Cromatografia CCD e CC

Prévia do material em texto

CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE MINAS 
GERAIS 
CURSO TÉCNICO EM QUÍMICA 
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
Laboratório de Química Orgânica II 
Turma QUI 3A – T1 
 
 
 
Prof.a Cleverson Garcia 
 
Alunos: André Oliveira Mesquita, Artur Blon do Carmo Leite e Giovanna Ramalho de Oliveira 
Data da prática: 27/03/2024 e 03/04/2024 
 
 
 
 
 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA 
DELGADA E EM COLUNA 
Estudo dos pigmentos do agrião 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BELO HORIZONTE ABRIL/2024 
1. Introdução 
A fotossíntese, processo energético realizado pelas plantas, significa etimologicamente 
síntese pela luz. Funciona, desse modo, através da conversão de energia luminosa em 
energia química. Os seres fotossintetizantes utilizam a energia luminosa para produzir 
compostos orgânicos, como a glicose, tendo como fonte de carbono o dióxido de carbono 
(CO2) e como fonte de hidrogênio a água 1. O processo segue a equação 1 abaixo: 
 
6 CO2 +12 H2O → C6 H12O6 + 6 O2 + 6 H2O 
 
 
A absorção da luz solar crucial para o processo de produção de glicose é realizada através 
da clorofila. A clorofila é o pigmento fundamental presente nos seres autotróficos, tendo como 
característica principal sua coloração verde. Isso se dá devido a sua alta eficiência de 
absorção das luzes violeta, vermelho e azul, provenientes da decomposição da luz branca 
solar 2. Logo, reflete o verde e assim obtém sua coloração característica. Elas estão 
presentes nos cloroplastos, organelas que se encontram em células de plantas e outros 
eucariotas fotossintéticos, sendo o local onde efetivamente ocorre a fotossíntese 3. 
Entretanto, é errôneo o pensamento de que existe apenas um tipo de clorofila. Elas são 
moléculas formadas por complexos derivados da porfirina, tendo como átomo central o Mg 
(magnésio). É uma estrutura macrocíclica assimétrica insaturada constituída por quatro anéis 
de pirrol. Existem quatro tipos principais do pigmento, denominados por A, B, C e D, que 
contribuem no processo fotossintético de formas distintas. As clorofilas A e B encontram-se 
na natureza numa proporção de 3:1, respectivamente, e diferem nos substituintes de carbono 
C-3. Na clorofila A, o anel de porfirina contém um grupo metil (-CH3) no C-3, enquanto a 
B contém um grupo aldeído (-CHO), que substitui o grupo metil. Ela é sintetizada através da 
oxidação do grupo metil da clorofila A para um grupo aldeído, diferenciando-as – além disso, 
se encontram em praticamente todos os indivíduos fotossintetizantes, com diferença apenas 
na quantidade de cada. Já as clorofilas C e D são as menos abundantes, estando presentes 
respectivamente em diatomáceas e algas vermelhas 2. Devido à dominância numérica do 
tipo A, os restantes são considerados pigmentos fotossintéticos acessórios, juntamente com 
os carotenoides. 
Os carotenoides são um grande grupo de pigmentos presentes na natureza, com mais de 
600 estruturas caracterizadas, identificados em organismos fotossintetizantes e não 
fotossintetizantes, plantas superiores, algas, fungos, bactérias e em alguns animais. 
Entretanto, é no reino Plantae que há a maior presença dos compostos em foco, sendo 
responsáveis pela coloração amarelada e avermelhada de frutos como morango, cenoura e 
maracujá. Contribuem com a fotossíntese sendo pimentos acessórios que captam a luz solar. 
Além disso, formam misturas de a e b-carotenos, b-criptoxantina, luteína, zeaxantina, 
Equação 1 – Processo fotossintético 
violaxantina e neoxantina, sendo importantes precursores da vitamina A, crucial para o a 
saúde da visão animal 4. 
Por se tratarem de pigmentos, por meio de experimentos cromatográficos pode-se realizar a 
análise da presença de diferentes tipos de clorofilas e carotenoides em amostras de vegetais, 
utilizando-se técnicas de cromatografia como camada delgada e coluna. 
2. Objetivos 
A prática ocorreu de forma a realizar análises cromatográficas de uma mesma amostra de 
agrião utilizando técnicas distintas (cromatografia em camada delgada e em coluna), 
separando e identificando os constituintes de seus pigmentos. 
3. Materiais e Reagentes 
3.1 Materiais 
• Algodão 
• Bastão de vidro 
• Bomba de vácuo 
• Bureta (50 mL) 
• Capilar 
• Espátula metálica 
• Funil de vidro 
• Garra 
• 2 Gral 
• Lápis 
• Lamínula (cromatoplaca) 
• 4 Pipetas de Pasteur 
• 3 Placas de Petri 
• Pote de vidro com tampa (cuba cromatográfica) 
• 2 Provetas (5 mL) 
• Proveta de (25 mL) 
• 2 Pistilo 
• Suporte universal 
 
3.2 Reagentes 
• Acetona (CH3COCH3); 
• Diclorometano (CH2Cl2); 
• Folha de agrião. 
• Hexano (C6H14); 
• Sílica (SiO2); 
 
3.3 EPI’s e EPC’s 
• Jaleco 
• Luvas de látex 
• Capela de exaustão 
4. Metodologia 
 
4.1 Cromatografia em camada delgada 
 
Para realizar a cromatografia em camada delgada, iniciou-se com a preparação do extrato 
de agrião, triturando-o com acetona em um gral com pistilo. Em seguida, uma placa de 
cromatografia foi marcada cuidadosamente nas laterais para evitar danificar a sílica, 
deixando 2 cm da base e 1,5 cm do topo. Na cuba cromatográfica, misturou-se 
diclorometano e acetona, inseriu-se um papel e agitou-se o conjunto. Duas séries de 
aplicações foram feitas na placa de cromatografia, uma à esquerda com seis pontos e outra 
à direita com dezesseis. A placa foi então colocada na cuba e deixou-se a fase móvel eluir 
até a linha final. Após alcançar essa linha, a placa foi removida e deixada para secar na 
capela, aguardando a observação dos resultados. 
 
4.2 Cromatografia em coluna 
 
Na cromatografia em coluna, uma bureta de 50 mL foi preparada com algodão no fundo e 
um funil acoplado. A Sílica foi adicionada à bureta até a marca de 4 cm com o auxílio de 
uma espátula. Depois a silica foi transferida para um béquer de 250 mL e coberta com 
hexano, agitando-se com um bastão de vidro. O funil foi recolocado na bureta, seguida pela 
adição do extrato de agrião misturado com sílica. Uma placa de Petri foi posicionada sob a 
bureta para coletar as frações durante a cromatografia, que foi repetida três vezes, e 
trocando-se as placas quando havia mudança de cor na amostra. Finalmente, os resultados 
foram avaliados. 
5. Resultados e discussão 
 
5.1 Estudo dos pigmentos do agrião e qual a melhor condição de amostragem 
para separa-los e identificá-los por CCD. 
 
 
Figura 1: Moléculas de clorofila a e b. 
 
Figura 2: Moléculas de carotenos e xantofilas. 
 
Os carotenos são pigmentos hidrocarbonetos e, portanto, são substâncias apolares. Já as 
xantofilas contêm grupos oxigenados, como hidroxilas ou cetonas, que aumentam sua 
polaridade. Isso faz com que as xantofilas tenham maior afinidade com solventes polares em 
comparação aos carotenos. No caso das clorofilas, a clorofila a possui um grupo metil 
enquanto a clorofila b possui um grupo aldeído, o que torna a clorofila b ligeiramente mais 
polar que a clorofila a. 5 
A quantidade de amostra aplicada na cromatografia influencia diretamente a qualidade do 
cromatograma. Aplicações insuficientes podem não revelar todos os componentes, enquanto 
aplicações excessivas podem levar a manchas sobrepostas e indistintas. A escolha da 
melhor aplicação é aquela que proporciona manchas bem definidas e separadas, permitindo 
uma análise clara dos componentes presentes na amostra, que foi que ocorreu na prática 
realizada, tendo em vista que pôde-se identificar diferentes pigmentações na cromatografia 
feita, como mostra imagem abaixo: 
Figura 3: Resultados obtidos na CCD. 
 
A fase móvel utilizada diclorometano;acetona apresenta polaridade baixa, então entende-se 
que as manchas verde claras se tratam da clorofila b, já que é mais polar e possui mais 
afinidade com a fase estacionária, sofrendo menos eluição. Já as manchas de coloração 
verde-amarelado se tratam da clorofila a que é menos polar e, por isso, tem menos afinidade 
com a fase estacionária. Entende se que a as manchas de coloração amareladasão 
xantofilas e as manchas de coloração amarelo acobreado são carotenos. Isso se explica 
porque os carotenos são menos polares e possuem maior semelhança com a polaridade da 
fase móvel, portanto eluem mais. 
Realizar aplicações com diferentes quantidades é uma prática comum para otimizar a 
visualização dos componentes. Isso é especialmente útil quando se desconhece a 
concentração dos componentes na amostra. A técnica permite identificar a quantidade ideal 
que resulta em um cromatograma com boa resolução e separação das substâncias. 
A identificação dos componentes no cromatograma é feita comparando a distância percorrida 
pelas substâncias (fator de retenção, Rf) com valores de referência conhecidos. Substâncias 
com menor polaridade, como os carotenos, tendem a migrar mais distante do ponto de 
origem do que substâncias mais polares, como as xantofilas e clorofilas. 
Em um sistema de fase reversa, a fase estacionária é apolar e a fase móvel é polar. Isso 
inverte as interações de polaridade usuais, fazendo com que compostos apolares sejam 
retidos por mais tempo na fase estacionária. Se o experimento fosse realizado em fase 
reversa, os carotenos seriam retidos por mais tempo, enquanto as xantofilas e clorofilas 
seriam eluídas mais rapidamente. 6 
A acetona é escolhida como solvente extrator por sua capacidade de dissolver uma ampla 
gama de compostos orgânicos e por sua alta volatilidade, o que facilita a evaporação rápida e 
a secagem das amostras. Além disso, a acetona miscibiliza-se bem com a água, permitindo a 
extração de compostos presentes em matrizes aquosas. 
As manchas de coloração alterada (cinzas ou marrons) podem ser resultado de processos de 
oxidação ou degradação dos pigmentos, especialmente quando expostos ao ar ou à luz. 
Esses processos podem levar à formação de compostos de degradação que apresentam 
cores diferentes das originais. 
A ativação da cromatoplaca, geralmente realizada aquecendo-a para remover a umidade, 
aumenta a adesão dos compostos à fase estacionária. Se a cromatoplaca não fosse ativada, 
a separação dos componentes poderia ser menos eficiente, resultando em um cromatograma 
com menor resolução e possíveis sobreposições de manchas. 
 
5.2 Estudo dos pigmentos do agrião por CC. 
 
Na eluição ascendente, a fase móvel (FM) sobe pela fase estacionária (FE) devido à 
capilaridade, comum na Cromatografia em Papel (CP) e Cromatografia em Camada Delgada 
(CCD). 
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
Na eluição descendente, a FM flui para baixo pela gravidade, como no procedimento 
descrito. A principal diferença é a direção do fluxo da FM, que pode influenciar a velocidade 
de separação e a resolução das substâncias. 
A pressurização da FE na cromatografia, especialmente em métodos como a Cromatografia 
Líquida de Alta Eficiência (CLAE), aumenta a interação entre as substâncias e a FE, 
melhorando a separação. Com a pressurização, espera-se que o fluxo da FM seja mais 
rápido, pois a pressão ajuda a empurrar a FM através da FE. Se a FM for pressurizada 
durante a eluição, espera-se uma separação mais rápida dos compostos. No entanto, isso 
pode reduzir a resolução entre compostos com tempos de retenção semelhantes, pois há 
menos tempo para a interação diferencial com a FE.7 
Na cromatografia em coluna (CC), o anteparo de algodão é essencial para evitar que a fase 
estacionária (FE) seca escape da coluna e para distribuir uniformemente a fase móvel (FM) 
sobre a FE. A mistura da FE seca com a FM e o retorno à coluna é uma técnica para ajudar 
na adesão da amostra à FE, promovendo uma separação mais eficiente. 
O algodão inserido sobre a amostra serve para protegê-la de perturbações quando novas 
porções de FM são adicionadas à coluna. As duas formas de preparo de amostras para CC 
são a adsorção e a partição. A alteração da FM durante a CC está relacionada com as 
técnicas de eluição gradiente, onde a composição da FM muda gradualmente, e eluição 
isocrática, onde a composição da FM permanece constante durante todo o processo. 8 
 
Figura 4: Resultados obtidos na CC. 
 
Analisando os resultados das técnicas de Cromatografia em Coluna (CC) e Cromatografia em 
Camada Delgada (CCD), notamos pontos em comum e discrepâncias. Na CCD, a clorofila b, 
de cor verde, foi a que menos se moveu, seguida pela clorofila a, xantofila e, finalmente, o 
caroteno, que se moveu mais. Por outro lado, na CC, o primeiro pigmento a ser eluído foi o 
caroteno, de cor alaranjada, depois as clorofilas a e b, numa mistura verde, e, por fim, um 
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
https://bing.com/search?q=elui%c3%a7%c3%a3o+descendente+versus+ascendente+em+cromatografia
pigmento amarelo intenso, identificado como xantofila. Assim, ao contrário da CCD, onde as 
clorofilas a e b tinham menor afinidade pela fase móvel, na CC, as xantofilas foram as que 
apresentaram menor afinidade, sendo as últimas a serem eluídas. Isso sugere que as 
xantofilas obtidas na CC podem diferir das separadas na CCD. 
A polaridade das substâncias nos recipientes pode ser inferida pela ordem em que foram 
coletadas: substâncias menos polares eluem primeiro e são coletadas nos primeiros 
recipientes. A inserção gradual de hexano no início da CC é para evitar a perturbação da FE 
e garantir uma eluição uniforme. 
Para uma mistura de substâncias incolores, o critério de troca dos recipientes de coleta 
poderia ser baseado no tempo de retenção ou na detecção por um instrumento adequado, 
como um detector de UV. As substâncias que podem permanecer na FE após o término do 
experimento são aquelas que têm forte interação com a FE e não foram completamente 
eluídas. 9 
A comparação dos resultados entre diferentes aulas de cromatografia com amostras 
idênticas deve considerar a eficiência da separação, a resolução entre os picos e a 
reprodutibilidade dos resultados. Se as condições experimentais forem consistentes, espera-
se que os resultados sejam semelhantes. No entanto, variações podem ocorrer devido a 
diferenças na preparação da coluna, na qualidade da FE, na precisão da adição da FM, entre 
outros fatores. 
 
 
6. Conclusão 
Com o fim dos procedimentos experimentais e a partir das análises dos resultados, observou-
se a presença de diferentes tipos de clorofila (principalmente A e B) na amostra de agrião, 
observadas nas múltiplas colorações de verde obtidas com as cromatografias. Além disso, 
houve a constatação de ocorrência de carotenoides no vegetal devido à mancha amarelada 
obtida na cromatoplaca. O fato demostra que, mesmo imperceptíveis na amostra bruta (já 
que as folhas de agrião são totalmente verdes), os carotenoides podem estar presentes na 
composição dos vegetais de forma considerável. Além disso, uma possibilidade levantada 
seria a degradação de parte da clorofila, que apresentou dificuldades em sua completa 
eluição no experimento de cromatografia em coluna, o que era inesperado. 
REFERÊNCIAS 
1 Moreira, C. (2013), Revista de Ciência Elementar, 1(01):0003. Disponível em: 
> Acesso em: 13 de abr.de 2024; 
 
2 Streit, N.M. et al. As Clorofilas. Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), 2005. Disponível em: 
 Acesso em: 13 de abr. de 2024; 
 
3 Moreira, C., (2015) Cloroplasto, Rev. Ciência Elem., V3(3):161. Disponível em: 
 Acesso em: 13 de abr. de 2024; 
 
4 Uenojo, M. et al. Carotenóides: propriedades, aplicações e biotransformação para formação de 
compostos de aroma. Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, 2007. Disponível em: 
. Acesso em: 13 abr. 2024. 
 
7 MOGOLLÓN, N. G. S. et al. State of the art two-dimensional liquid chromatography: 
Fundamental concepts, instrumentation, and applications. Quimica nova, v. 37, n. 10, p. 
1680–1691, 2014 
 
8 Disponível em: . Acesso em: 13 abr. 2024 
 
9 Costa, S.M.O. e Menezes, J.E.S. Química Orgânica I – 2ª Edição. Fortaleza, Ceará, 2015. 
Disponível em: 
 
Acesso em: 13 de abril de 2024; 
https://www.fc.up.pt/pessoas/jfgomes/pdf/vol_1_num_1_03_art_fotossintese.pdf)
https://www.scielo.br/j/cr/a/dWwJymDzZRFwHhchRTpvbqK/
https://rce.casadasciencias.org/rceapp/art/2015/161/
https://www.scielo.br/j/qn/a/7R78BnnsV5mNPsCjk938LbH/
file:///C:/Users/Teste/Downloads/Livro_Química%20Orgânica%20I%20(1).pdf)
	Estudo dos pigmentos do agrião
	1. Introdução
	4. Metodologia
	5. Resultados e discussão
	5.1 Estudo dos pigmentos do agrião e qual a melhor condição de amostragem para separa-los e identificá-los por CCD.
	Figura 1: Moléculas de clorofila a e b.
	5.2 Estudo dos pigmentos do agrião por CC.
	6. Conclusão
	REFERÊNCIAS
	4 Uenojo, M. et al. Carotenóides: propriedades, aplicações e biotransformação para formação de compostos de aroma. Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, 2007. Disponível em: