferência 
sobre a capacidade do ventrículo se encher de sangue, 
 
(C) Derivadas temporais da curva de contração (+dp/dt) e de relaxamento 
(-dP/dt): taxa de contração e relaxamento ventricular pelo tempo, que permite 
inferências sobre a velocidade do trabalho cardíaco e do consumo energético. 
 
(D) Frequência cardíaca: é a velocidade do ciclo cardíaco medida pelo número 
de contrações do coração por minuto (bpm). 
 
2.1.4 Arritmias 
 
São eventos definidos como uma desregulação do padrão de batimentos do 
coração devido à alteração na frequência, formação e condução normal de impulsos 
elétricos que podem acontecer de forma irregular (PASTORE et al., 2016). 
 
As estratégias terapêuticas para o tratamento de arritmias cardíacas incluem 
abordagens farmacológicas, ablação de focos específicos envolvidos na arritmogênese, 
cirurgias antiarrítmicas e dispositivos implantáveis projetados para responder a eventos 
27 
 
de taquiarritmias e bradiarritmias sintomáticas (BLATTER et al., 2003). Abaixo segue 
os tipos de arritmias: 
 
 Bradiarritmias 
 
São alterações da frequência e/ou ritmo cardíaco que cursam com resposta 
ventricular baixa. A bradicardia pode ser absoluta, definida como frequência cardíaca 
menor que 50 a 60 bpm, ou relativa, como uma frequência de 65 a 70 bpm em situações 
de maior demanda, como insuficiência cardíaca descompensada ou choque séptico 
(MCGRAW-HIL et al 2012) 
 
 Bradicardia Sinusal 
 
Bradicardia de origem no nó sinusal, onde a onda P tem orientação habitual 
(+30º a +90º) e ocorre antes de cada complexo QRS. Trata-se de situação definida 
quando a frequência cardíaca for inferior a 50 bpm. O intervalo PR encontra-se 
proporcionalmente aumentado, quando comparado ao intervalo PR em uma frequência 
cardíaca maior (GOLDMAN, LEE; SCHAFER, ANDREW, 2012) 
 
 Arritmia Sinusal 
 
Arritmia em que a onda P tem orientação normal e mantida, porém, o ritmo 
cardíaco é irregular. Embora ocorra certa variabilidade fisiológica do intervalo R-R, 
considera-se arritmia sinusal quando a variabilidade é maior que 20% (ou quando o 
maior ciclo é mais de 120 ms mais longo que o menor ciclo). Esta arritmia é mais bem 
evidenciada quando o ritmo é bradicárdico (MCGRAW-HIL et al., 2012) 
 
 Parada Sinusal 
 
Caracteriza-se por longos períodos sem onda P no ECG. Estes períodos não são 
múltiplos do intervalo R-R normal. Quando longas, tais paradas sinusais são 
interrompidas por batimentos de escape (GOLDMAN, LEE; SCHAFER, ANDREW 
2012) 
 
 Bloqueios Atrioventriculares (BAV) 
28 
 
São distúrbios da condução elétrica dos átrios para os ventrículos, causados por 
alterações do nó AV (átrio ventricular); Podem se caracterizar por atrasos da condução, 
falhas contínuas ou intermitentes, ou mesmo ausência total de condução AV. Além 
disso, podem ser temporários ou permanentes (MCGRAW-HIL et al., 2012). 
 
 Taquiarritmias 
 
Ponto fundamental no diagnóstico diferencial das arritmias é baseado na duração 
do QRS: taquicardias com QRS estreito (duração inferior a 120 ms) são frequentemente 
de origem supraventricular, já as taquicardias de QRS largo (>120 ms) são, muitas 
vezes, ventriculares (MCGRAW-HIL et al., 2012). 
 
 Taquicardias Supraventriculares 
 
 
São assim denominadas aquelas cuja manutenção se faz em porções do coração 
localizadas acima do feixe de His (átrios, na junçãoatrioventricular ou numa via 
acessória) (GOLDMAN, LEE; SCHAFER, ANDREW, 2012). 
 
 
 Taquicardia Sinusal 
 
Esta situação é definida quando a FC for superior a 100 bpm, acompanhada por 
onda P com morfologia idêntica à do ritmo sinusal (GOLDMAN, LEE; SCHAFER, 
ANDREW, 2012) 
 
 Taquicardia Atrial 
 
Frequentemente benigna, com a possível exceção das formas incessantes que 
podem levar à taquicardiomiopatia. Ao ECG: A onda P pode possuir uma morfologia 
distinta da sinusal, com frequência atrial de 100 a 250 bpm. Durante a arritmia, uma 
linha isoelétrica está usualmente presente entre as ondas P, podendo distinguir a 
taquicardia atrial do flutter atrial (MCGRAW-HIL et al., 2012). 
 
 Fibrilação Atrial 
29 
 
O risco de um acidente vascular cerebral (AVC) em um paciente com fibrilação 
atrial (FA) é de cerca de 5% ao ano, o que é 2 a 7 vezes maior que na população sem 
esta arritmia. Caracteriza-se por ausência da onda P, presença de atividade atrial rápida 
e irregular, de baixa amplitude (ondas “f” ausentes ou Ondas “f” ausentes ou < 1 mm), 
numa frequência entre 350 a 600 bpm (MCGRAW-HIL et al., 2012). 
 
 Flutter Atrial 
 
Ocorre, em geral, de maneira paroxística e transitória, e, mais raramente, como 
arritmia crônica; Ao ECG: ondas de ativação atrial (ondas F) rápidas, negativas nas 
derivações inferiores, com aspecto morfológico em “dentes de serra” mais visível nas 
derivações inferiores (D2, D3 e AVF) e em V1 e com frequência de aproximadamente 
250 a 350 m/s (GOLDMAN, LEE; SCHAFER, ANDREW, 2012). 
 
 Taquicardias ventriculares 
 
Dentre as taquicardias, sem dúvida estas são as de maior morbimortalidade pela 
alta possibilidade de degeneração para Fibrilação ventricular e Assistolia (GOLDMAN, 
LEE; SCHAFER, ANDREW, 2012). 
 
 Fibrilação ventricular 
 
Eletrocardiograficamente, caracteriza-se por ondas bizarras, caóticas, de 
amplitude e 12 frequência variáveis. Este ritmo pode ser precedido de taquicardia 
ventricular ou torsades de pointes, que degeneraram em fibrilação ventricular 
(MCGRAW-HIL et al., 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
2.2 FISIOPATOLOGIA DA LESÃO DE ISQUEMIA-REPERFUSÃO CARDÍACA 
 
Depois de estabelecida a isquemia, um dos primeiros eventos que acontecem é a 
redução da fosforilação oxidativa (via aeróbia) nas mitocôndrias dos cardiomiócitos, 
devido à redução da disponibilidade de oxigênio, levando a um decréscimo na produção 
de ATP. Para compensar isso, ocorre aumento da via glicolítica anaeróbica da célula 
cardíaca para a produção de ATP, a glicose é convertida a piruvato através da glicólise. 
Durante o metabolismo aeróbio normal, o piruvato é então oxidado pelo 
oxigénio molecular a CO2 e H2O a distribuição de oxigénio aos tecidos musculares pode 
não ser suficiente para oxidar totalmente o piruvato. Nestes casos, a glicose é convertida 
a piruvato e depois a lactato, através da via da fermentação láctica, obtendo os músculos 
ATP, sem recorrer ao oxigênio, que leva ao acúmulo de prótons e lactato, o que irá 
resultar em acidose intracelular. 
A elevada concentração intracelular de H
+
, ativa o trocador Na
+
/H
+
, da 
membrana plasmática, que retira íons H
+
 da célula que, em contrapartida, aumenta a 
concentração de Na
+
 intracelular. A atividade reduzida da Na
+
/K
+ 
ATPase, devido à 
acidificação do meio intracelular e insuficiente síntese de ATP, também contribui para o 
aumento da Na
+ 
intracelular, o que leva à ativação do trocador sarcolemal 2Na
+
/Ca
2+
 e, 
consequentemente, ao acúmulo de Ca
+2
 intracelular (BLAUSTEIN, MP; LEDERER, 
WJ et, 1999). 
Concomitantemente a esses eventos, a redução na atividade das bombas iônicas 
dependentes de ATP, tais como Ca
2+
ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA) e 
Na
+
/K
+
ATPase, na membrana plasmática, assim como o impedimento da abertura do 
poro de transição de permeabilidade mitocondrial (PTPm) favorecem a contratura 
diastólica dos cardiomiócitos (BLAUSTEIN, MP; LEDERER, WJ et, 1999) (Figura1). 
https://pt.wikipedia.org/wiki/Piruvato
https://pt.wikipedia.org/wiki/Ciclo_de_Krebs
https://pt.wikipedia.org/wiki/Ciclo_de_Krebs
https://pt.wikipedia.org/wiki/Di%C3%B3xido_de_carbono
https://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81gua
https://pt.wikipedia.org/wiki/Circula%C3%A7%C3%A3o_sangu%C3%ADnea
https://pt.wikipedia.org/wiki/Oxida%C3%A7%C3%A3o
https://pt.wikipedia.org/wiki/Fermenta%C3%A7%C3%A3o_l%C3%A1ctica
31 
 
 
Figura 4. Principais componentes envolvidos na lesão de isquemia-reperfusão cardíaca. Poro de transição 
de permeabilidade mitocondrial, (PTPm); retículo sarcoplásmico (RS); citocromo c (Cit c) e espécies 
reativas de oxigênio (EROs). Adaptado de Xianchi li, et. al. 2016. 
 
Durante a reperfusão, o reestabelecimento do aporte de oxigênio e nutrientes 
permite a reconfiguração das funções do trocador Na
+
/H
+
 e do trocador Na
+
/Ca
2+
, 
restaurando o pH fisiológico intracelular, restabelecendo também a abertura do PTPm e 
a contratilidade dos cardiomiócitos. Durante este período, a cadeia de transporte de 
elétrons é reativada, gerando grandes quantidades EROs. Há também outras fontes de 
produção de EROs, como a xantina oxidase (XO) e a NADPH oxidase. Todas essas 
EROs participam da lesão de reperfusão do miocárdio por mecanismos diretos ou 
indiretos (EGEA, J et al., 2017). 
Paralelamente ao restabelecimento do aporte de oxigênio, ocorre a restauração 
da produção ATP pela via aeróbica e a posterior ativação da SERCA, que promovem o 
sequestro do Ca
2+ 
do citosol, que foi acumulado durante o período de isquemia (PIPER; 
KASSECKERT; ABDALLAH, 2006c). Contudo, as EROs, junto com as espécies 
reativas de nitrogênio (ERNs), propiciam um ataque à cardiolipina, um fosfolipídio da 
membrana mitocondrial interna, alterando a fluidez da membrana, a permeabilidade 
iônica, a estrutura e a função dos componentes da cadeia transportadora de elétrons 
32 
 
mitocondrial, culminando na redução da eficiência da fosforilação oxidativa 
mitocondrial (PARADIES et al., 2009). 
As EROs e ERNs ocasionam ainda, a ativação dos receptores de rianodina 
(RyR), localizados no retículo sarcoplasmático (RS), o que resulta em uma grande 
liberação de Ca
2+
, contribuindo ainda mais para a sobrecarga deste íon no citosol 
(PIPER; KASSECKERT; ABDALLAH, 2006; KÖHLER; SAG; MAIER, 2014). Os 
efeitos combinados da sobrecarga de Ca
2+ 
no citosol, produção de EROs e ERNs na 
matriz mitocondrial favorecem a abertura do PTPm, levando a uma liberação de 
citocromo c (WALTERS; PORTER; BROOKES, 2014). Este, por sua vez, induz a 
ativação da cascata das caspases que promove a morte celular (MONASSIER, 2008). 
Portanto, a associação destas alterações, que ocorrem durante a lesão de IR cardíaca, é a 
principal causa dos danos celulares e contráteis, que podem levar a morte celular 
(Figura 1). 
As quatro formas reconhecidas da lesão de reperfusão, após períodos 
prolongados de isquemia, são discutidas abaixo, sendo as duas primeiras reversíveis e as 
duas últimas irreversíveis (HAUSENLOY E YELLON, 2013) 
 
 Arritmias Induzidas por Reperfusão – Geradas pela reperfusão súbita da 
isquemia aguda do miocárdio em pacientes com IAM com elevação do 
segmento ST submetidos à intervenção coronariana percutânea primária e que 
pode ser acompanhada de arritmias ventriculares, que geralmente desaparecem 
ou são facilmente tratadas (HEARSE E TOSAKI, 1987). 
 
 Myocardial Stunning -Esta forma de lesão por reperfusão é resultado dos efeitos 
prejudiciais do estresse oxidativo e da sobrecarga de Ca
2+
 intracelular no aparato 
contrátil do miocárdico (KLONER et al., 1998). 
 
 Obstrução microvascular - A obstrução microvascular foi descrita pela 
primeira vez por Krug et al. em 1966 como: "incapacidade de reperfusão numa 
região previamente isquêmica”. Os principais fatores contributivos incluem 
danos capilares com vasodilatação prejudicada, microembolização de material 
fragmentado liberadoda placa aterosclerótica e microtrombos por plaquetas 
33 
 
(ITO, 2006; LUO E WU, 2006; HEUSCH et al., 2009; KLEINBONGARD et 
al., 2011). 
 
 Lesão letal de reperfusão - A morte celular induzida pela reperfusão de 
cardiomiócitos isquêmicos é definida como lesão letal de reperfusão cardíaca 
(PIPER.; GARCIA-DORADO; OVIZE, 1998). Os principais fatores que causam 
a morte das células cardíacas incluem estresse oxidativo, sobrecarga de Ca
2+
 e 
abertura do PTPm (YELLON E HAUSENLOY, 2007). 
 
De fato, a lesão induzida por IR é multifatorial e envolve múltiplos mecanismos 
biológicos, como ativação do sistema imune, acúmulo de íons e a formação de EROs 
(TURER E HILL, 2010). As EROs são consideradas moléculas-chave na lesão de 
reperfusão (BRAUNERSREUTHER E JAQUET, 2012) devido aos seus potentes 
efeitos oxidantes, que danificam diretamente estruturas celulares através de reações 
oxidantes (TOYOKUNI,1999). O estresse oxidativo é definido como uma perturbação 
do equilíbrio entre os agentes pró-oxidante e antioxidante resultando em lesão celular 
através da oxidação de proteínas, lipídios e DNA (GARCIA-DE-LA-ASUNCION et al., 
2012). 
 
A intensidade elevada do estresse oxidativo e a reação inflamatória no tecido 
reperfundido pós-isquêmia ocorrem em diferentes magnitudes de intensidades. Por 
exemplo, a exposição de um único órgão à IR pode causar ativação inflamatória em 
órgãos não isquêmicos distantes e, subsequentemente, levar à insuficiência de múltiplos 
órgãos (PARK et al., 2011; NISHIKATA; KATO; HIRAIWA, 2014). 
 
Em síntese, durante o estresse oxidativo que ocorre no IAM, as células se tornam 
propensas a danos estruturais e metabólicos tais como a oxidação dos lipídeos de 
membrana, atenuação da atividade enzimática, carbonilação de proteínas, oxidação de 
aminoácidos e danos ao DNA e ao RNA (BARREIROS et al., 2006) que culminam no 
surgimento de lesões no tecido cardíaco. 
 
 
 
34 
 
2.3 MEDIADORES DA LESÃO DE REPERFUSÃO CARDÍACA 
 
Estudos experimentais identificaram vários fatores críticos que atuam em 
conjunto para mediar os efeitos prejudiciais da lesão de reperfusão cardíaca 
(HAUSENLOY E YELLON, 2013) (Figura 1). 
 
 Estresse oxidativo 
Nos primeiros minutos de reperfusão cardíaca ocorre um grande estresse 
oxidativo por diversas fontes (WALTERS et al, 2012). Esse evento causa lesão cardíaca 
e a morte dos cardiomiócitos (Figura 4). Com base nestas observações, a terapia 
antioxidante foi naturalmente considerada como uma fácil e apropriada opção de 
tratamento para prevenir tal lesão. No entanto, estudos experimentais e clínicos 
relataram resultados controversos quando a administração de terapia antioxidante ocorre 
somente no início da reperfusão cardíaca, sendo parcialmente justificada pela 
incapacidade de o antioxidante entrar na célula (SMITH, HARTLEY, MURPHY, 
2011). 
EROs são moléculas quimicamente reativas contendo o elemento oxigênio, e 
incluem o ânion superóxido (O2
-
), o ânion hidroxila (•OH) e o peróxido de hidrogênio 
(H2O2) (LI, et al., 2012).Sob condições fisiológicas, há uma baixa concentração de 
EROs no coração. Elas são produzidas principalmente como subproduto da fosforilação 
oxidativa mitocondrial, sendo também úteis na sinalização celular. 
 Contudo, múltiplas condições patológicas, incluindo IR, podem resultar no 
aumento da concentração de EROs (TESHIMA et al., 2014; MATSUSHIMA et al., 
2014). A acumulação de EROs pode levar diretamente ao dano oxidativo do DNA 
mitocondrial, fosfolípidos de membrana e proteínas da cadeia respiratória (LOOR et al., 
2011; MA et al., 2013; DRÖSE, BRANDT E WITTIG, 2014). 
Aumento de EROs ainda é capaz de causar a abertura do PTPm, levando ao 
aumento da permeabilidade mitocondrial, dilatação mitocondrial, colapso do potencial 
da membrana mitocondrial e liberação do citocromo c das mitocôndrias para o citosol, o 
que resulta na apoptose dos cardiomiócitos (CUI et al., 2013; LI et al., 2012). 
 
35 
 
O NO (óxido nítrico) derivado de células endoteliais vasculares e cardiomiócitos 
é considerado como um modulador fundamental na regulação da apoptose (KIM et 
al., 1999). O radical óxido nítrico (NO∙) pode ser produzido no organismo pela ação da 
enzima óxido nítrico sintase a partir de arginina, oxigênio e NADPH, gerando também 
NADP
+
 e citrulina. O nitrato (NO3
-
) pode transformar-se em nitrito (NO2
-
), que reage 
com os ácidos gástricos gerando o ácido nitroso (HNO2). O óxido nitroso (N2O3) 
também é percursor do HNO2 através de sua reação com a água. O ácido nitroso 
promove a desaminação das bases do DNA que contêm o grupo –NH2 livre, que são 
citosina, adenina e guanina, formando-se uracila, hipoxantina e xantina (BARREIROS 
et al., 2006). 
 
O NO não é suficientemente reativo para atacar o DNA diretamente, mas pode 
reagir com o radical ânion superóxido (O2∙-), produzido pelos fagócitos, gerando 
peroxinitrito, que, pode sofrer reações secundárias formando agentes capazes de nitrar 
aminoácidos aromáticos (BARREIROS et al., 2006). Assim, a formação excessiva ou 
não controlada de (O2∙-)
 
pode, além de causar o dano oxidativo, remove as ações 
cardioprotetoras do ON. 
 
As espécies reativas também podem ser geradas sem o auxílio de enzimas como, 
por exemplo, nas reações de Fenton e Haber Weiss (Quadro1). Fisiologicamente, os 
metais de transição, como o ferro, são principalmente armazenados ou complexados. 
Entretanto, sob certas condições patológicas, concentrações de ferro não complexadas 
estão aumentadas, contribuindo, assim, para reações redox e o desencademaneto do 
estresse oxidativo. O ferro reduzido (Fe
2+
) pode reagir com H2O2 para gerar (•OH) e 
(OH
−
) um processo conhecido como Reação de Fenton (Quadro1). Ao mesmo tempo, o 
ferro oxidado (Fe
3+
) pode reagir com o (O2•
-
) para formar novamente Fe
2+
 e oxigênio 
(Tabela 1B). A reação de Fenton e a redução mediada por (O2•
-
) e Fe
3+
 originam a 
reação de Haber-Weiss (Tabela 1C), onde o (OH
-
) é gerado a partir de (O2•
-
) e (H2O2) 
(RAEDSCHELDERS; ANSLEY; CHEN, 2012). Assim, no decorrer da IR as maiores 
disponibilidades de Fe
2+
 e de EROs favorecem a formação do •OH através dessas 
reações acima citadas, que podem contribuir significativamente para a lesão de 
isquemia-reperfusão cardíaca. 
 
36 
 
 
Quadro 1-Reações de Fenton e Haber Weiss 
H2O2, peroxido de hidrogênio; Fe
2+
, ferro reduzido; Fe
3+
, ferro oxidado; ⋅OH; Ânion hidroxila; OH−, 
radical hidroxila; O2
•-
, ânion superóxido. (PARRA E RODRIGUES, 2016) 
 
R E A Ç Ã O 
 
A) Fe
2+
 + H2O2 Fe
3+
 + ⋅ OH + OH− 
 
(B) O2⋅
− 
+ Fe
3+
O2 + Fe
2+
 
 
(C) O2⋅
−
 + H2O2 O2 + ⋅ OH + OH
−
 
 
 
 
 Sistemas De Defesa Antioxidante 
 
Em sistemas aeróbicos é essencial o equilíbrio entre agentes oxidantes e o 
sistema de defesa antioxidante (ROSS E MOLDEUS, 1991). Para se proteger, a célula 
possui um sistema de defesa que pode atuar em duas linhas. Uma linha atua como 
detoxificadora do agente antes que ele cause a lesão. Esta linha é constituída por 
glutationa reduzida (GSH), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa 
peroxidase (GSH-Px) e vitamina E (Figura 5). 
 
A outra linha de defesa tem a função de reparar a lesão ocorrida, sendo 
constituída pelo ácido ascórbico, pela glutationa-redutase (GSH-Rd), vitamina E entre 
outros. Com exceção da vitamina E (a- tocoferol), que é um antioxidante estrutural da 
membrana, a maior parte dos agentes antioxidantes está no meio intracelular (ROSS E 
MOLDEUS, 1991; HEBBEL, 1986). 
37 
 
 
 
Figura 5. Esquema do sistema de defesa antioxidante. Conversão do oxigênio (O2) em ânion 
superóxido (O2
•-
) pelas enzimas NADPH oxidase. O O2
•-
 é dismutado pela superóxido dismutase (SOD), 
formando peróxido de hidrogênio (H2O2), que pode ser convertido em uma molécula de água (H2O) e 
oxigênio (O2) pela catalase (CAT) e/ou glutationa peroxidase (GPx). O H2O2 pode formarradical 
hidroxila (OH
•
) após reagir com o ferro (Fe
+2
) na reação de Fenton. A glutationa redutase (GR), mantêm o 
equilíbrio entre a glutationa reduzida (GSH) e a glutationa oxidada (GSSG). O óxido nítrico (NO) é 
formado por ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS), a partir do aminoácido L-arginina que produz 
ON e L-citrulina. O O2
•-
 também pode reagir com o ON para formar peroxinitrito (OONO
-
). Adaptado de 
Griendling e Fitzgerald (2003). 
 
 
Além dos antioxidantes citados, a vitamina E confere proteção à membrana 
celular por atuar como quelante dos oxidantes produzidos durante a lipoperoxidação. É 
um importante antioxidante lipofílico, mas esta função poderá estar limitada em 
situações de sobrecarga de ferro. A vitamina C, ou ascorbato, é um antioxidante 
hidrossolúvel; pode funcionar como pró-oxidante quando em dose elevada, ou quando 
exposta a metal, levando à lipoperoxidação (ROSS E MOLDEUS, 1991). Ao lado dos 
antioxidantes vitamínicos disponíveis em medicamentos, destacam-se também os 
derivados tióis, entre eles a N-acetilcisteína (Nac) e a mercaptopropionilglicina (MGP). 
Tais derivados são antioxidantes sintéticos que contêm o grupo -SH em sua composição 
 
 Sobrecarga de Ca+2 Intracelular 
 
A sobrecarga intracelular e mitocondrial de Ca
2+
 começa durante a isquemia 
cardíaca aguda e é exacerbada no momento da reperfusão devido à ruptura da 
http://pt.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cido
http://pt.wikipedia.org/wiki/L-arginina
http://pt.wikipedia.org/wiki/L-citrulina
38 
 
membrana plasmática, dano induzido pelo estresse oxidativo ao retículo 
sarcoplasmático e reenergização mitocondrial. (MIYAMAE et al., 1996). 
A reenergização mitocondrial permite a recuperação do potencial de membrana 
mitocondrial que conduz a entrada de Ca
2+
 nas mitocôndrias através do uniporte de Ca
2+
 
mitocondrial e subsequentemente induz a abertura do PTPm. Estudos experimentais 
demonstraram que os antagonistas farmacológicos do canais de Ca
2+
 da sarcolema 
(HERZOG et al., 1997) ou o uniporte de Ca
2+
 mitocondrial (MIYAMAE et al., 1996), 
administrado no início da reperfusão cardíaca, reduz o tamanho do IM em até 50%. 
 
. 
 A Rápida Recuperação do pH Fisiológico no Momento Da Reperfusão 
 
Durante a isquemia cardíaca aguda, o pH intracelular diminui a menos de 7,0, 
enquanto que na reperfusão, o pH fisiológico é rapidamente restaurado pela retirada do 
lactato e a ativação do trocador de Na
+
/H 
+ 
bem como o co-transportador de Na
+
/HCO
-
(LEMASTERS et al., 1996). Esta mudança de pH contribui para a morte de 
cardiomiócitos na lesão de reperfusão cardíaca (LEMASTERS et al., 1996), permitindo 
a abertura do PTPm e a hipercontratura dos cardiomiócitos nos primeiros 5 minutos de 
reperfusão. Portanto, uma estratégia de tratamento potencial para prevenir a lesão de 
reperfusão cardíaca seria retardar a normalização do pH fisiológico no momento da 
reperfusão o que pode ser conseguido através da inibição farmacológica do trocador 
Na
+
/H
+
 (AVKIRAN E MARBER, 2002) ou retardando o processo de reperfusão 
cardíaca, como no caso do pós-condicionamento isquêmico (FUJITA et al., 2007), 
denominado "hipótese de pH" por Cohen e Downey (COHEN; YANG; DOWNEY, 
2007). 
 
 Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial (PTPm) 
Muitos dos percursores da lesão de reperfusão cardíaca parecem convergir para 
o PTPm. Este é um canal não seletivo da membrana mitocondrial interna, cuja abertura 
resulta em despolarização da membrana mitocondrial e desacoplamento da fosforilação 
oxidativa, levando a depleção de ATP e morte celular (HAUSENLOY E 
YELLON,2003; HEUSCH; BOENGLER; SCHULZ, 2010). No contexto da lesão de 
isquemia-reperfusão cardíaca aguda, demonstrou-se que o PTPm permanece fechado 
39 
 
durante a isquemia e aberto apenas na reperfusão em resposta à sobrecarga de Ca
2+
 
mitocondrial, estresse oxidativo e depleção relativa de ATP e correção rápida de pH 
(GRIFFITHS E HALESTRAP,1995). 
 
Assim, a prevenção da abertura do PTPm no momento da reperfusão através da 
administração de inibidores do PTPm (ciclosporina A- imunossupressor), no início da 
reperfusão cardíaca foi relatada em estudos experimentais no modelo de infarto do 
miocárdio,reduzem o tamanho do infarto em aproximadamente 40% -50% no coração 
de animais de pequeno e grande porte (HAUSENLOY et al., 2002; HAUSENLOY; 
DUCHEN; YELLON, 2003; ARGAUD et al., 2005; SKYSCHALLY; SCHULZ; 
HEUSCH, 2010). Sendo assim, o PTPm é um alvo terapêutico importante para a 
prevenção da lesão de isquemia-reperfusão cardíaca. 
2.4 LESÃO TARDIA DA REPERFUSÃO CARDÍACA: ESTENDENDO A JANELA 
DE CARDIOPROTEÇÃO. 
 
 Os estimuladores anteriormente descritos da lesão de isquemia-reperfusão 
cardíaca parecem operar nos primeiros minutos de reperfusão, fornecendo uma janela 
estreita para reduzir o tamanho do infarto do miocárdio. Todavia, vários outros 
processos importantes, como a apoptose e a inflamação, que também são iniciados 
durante a isquemia e continuam ao longo de várias horas de reperfusão, podem 
contribuir para o desenvolvimento de lesões de reperfusão letal no miocárdio. Essas vias 
contributivas fornecem uma segunda alternativa terapêutica potencial para reduzir o 
tamanho do infarto, mesmo depois da reperfusão cardíaca ter ocorrido. Em consonância 
com esta proposta dados experimentais demonstraram um aumento no tamanho do 
infarto do miocárdio, à medida que o tempo de reperfusão evolui, sugerindo que a lesão 
de reperfusão progride com o tempo (YELLON E HAUSENLOY, 2007; ROCHITTE et 
al., 1998; ZHAO et al., 2000). 
Vários estudos experimentais relataram que a administração de agentes 
cardioprotetores como eritropoietina (antiapoptótica) (GAO et al., 2007), inibidores 
PI3K-γ/ô (anti-inflamatórios) (DOUKAS et al.,2006), e pós-condicionamento 
isquêmico (antiapoptótico e anti-inflamatório) (ROUBILLE et al., 2011) de 30 minutos 
40 
 
a 24 horas para a reperfusão do miocárdio pode limitar o tamanho do infarto agudo do 
miocárdio a 72 horas. 
 
2.5 APOPTOSE 
A apoptose, ou morte celular programada, é um processo fisiológico elementar 
para a eliminação de células em excesso ou que não são mais necessárias ao organismo, 
ou ainda de células que, por alguma circunstância, é necessária a sua eliminação para a 
manutenção da homeostase dos tecidos (ADRIANA LUCHS;CLAUDIA 
PANTALEÃO, 2010). No entanto, esse fenômeno também está envolvido em condições 
patológicas. Os aspectos que caracterizam a morte celular programada são divididos em 
morfológicos e moleculares. Entre os aspectos morfológicos, observam-se redução do 
volume celular, condensação da cromatina, clivagem de DNA e fragmentação da célula 
em corpos apoptóticos, os quais são reconhecidos e fagocitados rapidamente por 
fagócitos sem ocasionar resposta imunológica (ADRIANA LUCHS;CLAUDIA 
PANTALEÃO, 2010). Entre os aspectos moleculares, estão: a liberação de citocromo c 
da mitocôndria e a ativação de caspases, as quais clivam diversos substratos celulares, 
levando as células à morte (AMARANTE-MENDES E GREEN, 1999). 
Amarante-Mendes e Green (1999), relataram que devido à dificuldade e às 
controvérsias em torno da definição de apoptose, define-se comumente esse fenômeno 
como decorrente de ativação de vias bioquímicas dentro das células, ou seja, ativação de 
proteínas denominadas caspases. 
 
Caspases 
 
A ativação das caspases ocorre por duas vias principais: uma via extrínseca 
(citoplasmática), mediada por receptores localizados na membrana celular, chamados 
receptores da morte, ou por uma via intrínseca (mitocondrial), mediada por estímulos 
internos de estresse intracelular, tais como lesão do DNA ou perturbações no ciclo 
celular ou nas vias metabólicas (PAROLIN E REASON, 2001). Essas diferentes vias 
culminam em ativação de proteases conhecidas como caspases, que têm papel 
fundamental no processo de morte celular. 
41As caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases) pertencem à 
família das cisteínas proteases (possuem uma cisteína no sítio ativo) que têm 
acapacidade de reconhecer e clivar substratos que possuam resíduos de aspartato 
(NICHOLSON E THORNBERRY,1997). As caspases sinalizam para a apoptose e 
clivam esses substratos levando à condensação e fragmentação nuclear, externalização 
de fosfolipídios de membrana que irão sinalizar para que estas células sejam fagocitadas 
por macrófagos (NICHOLSON E THORNBERRY,1997; BOATRIGHT E 
SALVESEN, 2003). São conhecidas 14 caspases humanas, sendo que seis (caspases -3, 
-6, -7, -8, -9, -10) participam da apoptose (BOATRIGHT E SALVESEN, 2003). As 
caspases -1, -4,-5, -11, -12, -13, -14 estão envolvidas na maturação de citocinas, e sua 
contribuição na apoptose permanece não esclarecida (DENAULT E SALVESEN, 
2002). 
 
Uma vez ativada, a maioria das caspases tem a habilidade de catalisar a ativação 
de múltiplos outros membros dessa família, resultando em amplificação da cascata 
proteolítica. Alguns membros, tais como a caspase-8, ocupam posição proximal na 
cascata proteolítica e agem como reguladores e iniciadores, enquanto outros, como a 
caspase-3, são mais distais e agem como efetores da fragmentação celular (PATEL, E 
GORES, 1998). 
Na lesão de IR cardíaca a via envolvida é a intrínseca, a liberação de citocromo c 
é regulada pelos membros da família Bcl-2 (B cell CLL/lymphoma 2) que possui 
proteínas pró e antiapoptóticas (PATEL, E GORES, 1998) . Em resposta ao estresse, 
membros pró-apoptóticos dessa família são translocados do citoplasma para a 
mitocôndria, onde promovem a liberação do citocromo c. No citoplasma, o citocromo c 
liga-se a Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor 1) e a pró-caspase 9, formando o 
complexo apoptossomo e ativando a caspase 9 que, por sua vez, ativa a caspase 3; 
assim, inicia-se a clivagem de substratos específicos que resultam nos aspectos 
morfológicos e bioquímicos da morte celular (ZIMMERMANN; 
BONZON;GREEN,2001) (Figura6) 
42 
 
 
 
Figura 6. Via intrínseca de ativação da apoptose (Apaf-1=fator de ativação de protease associada à 
apoptose 1). GRIVICICH;REGNER;BRONDANI (2007) 
 
 
 Proteínas Pró e Antiapoptóticas 
 
Os membros da família Bcl-2, como Bcl-2 e Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra 
large) inibem a apoptose, pois previnem a liberação de citocromo c e são chamados de 
reguladores antiapoptóticos. Por outro lado, Bax (Bcl-2-associated X protein), Bid e 
Bak (Bcl-2 relative Bak) são proteínas pró-apoptóticas (HENGARTNER, 2000). 
A expressão de Bcl-2 é capaz de inibir a geração de espécies reativas do 
oxigênio e a acidificação intracelular, bem como estabilizar o potencial de membrana da 
mitocôndria (VANDER HEIDEN E THOMPSON, 1991). A homeostasia é mantida 
pelo controle da quantidade de proteínas antiapoptóticas e pró-apoptóticas. Estímulos, 
como dano ao DNA, levam ao aumento na expressão das proteínas pró-apoptóticas. 
Esse desequilíbrio induz a apoptose (PETROS; OLEJNICZAK; FESIK, 2004). 
Entre as proteínas mais estudadas desta família, estão a Bax (pró-apoptótica) e a 
Bcl-2 (antiapoptótica) (BRONNER; CULIN; REED; FURTH, 1995). Estas proteínas 
são capazes de formar homodímeros (Bax-Bax e Bcl-2-Bcl-2) e heterodímeros (Bax-
43 
 
Bcl-2), sendo que o equilíbrio entre esses homodímeros e heterodímeros pode definir o 
balanço pró-apoptótico ou antiapoptótico na célula (PETROS; OLEJNICZAK; FESIK, 
2004). Após um estímulo de morte, a Bcl-2 inibe a permeabilização da membrana 
externa da mitocôndria, pelo sequestro de Bax ou por competir por sítios que seriam 
ocupados pela Bax na membrana externa mitocondrial (MURPHY et al., 2000). A Bax 
pode promover a apoptose através da interação com a mitocôndria, de forma 
independente da interação com proteínas antiapoptóticas (PETROS; OLEJNICZAK; 
FESIK, 2004). 
 
2.6 CONSIDERAÇÕES SOBRE A MYRTUS COMMUNIS L. E O MONOTERPENO 
(-) MIRTENOL 
 
Infelizmente, as terapias atuais proporcionaram resultados clínicos ruins e, 
apesar dos esforços de pesquisa bem-sucedidos para identificar novos alvos moleculares 
e desenvolver novas estratégias terapêuticas para doenças isquêmicas cardíacas, são 
necessárias terapias alternativas (BULLUCK et al., 2016; HAUSENLOY; YELLON, 
2013). Assim, a identificação de agentes farmacológicos que atuem em várias vias de 
sinalização chave atualmente surge como uma abordagem promissora para o tratamento 
de doenças cardíacas. 
Muitos estudos epidemiológicos, clínicos e experimentais demonstraram que o 
uso de antioxidantes como abordagem preventiva pode limitar o tamanho do infarto e 
atenuar a disfunção miocárdica, bem como, diminuir a progressão e as consequências do 
infarto do miocárdio (AGRAWAL et al., 2014; ERTRACHT, O et al., 2014; RODRIGO 
et al., 2014; GOYAL et al., 2010). 
Os antioxidantes não apenas suprimem a formação de EROS e a geração de 
radicais livres e/ou o aumento de enzimas antioxidantes endógenas, mas também 
modulam a função cardíaca (TAPPIA et al., 2001; YO AGRAWAL et al., 2014; 
ERTRACHT, O et al., 2014). 
Os monoterpenos apresentam diversas propriedades farmacológicas, incluindo 
as atividades antioxidante, antifúngica e antimicrobiana (AL NOMAANI et al., 2013) e 
analgésica (MELO et al., 2010, GUIMARAES et al., 2013). Sobre o sistema 
44 
 
cardiovascular, estudos mostram que diferentes monoterpenos são capazes de promover, 
entre outras ações, hipotensão, vasorelaxamento, redução da contratilidade e da 
frequência cardíaca (SANTOS et al., 2011). Podemos citar como exemplo a ação dos 
monoterpenos citronelol (BASTOS et al., 2010), carvacrol (JOCA et al., 2012), timol 
(MAGYAR et al., 2004), mentol (BAYLIE et al., 2010) e R-(+)-pulegona (DE 
CERQUEIRA et al., 2011) que atuam bloqueando canais para cálcio e sódio sensíveis à 
voltagem. 
Os monoterpenos são encontrados em plantas aromáticas tais como Salvia 
officinalis (sábio), Tanacetum vulgare (tansy), Mentha spicata (hortelã) e Foeniculum 
vulgare (erva-doce). A partir destas e de outras plantas há a extração de óleos essenciais 
como, por exemplo, o mentol, hortelã-pimenta, limoneno, geraniol, citronela, citrino, 
cânfora e terpineol. Por isso, os monoterpenos são também utilizados no controle de 
odores (como fragrâncias em compostos de limpeza) (SAXENA et al., 2013). 
Os monoterpenos são constituídos por duas unidades isoprênicas, as quais são 
formadas por cinco carbonos cada, representando cerca de 90% dos constituintes dos 
óleos essenciais (BAKKALI et al., 2008). Os óleos essenciais são misturas complexas 
de compostos orgânicos que apresentam natureza volátil e são produzidos pelo 
metabolismo secundário das plantas, os quais são constituídos por hidrocarbonetos 
(monoterpenos e sesquiterpenos) e compostos oxigenados (álcoois, ésteres, aldeídos, 
cetonas, lactonas e derivados fenólicos) (GUENTHER, 1948). 
Dentre as plantas com promissoras atividades farmacológicas, Myrtus communis 
L. (Figura 7), uma espécie da família Myrtaceae tem sido investigada. É uma planta 
arbustiva aromática procedente da região mediterrânea da Europa, sendo cultivada 
mundialmente. Conhecida popularmente como “murta-comum” ou “mirta”, o seu 
habitat preferencial é xerofílico (seco), podendo ser encontrada em diversas regiões do 
Brasil, tradicionalmente utilizada no sul do país no tratamento de problemas estomacais 
(SALVAGNANI et al., 2008). 
A mirta é amplamente utilizada em parques, jardins e vias públicas (DE 
AZEREDO; RODRIGUES; CASSINO, 2004) e, por apresentar em sua composição 
química monoterpenos, diterpenos, cetonas e álcoois, pode ser considerada como uma 
potencial riqueza em exploração pela indústria farmacêutica. 
45 
 
 
Figura 7 Myrtus communis L 
Fonte: OZKAN;GURAY, 2009 
 
Dentre os óleos essências derivados dessas plantas temos como constituinte 
majoritário o (-) mirtenol (Figura 8), também conhecido como “cis-mirtenol”ou 
simplesmente “mirtenol”, um monoterpeno representante do grupo químico dos álcoois 
monocíclicos, que pode ser obtido por hidrodestilação a partir das folhas de mirta, sendo 
suas formas isoméricas (+)-mirtenol e (-)-mirtenol provavelmente sendo as mais 
variantes. 
 
Figura 8-Estrutura química do (-) mirtenol 
Fonte: GOMES et al., 2017 
 
 
O mirtenol apresenta a fórmula química C10H16O (Figura 5). Tem como 
sinônimos: (-)-mirtenol; (1R)-2-Pineno-10-ol; (1R)-6,6-Dimetilbiciclo [3.1.1.] hept-2-
eno-2-metanol. Está registrado no CAS (registros de substâncias orgânicas e inorgânicas 
únicas) sob número 19894-97-4. Seu peso molecular é equivalente a 152,23 g/mol e 
apresenta grau de pureza de ≥ 95%. Seu ponto de ebulição corresponde a 221-222°C e 
sua densidade de vapor é 0,954 g/mL a 25°C (SIGMA-ALDRICH BRASIL, 2017). 
46 
 
Com relação as suas propriedades físico-químicas, tem aparência incolor a amarelo 
pálido e encontra-se naturalmente na forma líquida com aspecto oleoso. 
O mirtenol embora inicialmente utilizado como agente flavorizante de perfumes 
e vinhos, sua atividade antioxidante é bastante conhecida. GOMES et al., 2017, 
demonstraram o efeito antioxidante do mirtenol sob a atividade moduladora do estresse 
oxidativo na artrite crônica experimental. Foi utilizado via oral nas doses (12,5, 25 ou 
50 mg/kg) em ratos machos, apresentando níveis elevados de SOD no plasma. 
MOREIRA, et al., 2012 mostraram que o mirtenol possui atividade antioxidante in 
vitro, prevenindo a peroxidação lipídica, a remoção do radical hidroxila e radical nitrito. 
In vivo nas doses (25, 50 e 75 mg/kg), por via oral reduziu de maneira significante os 
níveis de lipoperoxidação e o teor de nitrito. Em relação a atividade das enzimas 
endógenas, aumentou significantemente a atividade da SOD e CAT. 
O efeito do mirtenol foi avaliado em mitocôndrias isoladas de cérebro e fígado 
de ratos Wistar pré-tratados nas doses de 25, 50 e 75 mg kg. O mirtenol reduziu 
significativamente a quantidade da peroxidação lipídica, e da produção de nitrito, porém 
não alterarou a atividade das enzimas superóxido dismutase e catalase e, diminuiu as 
concentrações de GSH (SILVA, 2015). 
VIANA et al., 2016, mostraram que o mirtenol apresentou atividades 
gastroprotetora, antioxidante e anti-inflamatória. O potencial antiulcerogênico do 
mirtenol foi avaliado contra lesões gástricas induzidas pelo etanol, para isso utilizaram 
doses orais de (25, 50 e 100 mg/kg), onde o mirtenol diminuiu significativamente a 
gravidade das lesões gástricas induzidas pelo etanol. Além disso, proporcionou 
gastroproteção que foi acompanhada por uma diminuição da atividade da 
mieloperoxidase e do malonaldeído, aumento da atividade GPx, SOD e CAT no tecido 
gástrico e manteve níveis normais de nitrito/nitrato, muco gástrico e NP-SHs 
(sulfidrilos não protéicos). 
EVSTATIEVA, L. et al., (2010) demonstraram a atividade anticancerígena, do 
mirtenol por inibição de células neoplásicas cervicouterinas. GOMES et al., 2017 
avaliaram o pré-tratamento com o mirtenol, nas doses de (12,5, 25 e 75 mg/kg) via oral, 
sob a quimiotaxia in vitro para a N-formilmetionil- leucil-fenilalanina (fMLP) onde o 
mirtenol reduziu a contagem de células neoplásicas. 
47 
 
A ação anti-inflamatória do mirtenol, foi investigada por GOMES et al., 2017 na 
artrite crônica experimental e migração de neutrófilos, onde o mesmo foi utilizado via 
oral nas doses (12,5, 25 ou 50 mg/kg), inibindo a liberação de citocinas e migração de 
neutrófilos. 
A ação ansiolítica, neuroléptica e anticonvulsivante do mirtenol foi estuda por 
MOREIRA et al., 2014 nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg, por via i.p, para verificar o 
efeito ansiolítico, através do teste do labirinto em cruz elevada (TLCE), teste de 
transição claro e escuro (TTCE), teste de campo aberto (TCA) e Rota Rod para avaliar 
os efeitos sobre o sistema locomotor. No TLCE o mirtenol aumentou significativamente 
o número de entradas e o tempo de permanência dos animais nos braços abertos e, no 
TTCE, aumentou significativamente o tempo de permanência dos animais no 
compartimento claro. No TCA e teste Rota Rod, não houve alterações significativas dos 
parâmetros observados. O efeito neuroléptico pelo teste de catalepsina induzida por 
haloperidol (HAL) nasdoses de 50, 100 e 150 mg/kg, por via oral e para os testes de 
verificação do efeito anticonvulsivante através do teste de convulsão induzido por 
pentilenotetrazol (PTZ), picrotoxina (PIC) e pilocarpina (P). Nos testes para avaliar a 
convulsão, o mirtenol aumentou a latência para a primeira convulsão e diminui a 
porcentagem destas, assim como o percentual de mortes de animais. No teste da 
catatonia o mirtenol reduziu significativamente o tempo de permanência dos animais na 
posição antifisiológica induzida. 
SILVA, (2015) investigou a atividade antiepilética do mirtenol em mitocôndrias 
isoladas de cérebro de ratos Wistar pré-tratados nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg. Em 
todas as doses testadas os animais pré-tratados com (-)-mirtenol reduziram 
significativamente o número de crises epiléticasaumentando a taxa de sobrevivência em 
relação ao grupo controle convulsivo, diminuindo os danos neurais causados após 
indução das crises epiléticas, promovendo neuroproteção 
Silva e colaboradores (2014) relataram o efeito do mirtenol na nocicepção 
(retorção induzida por ácido acético, teste de placa quente e lambida de pata induzida 
por formalina, glutamato e capsaicina). Além disso, o mirtenol inibiu o retorcimento 
induzido pelo ácido acético, não prolongou significativamente o tempo de latência no 
teste de placa quente, diminuição o tempo de lamber induzida por uma injeção 
48 
 
intraplantar de formalina (apenas na segunda fase), glutamato e capsaicina. GOMES et 
al., 2017 avaliaram o pré tratamento com o mirtenol, nas doses de (25, 50 e 75 mg/kg), 
em modelos clássicos de inflamação (edema de pata induzido por diferentes agentes, 
peritonite induzida por carragenina, níveis de mieloperoxidase e medição de citocinas) e 
a incapacidade articular (tempo de elevação da pata), para avaliar sua ação 
antinociceptiva. O mirtenol inibiu o edema da pata, histamina, serotonina e 
prostaglandinas E2, bem como reduziu a atividade da mieloperoxidase e os níveis de 
citocinas. O proeminente edema da pata e incapacidade da articulação, foram 
significativamente impedidos pelo mirtenol. 
Santos e colaboradores (2011) descreveram a ação anti-hipertensiva do mirtenol 
na dose de 1 e 5 mg/kg administrado via intravenosa em ratos. Sepici-Dincel e 
colaboradores (2007), avaliaram o efeito do mirtenol em relação a diabetes induzida por 
aloxano, em ratos sendo o tratamento realizado por via oral em dose única de 50 mg/kg, 
levando a diminuição da glicemia constatando assim a ação anti-hiperglicêmica do 
mirtenol. Para verificar a ação antibacteriana (LEPOITTEVIN, et al., 2011), realizaram 
os testes microbiológicos destas moléculas (macro) por meio de testes de adesão de 
bactérias planctônicas em gram-positivos e gram-negativos, confirmando assim a ação 
antibacteriana do mirtenol, visto que o número de bactérias reduziu significativamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
49 
 
3. OBJETIVOS 
Geral 
 
Avaliar o efeito do pré-tratamento com Mirtenol na prevenção das lesões de 
reperfusão cardíaca em ratos. 
 
Objetivos específicos 
 Analisar os parâmetros contráteis e elétricos do Mirtenol em coração pós-
isquêmico; 
 Avaliar o efeito deste pré-tratamento sobre as arritmias de reperfusão; 
 Investigar o possível efeito antioxidante do Mirtenol em tecido cardíaco 
pós-isquêmico; 
 Mensurar o efeito do Mirtenol na limitação da área de isquemia; 
 Investigar o efeito do Mirtenol na morte celular em coração pós-
isquêmico 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
50 
 
4. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
4.1 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA 
 
Todos os procedimentos experimentaisque constam no presente trabalho foram 
previamente aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da 
Universidade Federal de Sergipe (UFS), sob o parecer técnico 46/2017 e os 
experimentos executados com base na normativa do Conselho Nacional de Controle de 
Experimentação Animal (CONCEA/MCT). 
 
4.2 ANIMAIS, DOSE DA SUBSTÂNCIA UTILIZADA NO 
TRATAMENTO E GRUPOS EXPERIMENTAIS 
 
Animais 
Neste estudo foram utilizados 276 ratos machos Wistar saudáveis, pesando entre 
250-270 g, provenientes do Biotério Setorial da Universidade Federal de Sergipe (UFS) 
e do Biotério da Universidade Tiradentes (UNIT), mantidos no Biotério do Laboratório 
de Biologia Cardiovascular e Estresse Oxidativo da UFS. Os animais foram mantidos 
em ciclo claro/escuro de 12/12 horas, e acondicionados em gaiolas coletivas com 5 
animais por gaiola, em sala com temperatura controlada (22 ± 2°C) e com livre acesso à 
ração e água. 
Determinação da dose 
A dose utilizada do mirtenol foi determinada com base no tratamento de animais 
saudáveis, em um projeto piloto, no qual foi realizada através da mensuração da 
peroxidação lipídica por meio do teste do TBARS (Substâncias Reativas ao Ácido 
Tiobarbitúrico) nas concentrações 25, 50 e 100 mg/kg. 
 
Grupos Experimentais 
51 
 
Para a execução do protocolo experimental referente à lesão de isquemia-
reperfusão (IR) cardíaca, os animais foram distribuídos de forma randomizada em 4 
grupos: 
(1) Controle: os animais foram pré-tratados com solução salina (NaCl 0,9% 0,20 mL + 
DMSO 0,05 mL) sem lesão de IR; 
(2) Veículo + IR: os animais foram pré-tratados com solução salina submetidos à lesão 
de IR; 
(3) Mirtenol + IR: os animais foram pré-tratados com mirtenol (50 mg/kg) + solução 
salina submetidos à lesão de IR; 
(4) NAC + IR: os animais foram pré-tratados com N-acetil-L-cisteína (1.200 mg/kg) + 
solução salina submetidos a lesão IR. 
 
Os animais foram submetidos a um pré-tratamento por gavagem, durante 7 dias 
consecutivos, mimetizando, assim, uma situação de tratamento, visando prevenir a lesão 
induzida no protocolo IR por um agente antioxidante. Após o término do tratamento, 
foram administrados 1000 UI de heparina (i.p.) e após 15 minutos os animais foram 
eutanasiados por decapitação. Em seguida, o tórax foi aberto e o coração rapidamente 
removido e cuidadosamente montado em um sistema de perfusão aórtica de fluxo 
constante (10 mL/min), do tipo Langendorff modificado por Vassallo et al., (1998) 
(Figura 8). 
 
4.3 PROTOCOLO DE ISQUEMIA/REPERFUSÃO CARDÍACA 
52 
 
4.3.1- MODELO DE ISQUEMIA/REPERFUSÃO 
 
Figura 9. Representação esquemática do sistema de perfusão aórtica de fluxo constante do tipo 
Langendorff. VASSALLO et al., (1998) 
 
Nessa montagem experimental (Figura 9) o átrio esquerdo foi removido para a 
inserção de um balonete, conectado a um transdutor pressórico. Os corações foram 
mantidos sob perfusão contínua com solução Krebs-Henseleit (K-H) em pH = 7,4 
(Quadro 2) previamente filtrada através de uma membrana de acetato de celulose (0,45 
μm), oxigenada (95% O2 + 5% CO2) e mantida a temperatura de 37± 0,2°C (Haake F3, 
Berlim, Alemanha). Após 20 minutos de estabilização da preparação, os corações foram 
submetidos à isquemia global (sem fluxo) durante 30 minutos. Após esse tempo, o fluxo 
foi restabelecido e a solução (K-H) foi perfundida por 60 minutos (Figura 10). 
 
Quadro 2. SOLUÇÃO DE KREBS-HENSELEIT 
Composto 
Molaridade 
(mM) 
NaCl 118 
KCl 4,7 
KH2PO4 1,2 
MgSO4.7H2O 1,2 
Glicose 11,1 
NaHCO3 25,0 
CaCl2 1,25 
95% O
2
 
 5% CO
2
 
Krebs 
Bomba 
10 mL/min 
34 ± 0,2 
o
C 
ECG 
Parâmetros 
contráteis 
Balonete 
LDH 
(perfusato) 
53 
 
 
 
 
Figura 10. Representação esquemática do protocolo experimental. 
 
4.3.2 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CONTRÁTEIS E 
ELETROCARDIOGRÁFICOS 
 A partir da montagem experimental (Figura 9) foram adquiridas as medidas de 
pressão no ventrículo esquerdo (PVE), a frequência cardíaca (FC) e as derivadas 
temporais de pressão ventricular máxima (+dP/dt) e mínima (-dP/dt). As medidas foram 
obtidas sob condições basais do coração e durante o período de reperfusão, sendo as 
medidas realizadas a cada 10 min ao longo do procedimento experimental (JIA et al., 
2016). Os registros foram captados por transdutores e os sinais interpretados pelo 
software WindaqEX® (DataQ Instruments) já a análise dos dados realizada com o 
software LabChart7® (ADInstruments). A análise dos registros foi feita evitando 
qualquer tipo de artefatos ou arritmias. 
Para registrar simultaneamente os sinais elétricos que compõem o 
eletrocardiograma (ECG) ex vivo, o coração inteiro foi mantido em cuba para órgão 
isolado imerso em solução de (K-H) a 37°C. Três eletrodos (Ag/AgCl/ NaCl, 1 mol/L) 
foram colocados dentro desta câmara próximo ao coração para detectar os sinais 
elétricos (Figura 9). Em todos os grupos experimentais, foram medidos, em 10 
batimentos consecutivos a FC, o intervalo PR e a duração do complexo QRS. O 
segmento-ST foi também avaliado. 
Grupos Veículo + IR, Mirtenol + IR e NAC + IR 
Grupo Controle 
54 
 
 
4.4 MENSURAÇÃO DA ATIVIDADE DA LACTATO DESIDROGENASE 
(LDH) 
 
Para determinar a atividade da LDH, amostras da solução de perfusão cardíaca 
foram coletadas do efluente coronário ao final do procedimento experimental e a 
atividade desta enzima foi medida de acordo com as recomendações do fabricante (LDH 
Liquiform - Labtest, Brasil). 
 
4.5 DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE SEVERIDADE DAS ARRITMIAS 
CARDÍACAS (ISA) 
 
As arritmias cardíacas foram avaliadas pela presença de extra-sístoles, 
taquicardia e/ou fibrilação ventricular durante os 60 min de reperfusão. Para obter uma 
análise quantitativa, as arritmias foram classificadas arbitrariamente por sua duração. A 
duração das arritmias observadas foi analisada e uma nota ou fator foi atribuído ao 
registro, segundo o quadro 3 (BERNAUER, 1986). 
 
 
Quadro 3. Determinação do Índice de Severidade de Arritmia (ISA) 
Duração das arritmias 
 (minutos) 
 
 
Fator 
< 3 2 
3-6 4 
6-10 6 
10-15 8 
15-20 10 
20-25 11 
25-30 12 
>30 Irreversível 
Fonte: (BERNAUER, 1986) 
 
 
 
55 
 
4.6- ENSAIOS DE ESTRESSE OXIDATIVO 
 
4.6.1 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA 
 
Ao término do protocolo de IR, os corações foram pesados e homogeneizados, 
na proporção de 100 mg de tecido/mL de tampão. O tampão utilizado para preparação 
da amostra foi substituído a depender do ensaio bioquímico que foi realizado (Tabela 4). 
As amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm (Neofuge 15R, HEAL FORCE®, EUA) 
por 30 minutos a 4ºC e o sobrenadante foi utilizado nos ensaios. 
 
Quadro 4. Constituintes dos tampões utilizados na preparação dos tecidos cardíacos para os ensaios 
bioquímicos 
 
Tampão Ensaio Substâncias 
 
 
Tampão Fosfato 
(50 mmol/L, pH 7,4) 
 
SOD e CAT 
Hidroperóxidos 
Grupamento sulfidrila 
 
 
NaCl 
NaH2PO4 
Na2HPO4 
 
 
 
Tampão Fosfato 
(50 mmol/L) 
Acrescido de KCl 
(140 mmol/L, pH 7,4) 
 
 
 
GPx 
 
 
 
 
 
NaH2PO4 
Na2HPO4 
KCl 
 
 
Tampão Fosfato 
(0,2 mol/L, pH7,5) 
e EDTA 
 
 
GR 
 
 
 
 
NaH2PO4 
Na2HPO4 
EDTA 
 
Tampão Fosfato 
(0,1 mol/L, pH 7,4) e 
BHT 
 
 
 
 
TBARS 
 
 
Na2HPO4 
BHT 
 
 
4.6.2 ENSAIO DE PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA 
 
No final dos procedimentos experimentais de IR cardíaca, os corações foram 
rapidamente removidos, e em seguida os produtos da peroxidação lipídica foram 
quantificados como descrito por BOSE et al., (1989). Resumidamente, as amostras 
56 
 
foram homogeneizadas em tampão de fosfato de potássio (50 mmol/L, pH 7,4) 
contendo butil-hidroxitoluol (BHT, 12,6 mmol/L) na proporção de 1g/5mL. Em 
seguida, os homogeneizados foram incubados durante 45 minutos a 90°C com solução 
contendo ácido tiobarbitúrico (TBA 0,37%), em solução ácida (15% de ácido 
tricloroacético- TCA e 0,25 N de ácido clorídrico). Posteriormente, os homogeneizadosforam centrifugados durante 5 min a 14.000 rpm e o sobrenadante foi misturado com n-
butanol e solução saturada de NaCl. A mistura foi agitada em vórtex por 30 segundos e 
novamente centrifugada a 14.000 rpm (Neofuge 15R, HEAL FORCE®, EUA) por 2 
minutos. Alíquotas do sobrenadante foram pipetadas em placas de 96 poços para a 
leitura de absorbância em leitor de microplaca (Biotek, ELx800 Absorbance Microplate 
Reader, EUA) à 535 nm, corrigindo pelos valores de absorbância a 572 nm. A 
quantidade de malondialdeído (MDA) foi expressa em nanomoles por gramas de tecido 
(nM/mg), sendo interpretada como marcador de peroxidação lipídica formado pela 
reação com o ácido tiobarbitúrico (TBARS). 
 
4.6.3 DETERMINAÇÃO DE HIDROPERÓXIDOS TOTAIS 
 
A mensuração dos hidroperóxidos totais foi realizada de acordo com Jiang et al., 
(1992). Esse ensaio se baseia na oxidação de íons ferroso (Fe
2+
) a íons férricos (Fe
3+
) 
em condições ácidas, pelos hidroperóxidos lipídicos. O homogeneizado foi misturado 
durante 30 minutos com reagente FOX, o qual é constituído por xilenol orange (0,25 
mmol/L), sulfato ferroso amoniacal (Fe (NH4)2(SO4)2.6H2O, 0,25 mmol/L), 
hidroxitolueno butilado (BHT, 4,4 mmol/L), metanol (CH4O) e ácido sulfúrico (H2SO4, 
97%). O indicador utilizado foi o xilenol orange que reage com os íons Fe
3+ 
produzindo 
um cromóforo azul-arroxeado, o qual pode ser medido por meio do espectrofotômetro a 
560 nm. Decorrido os 30 minutos, a amostra foi centrifugada e o sobrenadante colocado 
em microplaca e a leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro de placas. 
A quantificação dos hidroperóxidos foi expressa em mol/L, foi utilizado o coeficiente 
de extinção molar 4,3 x 10
-4 
M
-1 
cm
-1. 
 
 
 
 
57 
 
4.6.4 MEDIDA DE GRUPAMENTOS SULFIDRILAS TOTAIS 
 
A concentração de grupos sulfidrilas (SH) foi avaliada de acordo com Aksenov e 
Markesbery (2001). Os corações foram homogeneizados em tampão fosfato (PBS 50 
mmol/L, pH 7,4), e centrifugados (12.000 rpm durante 30 min, à 4°C). Posteriormente, 
o sobrenadante foi misturado com tris-EDTA (200 mmol/L, 2 mmol/L, pH 8,2), e uma 
primeira leitura espectrofotométrica foi realizada a um comprimento de onda de 412 
nm. Em seguida, adicionou-se DTNB (ácido 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzóico 10 mmol/L, 
em metanol) e após 15 min foi realizada a segunda leitura no mesmo comprimento de 
onda. A concentração total de grupos SH foi expressa em nmol/L/μg de proteína. 
 
4.6.5 MENSURAÇÃO DAS ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO 
(EROS) 
 
Os corações foram rapidamente removidos e imersos em meio para 
criopreservação (Tissue-Tek, O.C.T.) e imediatamente congelados. Os blocos de tecido 
congelados foram cortados transversalmente em seções de 30 μm de espessura e 
transferidos para lâminas histológicas. As lâminas foram pré-incubadas em solução de 
PBS pré-aquecida à 37°C durante 15 min e em seguida foi adicionado 10 μmol/L de 
dihidroetídio (DHE; Molecular Probes), uma sonda fluorescente permeável a membrana 
celular, durante 40 min (MACEDO et al., 2016). As imagens foram obtidas utilizando 
um microscópio de fluorescência (Ci-E, Nikon, Japão) e a intensidade de fluorescência 
do DHE foi mensurada usando o software ImageJ 1,38x (NIH, EUA). Para análise da 
intensidade da fluorescência, foi utilizada a ferramenta ROI manager (do inglês, Region 
of Interest) sendo o valor obtido normalizado pelo tamanho da área selecionada e 
subtraída do background. 
 
4.7 ATIVIDADES DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES ENDÓGENAS 
 
4.7.1 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO TOTAL DE 
PROTEÍNAS 
 
58 
 
A concentração total de proteínas foi estabelecida pelo método de Lowry et al., 
(1951). Em suma, foi adicionado às amostras NaOH 0,5 mol/L e as mesmas foram 
diluídas 10x. Após 15 min de incubação, foi acrescentada às amostras uma solução 
composta por: 2% Na2CO3, 1% CuSO4 e 2% KNaC4H4O6•4H2O, na proporção de 
(100:1:1). Ao término, foi adicionado o reagente de folin (1:1). Após incubação por 30 
min, foi realizada a leitura no comprimento de onda de 630 nm em espectrofotômetro de 
placa (ELx 800, BIOTEK Instruments®, EUA). Por fim, foi construída uma curva 
padrão de albumina bovina (Sigma-Aldrich®) para determinação da concentração de 
proteína nas amostras testes. 
 
4.7.2 ATIVIDADE DA SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD) 
 
A atividade de SOD foi realizada conforme Madesh e Balasubramanian (1998). 
Este ensaio mensurou a formação de O
2•-
 pela auto-oxidação do pirogalol e a inibição da 
redução do sal de tetrazolium (MTT). O tecido cardíaco foi homogeneizado em tampão 
fosfato PBS (50 mmolL, pH 7,4) e centrifugado a 12.000 rpm durante 30 min. A reação 
foi realizada pipetando-se, em triplicata na placa de Elisa o sobrenadante obtido, o PBS, 
o MTT (1,25 mmol/L) e pirogalol (100 μmol/L), Foram agitados durante 5 minutos e, 
posteriormente, adicionou-se dimetilsulfóxido (DMSO) à mistura e a leitura foi 
realizada em espectrofotômetro de microplaca a 570 nm (ELx 800, BIOTEK 
Instruments®, EUA). A atividade da SOD foi expressa em unidade de SOD por 
micrograma de proteína. 
4.7.3 ATIVIDADE DA CATALASE (CAT) 
 
A atividade da catalase foi determinada com base em Nelson e Kiesow (1972). 
A reação iniciou com a adição de H2O2 (0,3 mol/L) a alíquotas do sobrenadante as quais 
foram homogeneizadas em tampão fosfato (50 mmol/L, pH 7,0), centrifugado (Neofuge 
15R, HEAL FORCE®, EUA) a 12.000 rpm por 30 min a 4°C. Esse ensaio foi realizado 
em cubeta de quartzo com o ambiente protegido de luz, e as medidas realizadas em 
espectrofotômetro (ELx 800, BIOTEK Instruments®, EUA), em intervalos de 15 
segundos, a 25ºC, no comprimento de onda de 240 nm. Medindo o consumo de 
peróxido de hidrogênio (H2O2, 0,3 mol/L) foi capaz de quantificar a reação. A 
decomposição do H2O2 pela catalase foi monitorada durante 1 min a 25°C. A atividade 
59 
 
da enzima foi expressa pela diferença da variação das absorbâncias 
(ΔE)/minuto/micrograma de proteínas. 
 
 
4.7.4 ATIVIDADE DA GLUTATIONA PEROXIDASE (GPx) 
 
A atividade de GPx foi avaliada de acordo com Paglia e Valentine (1967). Os 
corações foram homogeneizados em PBS (contendo KCl 140 mmol/L, pH 7,4) e 
centrifugados a 12.000 rpm (Neofuge 15R, HEAL FORCE®, EUA) durante 30 min, a 
4°C e o sobrenadante separado para o ensaio enzimático. Na microplaca foi colocado 
tampão fosfato (100 mmol/L, pH 7,0), NADPH (8,4 μmol/L), glutationa redutase (GR, 
10 U/mg de proteína), azida sódica (NaN3, 1,125 mol/L), (GSH, 0,15 mmol/L), H2O2 
(2,2 mmol/L) e a amostra. A leitura foi realizada em 340 nm, 25ºC, por 6 min. A 
atividade da GPx foi avaliada pela oxidação do NADPH. Os resultados foram expressos 
em nmol/NADPH/minuto/micrograma de proteínas. 
 
4.7.5 ATIVIDADE DA GLUTATIONA REDUTASE (GR) 
 
A atividade de GR foi avaliada como descrito por Carlberg e Mannervik (1985) 
onde a atividade da glutationa redutase é proporcional ao consumo de NADPH. 
Resumidamente, as amostras foram homogeneizadas em PBS (200 mmol/L, pH 7,5) 
contendo ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA, 6,3 mmol/L), leupeptina (5 
mg/mL) e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, 100 mmol/L). O homogeneizado foi 
centrifugado durante 30 min a 12.000 rpm (Neofuge 15R, HEAL FORCE®, EUA), a 
4°C. Para o ensaio, adicionaram-se ao homogeneizado, albumina (0,5 mg/mL de 
tampão) e glutationa oxidada (GSSH, 10 mM). A reação foi iniciada pela adição de 
NADPH (1,2 mg/mL) e monitorada a 340 nm durante 8 minutos a 37°C. A atividade de 
GR foi expressa como nmol/minuto/micrograma de proteína. 
 
4.8 DETERMINAÇÃO DA ÁREA DE INFARTO 
 
No final dos procedimentos experimentais de IR cardíaca, o coração foi 
removido do sistema de Langendorf, cortado em secções de ~ 2 mm e incubados em 
60 
 
solução de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC, 1%) diluído em solução de K-H durante 10 
min. Após esse período, os cortes foram mergulhados em solução de formalina 
tamponada por 30 min, para a remoçãodo excesso da coloração. As seções do 
ventrículo esquerdo foram digitalizadas e analisadas usando o software ImageJ 1.38x 
(NIH, EUA). O tamanho do infarto do miocárdio foi mensurado selecionando, 
cuidadosamente, a região infartada e a área total do ventrículo esquerdo através da 
ferramenta free hand. Os valores foram expressos como porcentagem da área infartada 
em relação à secção total do ventrículo esquerdo. 
 
4.9 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEINAS REGULADORAS DA 
APOPTOSE 
4.9.1- Expressão do BAX, BCL-2 
O Western blot foi realizado como previamente descrito por Mesquita et al., 
2017. As amostras foram diluídas em tampão da amostra (Tris HCl/SDS pH = 6,8, 3% 
Glycerol, 1% SDS, 0,6% β-mercaptoetanol e 0,1% Azul de Bromofenol) e aquecidas a 
98°C por 5 min. Para a separação, foram aplicados 60 µg de proteínas em gel de SDS-
PAGE (do inglês sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) aq 7,5% 
ou 10%. 
Após serem separadas no gel de policrilamida, as proteínas foram transferidas 
para uma membrana de nitrocelulose (Milllipore®, USA) com poros de 0,44 µm. A 
qualidade da transferência foi monitorada através da coloração da membrana com 
solução de Ponceau 0,3%. A membrana foi então lavada em solução salina tamponada 
com tris-base acrescido com 0,05% de tween 20% (TBS-T) e colocada por 1 a 2 horas 
em solução de bloqueio (4% de albumina em TBS-T). Após o bloqueio, a membrana foi 
incubada em temperatura de 6-8°C, com o anticorpo primário específico diluído em 1% 
de albumina em TBS-T, overnight. Os seguintes anticorpos primários foram utilizados: 
anti-Bax (1:500, sc-526, Santa Cruz Biotechnology Inc-Santa Cruz, EUA), anti-Bcl-2 
(1:500, sc-492 Santa Cruz Biotechnology Inc-Santa Cruz, EUA) e anti-GAPDH 
(Gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase) (1:3.000, sc-32233, policlonal, Santa Cruz 
Biotechnology Inc-Santa Cruz, EUA). 
61 
 
Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com TBS-T durante 5 min e 
incubada por 2 h com o anticorpo secundário conjugado à peroxidase (HRP 1:5000, 
anti-goat IgG-HRP ou anti-rabbit IgG-HRP, Sigma, St Louis, EUA) diluído em 1% de 
albumina em TBS-T. Após o período de incubação, a membrana foi novamente lavada 
por mais três vezes em TBS-T durante 5 min. As bandas proteicas foram detectadas por 
uma reação de quimioluminescência (Luminata strongTM –Western HRP substrate, 
Merck-Millipore, Darmstad Alemanha) e a intensidade das mesmas foi avaliada por 
análise densitométrica através do software Image J 1,38x (NIH). A proteína GAPDH foi 
referência para normalização 
Para os experimentos acima citados, foram utilizados o sistema Mini Protean III-
Tetracell e Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (BIORAD
®
, EUA). 
4.9.2 Mensuração Das Proteínas Carboniladas 
 
 A quantificação de proteínas carboniladas foi realizada através da utilização de 
grupos carbonilas, utilizando o OxyblotProtein Detection Kit (s7150, Millipore, EUA). 
As proteínas solúveis do homogenato destinado à expressão protéica foram 
desnaturadas em 6% SDS e derivadas 1x2,4-Dinitrophenylhydrazine (DNPH) por 15 
min. A reação foi inibida por solução neutralizadora e submetida à eletroforese (SDS-
PAGE) do inglês (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), 
conforme descrito no item Expressão Proteica. As membranas de nitocelulose 
(Milllipore®, USA), foram então bloqueadas por 1 h em 1% BSA (albumina sérica 
bovina) e encubadas em anticorpo primário (Rabbit Anti-DNP, Sigma, EUA) e 
secundário (Goat Anti-Rabbit IgG – HRP conjugado Sigma, EUA), e a atividade 
quimioluminescente foi detectada, com quantificação da marcação entre as bandas de 
~15 a 170 kDa. A proteína GAPDH (Sigma, EUA) foi usada para normalização. 
 
 
4.10 AVALIAÇÃO DO ÍNDICE DE APOPTOSE (IA) IN SITU UTILIZANDO O 
MÉTODO TUNEL 
 
Neste estudo, o teste de TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase 
mediateddUTP - FITC nick end labeling) foi utilizado para detecção de fragmentação de 
62 
 
DNA, através da marcação da extremidade terminal de ácidos nucléicos, avaliando a 
apoptose cardíaca in situ. Para a realização do teste foi utilizado um kit In Situ Cell 
Death Detection (Roche, EUA), conforme as instruções recomendadas pelo fabricante 
com pequenas modificações (Pei et al., 2017). Três secções histológicas (5 μm de 
espessura, em intervalos de 50 μm) foram obtidas a partir das amostras embebidas na 
parafina, foram desparafinizadas em series de xilol (3 min cada), reidratadas em 
concentrações alcoólicas (3 min cada), realizada a recuperação antigênica em micro-
ondas por 10 min. Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 3% e 
álcool metílico (10 min). As secções foram então incubadas overnight em câmera úmida 
escura a 37°C com a solução proteinase K (100 μL), posteriormente incubadas com a 
solução Converter-POD (50 μL) na mesma câmara citada anteriormente por 1 h a 37 °C. 
Uma solução contendo 3,3'-diaminobenzidina (Dab), PBS e peróxido de hidrogênio 
0,3%, foi adicionado a cada secção, incubada por 10 min a 25°C. As secções foram 
desidratas em soluções alcoólicas (3 min cada) e diafanizadas em xilol (3 min cada), 
montadas em lamínulas de vidro e balsamo do Canadá. 
 
A marcação de células apoptóticas foi evidenciada por meio da visualização de 
células com núcleos corados em tom acastanhado. Dessa forma, células cujos núcleos 
forem marcados (corados em castanho) ou como corpos apoptóticos (fragmentos de 
células apoptóticas envolvidas por células vizinhas), independentemente da intensidade, 
foram consideradas como marcação positiva. O índice de apoptose foi expresso pela 
porcentagem de células com marcação positiva em 1000 células contadas a partir do 
registro fotomicrográfico de 10 campos histológicos em cada secção, usando 
microscópio Olympus modelo CX31 em magnificação de 400x acoplado a câmera 
Olympus C7070 wide zoom. O índice de apoptose foi calculado de acordo com a 
seguinte equação: IA (%) = (TnP / 1000) x 100, onde IA é o índice de apoptose e TnP é 
o número das células TUNEL-positivas. A seleção dos campos foi efetuada por meio de 
casualização sistemática, da esquerda para direita de cima para baixo, de modo que para 
cada campo registrado, dois subsequentes eram desprezados, até que se obtivesse o total 
de 10 registros fotomicrográficos. 
 
 
 
63 
 
 
4.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA 
 
Todos os dados foram expressos como médias ± EPM. Comparações estatísticas 
foram realizadas usando GraphPad Prism 5.1 (San Diego, CA, EUA). A normalidade e 
a igualdade de variância foram verificadas pelo teste de Shapiro-Wilk e Levene, 
respectivamente. Diferenças significativas entre os grupos foram determinadas por 
ANOVA de uma ou duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni. Quando apropriado, 
o teste de Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunn foi utilizado. As diferenças 
foram consideradas estatisticamente significativas quando p <0,05. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
64 
 
5. RESULTADOS 
 
5.1 Dose do mirtenol a ser utilizada no pré-tratamento dos animais 
 
Figura 11. Medida de malonaldeido (MDA) em coração de ratos pré-tratados com mirtenol (25, 50 e 
100 mg/kg/dia) durante 7 dias (gavagem) (n=5, por grupo). *p<0,05, vs. veículo; ( p> 0,05; 25 mg vs 100 
mg,) ##p< 0,01 vs 25 mg; 100mg. ANOVA de uma via seguido pelo pós-teste de Bonferroni 
 
Para determinar a dose a ser utilizada no pré-tratamento dos ratos foi realizado o 
teste de peroxidação lipídica (TBARS). Nesse ensaio, foram comparadas as doses de 25, 
50 e 100 mg/kg/dia quanto ao efeito sobre a peroxidação lipídica no tecido cardíaco.O 
pré-tratamento com essas doses diminuiu a formação de MDA, sendo que a dose de 50 
mg/kg/dia reduziu a formação de MDA(* p<0,05) para mais de 50% quando 
comparados ao grupo veículo, e apresentou redução significativa de MDA (## p<0,05) 
em relação às outras doses testadas,enquanto queuma dose maior (100 mg/kg) não 
proporcionou nenhum efeito adicional (Figura 11). Assim nesse estudo foi utilizado o 
mirtenol na dose de 50 mg/kg/dia. 
 
5.2 Mirtenol previne o comprometimento da contratilidade cardíaca 
induzida pela lesão de IR 
 
A disfunção contrátil é uma característica da lesão de IR cardíaca. Dessa forma, 
primeiramente avaliamos se o mirtenol era capaz de impedir o comprometimento da 
função mecânica cardíaca induzida pelo modelo de lesão por IR. Conforme ilustrado na 
65 
 
Figura 12A, a isquemia induziu um declínio acentuado da pressão ventricular esquerda 
(PVE), caindo para zero nos 20 min da isquemia. Logo em seguida, houve o 
restabelecimento da reperfusão, no qual foi observado que os corações dos animais que 
não foram tratados (veículo+IR) apresentaram comprometimento severo do 
desempenho contrátil (-70%, p < 0,001) em comparação com o grupo controle. 
 
 O pré-tratamento com mirtenol impediu a perda de função contrátil induzida 
pela lesão de IR cardíaca, em comparação à situação basal. Levando em consideração 
estudos preliminares que indicam a potencial atividade antioxidante do mirtenol, 
utilizamos um composto exógeno com propriedades antioxidantes bastante 
reconhecidas, (NAC), para avaliar o envolvimento de EROs sobre a diminuição da 
contratilidade cardíaca. O tratamento com NAC (grupo NAC+IR) teve um efeito similar 
ao apresentado pelo mirtenol (grupo mirtenol+IR). 
 
Ademais, logo após o restabelecimento da reperfusão, pôde-se observar que a 
frequência cardíaca (FC) foi completamente restaurada em relação à situação basal, bem 
como, não houve diferença significativa da FC após a lesão de IR entre os grupos 
experimentais estudados (Figura 12B). Os resultados mostraram também que o 
tratamento com mirtenol ou de maneira similar àquela promovida pelo NAC melhorou 
outros parâmetros contráteis após a IR, representados por uma melhora significativa das 
derivadas máxima (Figura 12C, +dP/dt; +80% ou +83%, respectivamente, p < 0,001) e 
mínima (Figura 12D, -dP/dt; +68% ou +73%, respectivamente, p < 0,001) da PVE. 
 
Para investigar se o mirtenol protegia o coração de danos celulares, foi medido o 
extravasamento da enzima citosólica LDH no perfusato, um indicador de lesão cardíaca. 
No final do protocolo de IR cardíaca, o extravasamento da LDH foi significativamente 
aumentado (230%, p <0,001) no grupo veículo+IR quando comparado ao controle 
(Figura 12E). Em contraste, nos animais tratados com mirtenol ou NAC esse aumento 
não foi verificado (Figura 12E). 
 
Além disso, o dano celular induzido pela lesão de IR cardíaca é comumente 
associado ao aparecimento de arritmias cardíacas. Logo, foi avaliado o aparecimento de 
eventos arrítmicos a partir dos traçados da PVE ao longo do período de reperfusão. 
66 
 
 
No grupo controle, como era esperado, foi observado uma baixa ocorrência de 
eventos arrítmicos (Figura 12F). Em contraposição, a lesão de IR nos corações do grupo 
veículo+IR levou a um aumento na ocorrência de eventos arrítmicos. Contudo, o 
tratamento com mirtenol ou NAC atenuou significativamente os eventos arrítmicos 
induzidos pela lesão de IR (Figura 12F, p <0,001). 
 
67 
 
 
Figura 12. O tratamento com mirtenol previne o comprometimento da contratilidade miocárdica 
induzida pela lesão por IR. A, pressão ventricular esquerda (PVE); B, frequência cardíaca; C, derivada 
máxima da pressão ventricular esquerda (+dP/ dt); D, derivada mínima da pressão ventricular esquerda (-
dP/dt); os símbolos das legendas estão apresentados no topo da figura (A-D); E, lactato desidrogenase 
(LDH). F, índice de arritmias. Os dados foram representados como médias ± EPM (n = 7). *** p < 0,001 
(veículo+IR) vs. (controle); ### p <0.001 (mirtenol+IR) e (NAC+IR) vs. (veículo IR). ANOVA de duas 
vias seguido do pós-teste de Bonferroni 
 
68 
 
5.3 Mirtenol impede a elevação do segmento-ST e atenua a gravidade das 
arritmias cardíacas induzidas por lesão de IR 
 
Para avaliar se o efeito cardioprotetor do mirtenol interfere nas propriedades 
elétricas do coração, os sinais do eletrocardiograma (ECG) ex vivo foram 
simultaneamente registrados ao longo do protocolo experimental de IR. 
 
Os traçados representativos do ECG estão mostrados na Figura 12A. Vale 
ressaltar a anormal forma de onda do ECG no grupo veículo+IR, caracterizada por 
elevação do segmento-ST, que foi abolida nos corações dos ratos tratados com mirtenol 
ou NAC. Nenhum dos parâmetros eletrocardiográficos avaliados (PRi, QRS e FC) 
foram modificados em corações dos animais tratados com veículo, mirtenol ou NAC 
submetidos à lesão IR quando comparados ao grupo controle (Figura 12B-D). Portanto, 
corroborando os resultados apresentados na Figura 12B. 
 
Analisando os registros de ECG, durante o período de reperfusão, foi possível 
distinguir três tipos de arritmias ventriculares, tais como batimentos ventriculares 
prematuros (BVP), taquicardia ventricular (TV) e fibrilação ventricular (FV). Conforme 
mostrado na Figura 13E, a lesão induzida por IR nos corações dos animais do grupo 
veículo+IR, mostrou um aumento acentuado na duração total das arritmias ventriculares 
(BVP, TV e FV). 
 
Em contraste, o tratamento com mirtenol ou NAC diminuiu significativamente a 
duração desses eventos após a IR quando comparado ao grupo veículo+ IR (Figura 
13E). No entanto, o tratamento com NAC foi o mais efetivo tratamento em reduzir a 
duração total das arritmias, sendo significativamente superior ao tratamento com 
mirtenol. 
 
Além disso, classificamos a ocorrência das arritmias ventriculares de acordo 
com seus respectivos subtipos. Como esperado, a maioria das arritmias apresentadas no 
grupo controle foi de menor gravidade, sendo registrados apenas BVP (Figura 13F). Por 
outro lado, o grupo veículo+IR e o grupo NAC apresentaram o tipo mais severo de 
arritmias ventriculares (FV). Diferentemente, o grupo mirtenol+IR apresentou arritmias 
69 
 
consideradas de média e baixa severidade (TV e BVP, respectivamente), sendo o maior 
percentual desses eventos classificados como de baixa gravidade. 
 
No entanto, apesar de ser o tratamento mais eficaz para reduzir a duração das 
arritmias, o grupo NAC+IR apresentou um padrão de ocorrência de arritmias similar ao 
grupo veículo+IR, sendo evidenciado um maior percentual de arritmias mais severas, 
como TV e FV (Figura 13F). 
 
 
70 
 
F
Figura 13. Mirtenol impede a elevação do segmento-ST e atenua a gravidade das arritmias 
cardíacas induzidas por lesão de IR. A, traçados representativos de ECG avaliados ex vivo nos grupos 
experimentais (seta indica o padrão normal do segmento ST, enquanto que o asterisco destaca a elevação 
do segmento ST); B, frequência cardíaca; C, intervalo PR; D, complexo QRS. Os parâmetros de ECG 
apresentados em B-D, foram analisados no final da reperfusão. E, duração das arritmias; F, Ocorrência de 
arritmias, BVP: batimentos ventriculares prematuros, TV: taquicardia ventricular e FV: fibrilação 
ventricular. E-F, arritmias ventriculares foram avaliadas ao longo de todo período de reperfusão. Os 
dados foram representados como médias ± EPM (n = 4-6). ** p < 0,01 (veículo+IR) vs. (Controle); # p < 
0,05 (mirtenol+IR) e (NAC+IR) vs. (veículo+IR); ψ p < 0,05 (NAC+IR) vs. (mirtenol+IR). ANOVA de 
uma via seguido pelo pós-teste de Bonferroni. 
 
71 
 
 
5.4 Mirtenol inibe o dano do estresse oxidativo por diminuir a formação de 
EROs e os biomarcadores de dano celular na lesão cardíaca induzida por IR 
 
Um grande número de evidências associa o estresse oxidativo como um 
protagonista disfuncional envolvido na lesão cardíaca induzida por IR. Portanto, 
avaliamos a produção de EROs cardíaca in situ, bem como, os biomarcadores de dano 
celular causados pelo estresse oxidativo. Conforme ilustrado na Figura 14A, o grupo 
veículo+IR apresentou um aumento acentuado (90%, p <0,001) na formação de EROsquando comparado ao grupo de controle. Diferentemente, os resultados mostraram que 
o tratamento com mirtenol ou NAC impediu totalmente a geração das EROs 
(Figura14A). 
 
O estresse oxidativo está biologicamente associado à peroxidação lipídica. Os 
resultados mostraram um nível mais elevado de hidroperóxidos (223%, p <0,001) no 
grupo veículo+IR em relação ao grupo controle (Figura 14B). A peroxidação lipídica 
produzida na lesão cardíaca induzida por IR foi impedida nos grupos tratados com 
mirtenol ou NAC (Figura 14B). 
 
Atualmente, as modificações oxidativas pós-traducionais em proteínas contendo 
grupamento tiol são reconhecidas como importantes vias de sinalizações intracelulares 
envolvidas na disfunção cardíaca. No grupo veículo+IR, houve uma perda de grupo 
sulfidrila livre (p <0,01) em comparação com o controle (Figura 14C), indicando a 
possível oxidação de grupo sulfidrila. Validamos essa hipótese quantificando os níveis 
de modificações oxidativas no coração, onde demonstramos uma elevada carbonilação 
de uma ampla gama de proteínas (de 170 kDa à 15 kDa) no veículo+IR em comparação 
com o grupo controle (Figura 14D). Em contraste, o tratamento com mirtenol e NAC 
impediram completamente tais modificações oxidativas pós-traducionais (Figura 14C e 
14D, respectivamente). 
 
72 
 
 
Figura 14. Tratamento com mirtenol inibe o dano de estresse oxidativo por diminuir a formação de 
EROs e biomarcadores de dano celular na lesão cardíaca induzida por IR. A, fluorescência do DHE 
representativa (painel superior) e análise quantitativa (painel inferior) (n = 18-23 regiões cardíacas 
aleatórias analisadas de 3-4 animais, barra de escala = 25 μm); B, Concentração hidroperóxidos totais; C, 
Concentração de grupos sulfidrilas livres; D, imagens representativas de carbonilação de proteínas (painel 
superior) e análise quantitativa (painel inferior). Os dados foram representados como médias ± EPM (n = 
6-9). * p<0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs. (controle); 
#
p < 0,05, ## p < 0,01 e ### p < 0,001 vs. 
(veículo+ IR). ANOVA de uma via seguido pelo pós-teste de Bonferroni. 
 
 
 
5.5 Mirtenol inibe o dano do estresse oxidativo por restaurar a atividade de 
enzimas antioxidantes endógenas na lesão cardíaca induzida por IR 
 
73 
 
Para obter uma melhor compreensão sobre os mecanismos envolvidos na 
prevenção do estresse oxidativo mediada pelo mirtenol na lesão de IR cardíaca, 
avaliamos a atividade enzimática das principais enzimas antioxidantes endógenas. 
Conforme mostrado na Figura 15, a lesão por IR cardíaca levou a uma diminuição da 
atividade da SOD (-46%, p<0.01, Figura 15A), catalase (-47%, p < 0.001, Figura 15B), 
GPx (-47%, p < 0,01, Figura 15C) e GR (-45%, p<0.001, Figura 15D) no grupo 
veículo+IR quando comparados ao grupo controle. No entanto, o tratamento com 
mirtenol ou NAC restaurou totalmente a atividade de todas as enzimas antioxidantes 
endógenas aqui avaliadas (Figura 15A-D). Em resumo, nossos resultados fortemente 
sustentam a hipótese de que a cardioproteção mediada pelo mirtenol ocorre através da 
inibição da formação de EROS e consequentemente do estresse oxidativo. 
 
 
Figura 15. Mirtenol inibe o dano do estresse oxidativo por restaurar a atividade de enzimas 
antioxidantes endógenas na lesão cardíaca induzida por IR. A, atividade de superóxido dismutase 
(SOD); B, atividade da catalase; C, atividade da glutationa peroxidase (GPx); D, atividade da glutationa 
redutase (GR). Os dados foram representados como médias ± EPM (n = 6-7). ** p < 0,01 e *** p < 0,001 
veículo + IR vs. controle; ## p < 0,01 e ### p < 0,001 mirtenol +IR e NAC+IR vs. veículo + IR. ANOVA 
de uma via, seguido pelo pós-teste de Bonferroni. 
 
74 
 
5.6 Mirtenol promove cardioproteção prevenindo infarto do miocárdio 
induzido por lesão de IR 
 
Em consonância com o aumento do dano celular, observou-se um notável 
aumento na área do infarto do miocárdio no grupo veículo+IR (144%, p <0,001) quando 
comparado ao controle (Figura 16). Por outro lado, o pré-tratamento com mirtenol 
promoveu uma cardioproteção, caracterizada pela redução significativa no tamanho da 
área infartada do miocárdio. Da mesma forma, o pré-tratamento com NAC também 
impediu o aumento da extensão do infarto do miocárdio induzido pela IR (Figura 16). 
 
 
 
Figura 16. Mirtenol promove a cardioproteção prevenindo o infarto do miocárdio induzido na lesão 
de IR. Imagens representativas da área de infarto nos grupos experimentais estudados (painel superior) e 
análise quantitativa do tamanho do infarto expresso em porcentagem da área total do ventrículo esquerdo 
(VE) (painel inferior). Barra de escala = 1 mm. Os dados foram representados como caixa (mediana, linha 
dentro da caixa, mín. e máx.) (n = 6-8). *** p <0,0001 vs. (Controle); ### p <0.001 vs. (veículo+IR). 
ANOVA uma via seguido pelo pós-teste de Bonferroni. 
 
 
75 
 
 
5.7 Mirtenol suprime a apoptose cardíaca induzida por lesão de IR 
 
A ativação da via apoptótica é uma das principais formas de morte celular em 
consequência de uma variedade de estímulos patológicos. Portanto, investigamos os 
efeitos do tratamento com mirtenol sobre proteínas relacionadas à apoptose do 
miocárdio, Bax e Bcl-2, após a lesão cardíaca (Figura 17). 
 
Conforme mostrado na Figura 16B, a lesão da IR induziu a ativação da via pró-
apoptótica, representada pelo aumento de 2,3 vezes na expressão da proteína Bax, que 
foi totalmente impedido pelo tratamento com o mirtenol ou NAC. Não foram detectadas 
alterações significativas entre os grupos experimentais (p = 0,07, Figura 17C). No 
entanto, a relação Bax/Blc-2 (Figura 17D), uma medida do equilíbrio das vias pró- e 
antiapoptótica, indica que o tratamento com mirtenol ou NAC causa cardioproteção 
através de uma marcada inibição da ativação da via pró-apoptótica. 
 
Para verificar se o mirtenol previne a morte celular através da inibição da 
ativação da via pró-apoptótica, também avaliamos a apoptose cardíaca in situ, 
quantificando a formação de células apoptóticas, que se distinguem pela coloração 
marrom de seus núcleos independentemente de sua intensidade. Um grande número de 
células TUNEL-positivas e, formação de corpos apoptóticos, foram observadas no 
grupo veículo+IR quando comparado ao controle (Figura 17E e F). 
 
Visivelmente, o número de células TUNEL-positivas no grupo mirtenol+IR e 
NAC+IR foi marcadamente diminuída em relação ao veículo. Além disso, não foi 
encontrada diferença significativa entre os grupos Mirtenol+IR e NAC+IR (p > 0,05). 
 
 
76 
 
 
Figura 17. O Tratamento com mirtenol suprime a apoptose do miocárdio induzida na lesão de IR. 
A, Imagens representativas de Western blot e análise quantitativa da expressão proteica para Bax (B), 
Bcl-2 (C) e relação Bax / Bcl-2 (D). Os dados foram representados como médias ± EPM (n = 4-5). E, 
imagens representativas da avaliação in situ de células apoptóticas pela marcação em TUNEL (Inset, 
núcleos marrons positivos são destacados em uma maior ampliação). Barra de escala = 25 μm. F, A 
análise quantitativa do índice de apoptose foi expressa como caixa (mediana, linha dentro da caixa, mín. e 
máx.) (n = 3). ** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs.(controle); # p < 0,05, ## p < 0,01 e ### p < 0,001) vs. 
(veículo+IR). ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Bonferroni (B-D). Teste de Kruskal-Wallis 
seguido do pós-teste de Dunn (F). 
 
 
 
 
 
 
77 
 
6. DISCUSSÃO 
 
Os principais achados deste estudo foram os seguintes: (1) o tratamento com 
mirtenol impediu a disfunção ventricular associada à redução do dano cardíaco, 
diminuiu a duração e a gravidade das arritmias ventriculares induzidas por lesão de IR 
cardíaca, (2) o tratamento com mirtenol atenuou o estresse oxidativo característico da 
lesão de IR e, (3) o tratamento com mirtenol protegeu, parcialmente, contra a ativação 
da via pró-apoptótica induzida pela lesão de IR. 
 
Oestresse oxidativo é um sinal disfuncional bem conhecido na lesão de IR 
cardíaca (CHUNG et al., 2013; LESNEFSKY et al., 2017; MURPHY E 
STEENBERGEN, 2008). Além disso, a produção excessiva de EROs que ocorrem 
durante a reperfusão, em corações isquêmicos, causa dano celular adicional, 
aumentando a extensão da área infartada e a deterioração da função ventricular 
(LESNEFSKY et al., 2017). A diminuição da função cardíaca é justificada pelas 
alterações presentes na SERCA e no receptor de rianodina, favorecendo o aumento da 
concentração intracelular do íon Ca
2+
 (WAGHORN et al, 2011; WALTERS et al, 
2012). Assim, ocorrem a hipercontração cardíaca, ativação descoordenada da 
maquinaria contrátil e falha no mecanismo de acoplamento-excitação-contração 
(PAGLIARO et al, 2011; WALTERS et al, 2012). Observa-se ainda a diminuição da 
pressão ventricular durante a sístole, aumento da pressão diastólica e da FC, resultando 
em déficit no volume de ejeção, podendo evoluir para a insuficiência cardíaca, que é 
uma complicação bastante comum após o IAM (DUNKER et al., 2009; PAGLIARO et 
al., 2011; QI et al., 2011; WAGHORN et al., 2011; WALTERS et al., 2012). 
 
A interrupção do suprimento sanguíneo para o coração causa, além da produção 
aumentada de EROs, uma menor atividade dos sistemas de defesas antioxidantes o que 
promove o estresse oxidativo celular (WALTERS et al., 2012). As EROs reagem com 
fosfolipídios e proteínas, produzindo a peroxidação lipídica, oxidação de grupos tióis e 
mudanças na configuração estrutural e na permeabilidade da membrana celular 
(BARREIROS et al., 2006; GALLUZZI et al., 2012). Além disso, no IAM ocorre 
diminuição da produção de ATP, menor atividade da SERCA e da bomba de Na
+
-K
+
, 
acúmulo intracelular de Ca
2+, 
geração de arritmias, diminuição da contratilidade do 
78 
 
miocárdio e morte celular (BRADY et al., 2006; IMAHASHI et al., 1999; 
TAKAMATSU, 2008). 
 
Por isso, terapias farmacológicas alternativas baseadas na inibição do estresse 
oxidativo são atualmente vistas como uma abordagem atrativa para o tratamento da 
lesão cardíaca induzida por IR. No presente estudo, o tratamento com mirtenol conferiu 
efeitos cardioprotetores em corações de animais submetidos a IR, como confirmado pela 
recuperação pós-isquêmica e constatada pela melhora da contratilidade cardíaca e, pela 
diminuição do dano celular (prevenção do extravasamento da enzima LDH). 
A única dose de mirtenol avaliada no presente estudo foi adotada após uma 
triagem preliminar de três doses (25, 50 e 100 mg/kg) e, selecionada de acordo com sua 
atividade antioxidante no protocolo experimental de lesão de IR cardíaca. Nossos dados 
preliminares revelaram que 50 mg/kg de mirtenol foi a dose mais eficaz em reduzir em 
mais de 50% a peroxidação lipídica induzida por lesão de IR, enquanto que uma dose 
maior (100 mg/kg) não proporcionou efeito adicional, segundo ROSS E MODEUS, 
(1991) esse efeito pode estar relacionado com a dose, a exemplo da vitamina C, que 
tem função antioxidante mas que em dose elevada, leva a lipoperoxidação agindo como 
um pró-oxidante. A lipoperoxidação acarreta alterações na estrutura e na 
permeabilidade das membranas celulares, com consequente perda da seletividade na 
troca iônica e liberação do conteúdo de organelas celulares, como as enzimas 
hidrolíticas dos lisossomos, e formação de produtos citotóxicos, culminando em morte 
celular . 
O método mais usual na avaliação da oxidação de lipídios é o teste de TBARS, 
devido à sua simplicidade e rapidez. O teste quantifica o malonaldeído (MDA), um dos 
principais produtos de decomposição dos hidroperóxidos de ácidos graxos 
poliinsaturados, formado durante o processo oxidativo (OSAWA; FELÍCIO; 
GONÇALVES, 2005), bastante utilizado para avaliar a atividade antioxidante de vários 
produtos naturais. 
 Os achados do ensaio de TBARS, sugeriram que o mirtenol pode proteger dos 
processos oxidativos as biomoléculas essenciais ao funcionamento de órgãos, como o 
cérebro e o coração, de modo semelhante aos observados em outros estudos utilizando 
monoterpenos (GUIMARÃES et al., 2010; COSTA, 2012). 
79 
 
A dissolução do mirtenol ocorreu em DMSO como proposto por BREDERODE 
et al. (2016) e SILVEIRA et al. (2012), sendo assim, este último foi administrado aos 
animais do grupo controle e veículo para evitar qualquer viés, uma vez que seria 
utilizado juntamente com o mirtenol. Utilizamos o (NAC) como controle positivo, 
sendo derivado dos tióis, é um agente antioxidante vitamínico largamente conhecido e 
disponível como medicamento. Foi administrado a concentração de 1200 mg/kg e 
dissolvido em salina como descrito por DICKEY et al., (2008). 
 
Em 2016, Viana e colaboradores mostraram que a dose 50 mg/kg/dia foi, dentre 
as doses estudadas, a que obteve melhor ação antioxidante nas lesões gástricas. Outro 
trabalho realizado por SILVA et al. (2015) demonstrou que o mirtenol na dose de 50 
mg/kg/dia não é tóxico. Ambos os trabalhos utilizaram a mesma via oral de 
administração que realizamos em nosso estudo. A literatura também mostra que a dose 
de 50 mg/kg de mirtenol possui propriedades antioxidantes, reduzindo a formação das 
EROs e, consequentemente, protegendo sistemas biológicos contra danos oxidativos 
(GOMES et al., 2017; SEPICI-DINCEL et al., 2007; VIANA et al., 2016). Em nosso 
estudo, demonstramos que o mirtenol teve um efeito protetor comparável ao observado 
em animais tratados com o NAC, indicando que a manipulação do perfil oxidativo é 
terapeuticamente relevante na prevenção de lesões cardíacas 
De fato, os compostos ativos derivados das plantas ganharam grande atenção 
devido aos seus notáveis efeitos biológicos benéficos. Entretanto, devem ser tomadas 
algumas precauções, como a frequência/tempo de exposição (dose única ou repetida) e a 
via de administração. Embora não haja estudo avaliando a toxicidade oral do mirtenol 
em animais, um estudo prévio revelou a dose letal média (DL50) de mirtenol em torno 
de 296 mg/kg pela via intraperitoneal (BHATIA., et al., 2008). Portanto, a dose 
utilizada no presente estudo foi aproximadamente 6 vezes menor a DL50. Assim, 
levando em consideração que as doses experimentais testadas em animais não são 
equivalentes às utilizadas pelos humanos, principalmente devido a diferentes taxas 
metabólicas, são necessários mais estudos para avaliar em um modelo realista da doença 
em animais de grande porte e prever com maior precisão uma potencial dose para 
humanos. 
80 
 
Assim, ao avaliar os animais pré-tratados com o mirtenol (50 mg/kg/dia), 
observou-se redução da quantidade de LDH liberado pelo tecido cardíaco após a IR. 
Como também, verificou-se recuperação da força contrátil após a isquemia, com 
preservação tanto da PVE quanto das dP/dt máxima e mínima. 
Apesar do excelente efeito protetor, o mirtenol e o NAC não impediram 
totalmente a ocorrência de arritmias ventriculares. No entanto, ambos foram capazes de 
abolir a aberrante forma do sinal eletrocardiográfico, caracterizada pela elevação do 
segmento ST, um sinal típico de infarto agudo do miocárdio (O'GARA et al., 2013). 
Embora vários novos protagonistas moleculares tenham sido identificados como pró-
arritmogênicos durante a IR do miocárdico, o estresse oxidativo, a sobrecarga de Ca
2+
 e 
a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial ainda são os principais 
fatores desencadeantes das arritmias ventriculares. Esses eventos ocorrem na fase inicial 
da reperfusão, sendo o BVP a forma menos severa e bem tolerada de arritmia 
(LESNEFSKY et al., 2017; MURPHY E STEENBERGEN, 2008; TURER E HILL, 
2010; WIT E JANSE, 2001). 
Do ponto de vista clínico, a TV e FV continuam sendo os subtipos mais 
frequentes e letais de arritmias cardíacas e causa de morte súbita (Moens et al., 2005; 
O'Gara et al., 2013). Todavia, nossos resultados mostraram que o mirtenol e NAC 
reduziram consideravelmente a duraçãoe a gravidade das arritmias ventriculares (BVP, 
TV e FV). Interessantemente, o tratamento com NAC teve maior impacto em tal 
variável em relação ao mirtenol, o que, por sua vez, pode equivocadamente antecipar 
melhores resultados. Surpreendentemente, apesar da menor duração das arritmias, os 
animais tratados com NAC mostraram um padrão semelhante de arritmias ventriculares, 
como mostrado em animais não tratados, sendo a maioria dos eventos arrítmicos 
concentrados nas formas mais letais de arritmias ventriculares (TV e FV). Por 
conseguinte, esta marcante diferença no efeito cardioprotetor conferido pelo tratamento 
com mirtenol indica que, apesar de estudos anteriores apoiarem suas propriedades 
antioxidantes (GOMES et al., 2017; SEPICI-DINCEL et al., 2007), os efeitos 
farmacológicos podem envolver a ativação de outros alvos com ações 
antiarritmogênicas. 
Drogas bloqueadoras dos canais de Ca
2+
 podem oferecer um potencial efeito 
terapêutico para o tratamento de doenças cardiovasculares, tais como as arritmias 
81 
 
cardíacas (BOMBIG; PÓVOA, 2009; OIGMAN; FRITSCH, 1998). O bloqueio desses 
canais como, por exemplo, o do tipo L e do trocador Na
+
/Ca
2+
, podem estar 
relacionados com a diminuição das arritmias, pois modulam a entrada de Ca
2+
 e a 
contratilidade cardíaca (BOURGONJE et al., 2013). Dessa forma, esse bloqueio pode 
ser salutar para o coração, modulando o surgimento das arritmias. De fato, os 
monoterpenos agem em um amplo espectro de alvos com propriedades 
antiarritmogênicas (DE MENEZES-FILHO et al., 2014, MAGYAR et al., 2004; 
SANTOS et al., 2011). Por exemplo, o monoterpeno geraniol bloqueia diretamente os 
canais de Ca
2+
 do tipo-L sem alterar sua ativação dependente da voltagem, estando 
ainda associado com atividade antiarrítmica induzida por ouabaína (DE MENEZES-
FILHO et al., 2014). Além disso, outros estudos também demonstraram que muitos 
terpenos também bloqueiam os canais de Ca
2+
 do tipo-L, como R(+)-pulegona em 
cardiomiócitos ventriculares de camundongos (DE CERQUEIRA et al., 2011), (-)-
mentol em cardiomiócitos do coelho ventricular (BAYLIE et al., 2010) e timol em 
células ventriculares caninas e humanas (MAGYAR et al., 2004). No entanto, embora 
não tenha sido investigado no presente estudo se o mirtenol modifica a atividade dos 
canais Ca
+2
 tipo-L, essa hipótese precisa ser pesquisada. 
A regulação adequada do ciclo do Ca
2+
 é essencial para a função contrátil 
normal e é um dos principais locais de falha potencial patológica, contribuindo não só 
para a disfunção contrátil, mas também para arritmia, disfunção energética e produção 
de EROs mitocondrial (BERS, 2008). Sabe-se que a sinalização de cálcio envolvida na 
regulação da função contrátil cardíaca é afetada pelo status redox celular (SANTOS, 
2011). Estudos mostram que há modificação redox de receptores rianodina (RyR) e 
canais para cálcio do tipo L, levando a desregulação dos mecanismos de controle 
intracelular de Ca
2+
. Essa desregulação se dá através da oxidação dos resíduos de 
cisteína presentes na proteína do canal, levando a ativação deste, com consequente 
sobrecarga de cálcio, resultado da estimulação da liberação do mesmo, desencadeando, 
desta forma, arritmias, bem como uma depressão contrátil cardíaca (TOCCHETTI et al., 
2007; ZENG et al., 2008; ZIMA; BLATTER, 2006). Fatos esses evidenciados nos 
animais do grupo veículo, com altos índices de arritmias e depressão contrátil. 
De acordo com estudos anteriores que sustentam que o mirtenol possui ações 
antioxidantes em tecidos não cardíacos (GOMES et al., 2017; SEPICI-DINCEL et al., 
82 
 
2007), demonstrou-se no corrente estudo que através de medidas in situ o mirtenol 
protege o coração contra a grande geração de EROs associado à diminuição do dano 
oxidativo. Além disso, o aumento na carbonilação de proteínas associado à redução do 
teor de proteínas sulfidrilas cardíacas durante a lesão de IR, indica uma prejudicada 
atividade antioxidante. Uma região susceptível a modificações oxidativas no ambiente 
celular são os grupamentos sulfidrilas (SH) presentes nas cadeias polipeptídicas e, que 
podem ser consideradas importantes marcadores de estresse oxidativo celular 
(HIMMELFARB; MCMONAGLE; MCMENAMIN, 2000; PÉREZ et al., 2012). A 
oxidação de grupamentos sulfidrilas causam alterações conformacionais, degradação de 
proteínas, levando a perda de atividade ou função proteica (BIRBEN et al., 2012). De 
fato, uma grande variedade de modificações pós-traducionais em grupamento tiol, 
encontrado no aminoácido cisteína, ou no grupo sulfidrila, tem sido bem descrito 
durante o estado redox-nitroso excessivo, tais como oxidação, nitrosilação, 
glutationilação, sulfenilação e ligações dissulfeto (CHUNG et al., 2013). No presente 
estudo, ambos mirtenol e NAC foram igualmente capazes de prevenir tais modificações 
pós-traducionais no grupo sulfidrila e carbonilação de proteínas, associado com a 
restauração da atividade das enzimas antioxidantes endógenas. 
O geraniol, um monoterpeno alcoólico, constituinte importante do óleo essencial 
do gengibre e limão, mostrou atividade antioxidante semelhante ao mirtenol na 
atividade de superóxido dismutase e na mensuração das EROs (Khan et al, 2013). 
Chen et al., (2016), administrando o monoterpeno carvacrol (25, 50 e 100 
mg/kg; i.p.) em ratos Wistar durante 7 dias consecutivos em modelo de IR cardíaca ex-
vivo, observaram aumento na atividade das enzimas CAT e SOD, e ainda diminuição da 
formação de MDA. Neste trabalho El‐ Sayed, Mansour e Abdul‐ Hameed (2016) pré-
trataram camundongos Swiss por 14 dias consecutivos com o timol (20 mg/kg, v.o.) e 
carvacrol (25 mg/kg, v.o.) e no 14º dia foi induzida cardiotoxicidade com doxorubicina. 
Foi observada diminuição na formação de MDA e da quantidade de LDH liberada, além 
de aumento da atividade das enzimas CAT e SOD no tecido cardíaco dos animais 
tratados com esses monoterpenos. 
Além disso, a elevação do segmento-ST é um forte indício clinicamente 
utilizado para identificação do infarto agudo do miocárdio em pacientes hospitalizados 
com sintomas de angina pectoris. Deste modo, os resultados do presente estudo 
83 
 
correlacionam-se com o aumento na área de infarto em animais não tratados, enquanto 
que o tratamento com mirtenol minimizou a extensão do tamanho da área infartada. 
Vários estudos utilizando diferentes modelos experimentais de indução de infarto agudo 
do miocárdio, sugerem que aproximadamente 50% de área infartada representa uma 
lesão de grandes proporções e com alta probabilidade de mortalidade (O'GARA et al., 
2013; YELLON E HAUSENLOY, 2007). Assim, muitas estratégias farmacológicas e 
não farmacológicas, têm sido desenvolvidas para atenuar ou prevenir a lesão de 
reperfusão após períodos de isquemia (FAN et al., 2016; FARAH et al., 2017; 
HAUSENLOY E YELLON, 2013; IBÁÑEZ et al., 2015; YUAN et al., 2015). No geral, 
nossos resultados fortemente indicam que o aprimoramento da capacidade antioxidante 
é o principal mecanismo pelo qual o mirtenol promove a cardioproteção. 
Além dos efeitos cardíacos, há uma quantidade substancial de evidências que 
apoiam a vasodilatação mediada por monoterpenos através de mecanismos dependentes, 
ou não, do endotélio vascular (BASTOS et al., 2010; EARLEY et al., 2010; PEIXOTO-
NEVES et al., 2010). Curiosamente, estudos recentes mostraram um efeito benéfico 
entre fatores liberados pelas células endoteliais que desempenham ações parácrinas e 
benéficas em cardiomiócitos submetidos à lesão de IR (FARAH et al., 2017, 
LEUCKER et al., 2013).Além disso, os cardiomiócitos cocultivados com células 
endoteliais (razão 1:3), submetidos por 2 h de hipóxia seguido de 2 h de reoxigenação, 
apresentaram um menor dano celular quando comparados com cardiomiócitos isolados 
(LEUCKER et al., 2013). Assim, embora o conhecimento sobre as ações vasculares do 
mirtenol seja limitado, atualmente nãotemos informações, se for aplicável, sobre como 
o mirtenol poderia modular a cardioproteção através de um mecanismo dependente das 
células endoteliais nas artérias coronárias. 
Fortes evidências indicam a inibição da inflamação como um mecanismo chave 
de proteção contra a lesão de IR cardíaca (VINTEN-JOHANSEN et al., 2007; YUAN et 
al., 2015). Importante ressaltar que estudos anteriores demonstraram uma potente 
atividade anti-inflamatória do mirtenol em diferentes tipos de tecido e células (GOMES 
et al., 2017, LEPOITTEVIN et al., 2011; SILVA et al., 2014). Além disso, a apoptose 
cardíaca é outro importante mecanismo intimamente implicado e reconhecido na 
disfunção cardíaca em corações submetidos à IR (EEFTING et al., 2004, 
HAMACHER-BRADY et al., 2006). Neste contexto, não foi encontrado nenhum estudo 
84 
 
que avaliasse se o mirtenol afeta proteínas relacionadas à apoptose, tais como Bax, Bcl-
2, caspase-3 e p53. Apenas, Evstatieva, l. et al, (2010) demonstraram a atividade 
anticancerígena, do mirtenol por inibição de células neoplásicas cervicouterinas. Assim, 
avaliamos se o mirtenol promove efeitos cardioprotetores através da inibição da morte 
celular apoptótica induzida pela lesão IR cardíaca. 
No presente estudo, mostramos que o mirtenol impediu a regulação positiva de 
Bax, uma proteína pró-apoptótica. Além disso, apesar de estudos relataram redução da 
regulação de Bcl-2, uma proteína antiapoptótica, em animais submetidos à lesão de IR 
(FAN et al., 2016; QU et al., 2016). Apesar da forte tendência à baixa regulação da 
expressão de Bcl-2 em animais não tratados, nossos valores não alcançaram diferença 
significativa. A lesão do miocárdio induzida pela IR, desencadeia, em um primeiro 
momento, a ativação das caspase-8 e -9, levando posteriormente a ativação de caspases 
efetores, tais como caspase-3 e -7, sendo estas responsáveis por mediar as típicas 
respostas morfológicas e fisiopatológicas em células em estado apoptótico (EEFTING 
et al., 2004; STEPHANOU et al., 2001). Portanto, novos estudos devem investigar se os 
efeitos do mirtenol modula a resposta tardia da via apoptótica. 
Considerando que a sobrevivência celular depende da dinâmica regulação das 
vias pró e antiapoptóticas, demonstrou-se que o mirtenol restaurou completamente o 
equilíbrio das proteínas pró e antiapoptóticas (razão Bax/Bcl-2). Em geral, nossos 
resultados corroboram o papel fundamental da apoptose na perda de função cardíaca e 
indicam que o mirtenol pode contribuir limitando a lesão cardíaca e prevenindo 
arritmias com risco de vida. Em resumo, nossos dados mostram que o mirtenol impede 
os efeitos deletérios induzidos por lesão de IR cardíaca. Além disso, nossos resultados 
indicam que as ações farmacológicas do mirtenol promovem a cardioproteção através 
da atenuação do estresse oxidativo e inibição da via pró-apoptótica. 
85 
 
7. CONCLUSÃO 
 
Este estudo demonstrou os efeitos cardioprotetores do mirtenol contra a lesão de 
IR. O pré-tratamento dos animais com mirtenol na dose de 50 mg/kg/dia, durante 7 dias, 
preserva a função contrátil cardíaca, impede o supradesnivelamento do segmento-ST 
atenua a gravidade das arritmias. Além disso, protege os corações contra a geração 
exacerbada de EROs, bem como, diminui a formação de biomarcadores de dano celular, 
estando ainda associada à uma diminuição do dano oxidativo através da restauração da 
atividade de enzimas antioxidantes endógenas. Além disso, o mirtenol previne o infarto 
do miocárdio e suprime a cascata intracelular envolvida no processo de apoptose 
cardíaca após a IR. No presente trabalho foi encontrado, como principal resultado, a 
ação antiarritmogênica do mirtenol, prevenindo formas mais severas das arritmias. Essa 
ação não está somente associada ao seu efeito antioxidante, pois ele mostrou efeito 
superior a um antioxidante já utilizado clinicamente. Diante do exposto, podemos 
concluir que o mirtenol é uma substância com relevante potencial terapêutico, na 
prevenção das lesões decorrentes de isquemia e reperfusão. 
 
8. PERSPECTIVAS 
Ainda se faz necessário a utilização de novos protocolos experimentais in vivo 
de disfunção cardíaca, através de estudos em animais de médio e grande porte, 
exaurindo qualquer questionamento sobre a atuação do mirtenol nos diversos modelos 
experimentais para o estudo de doenças cardiovasculares isquêmicas. É também crucial 
esclarecer se ocorre interação da molécula com outros componentes e vias de 
sinalização celulares como, por exemplo, o estudo da interação com canais e 
transportadores iônicos, para que seja possível uma aplicação clínica segura dessa 
molécula e para que o mirtenol possa ser disponibilizado na forma de suplemento para 
pacientes acometidos pelo IAM. Desta forma, será possível reduzir ou até mesmo 
eliminar efeitos colaterais aos quais os pacientes estão expostos e que são causados por 
muitos medicamentos ultilizados hoje na terapêutica, além de poder programar 
administração prévia à cirurgias cardíacas eletivas, buscando, assim, uma melhora na 
qualidade de vida de pessoas acometidas por essas doenças ou procedimentos médicos. 
 
86 
 
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