Prévia do material em texto

Artigo 
CONTAGEM E CARACTERIZAÇÃO DE MICRORGANISMOS NUMA 
AMOSTRA DE SOLO 
 
Catarina Lucas (a21705304)1*, Eva Matos (a21701738)1**, Laurinda Simões (a21700274) 
1*** 
 
1 Universidade Lusófona de Humanidade e Tecnologias (ULHT), Campo Grande n. 376, 1749-
024 Lisboa, Portugal 
* e-mail: catarinalucasosl@hotmail.com 
** e-mail: eva.matos@sapo.pt 
*** e-mail: laurindamariasimoes@gmail.com 
 
 
Recebido: 12 Abril 2018; Docente: Elisabete Muchagato Maurício; Unidade Curricular: Microbiology 
 
 
 
 
 
Abstract: The development of this study had the objective of observing and quantifying the 
microbial variety, bacteria and fungi, present in collected soil samples, by exploring techniques 
and basic concepts in microbiology. The samples provided were taken from garden soil, of the 
Lusophone University of Humanities and Technologies (ULHT), and the techniques were 
performed in the laboratories available on the same institution. Appropriate nutritional 
environments (PCA and Sabouraud) and temperature, were created and dilutions were produced 
through the pasteurized and unpasteurized soil samples. 
The colonies were counted using Colony Forming Units - UFC / gr method, FDA's 
Bacteriological Analytical Manual Center for Food[1], for the characterization of several 
cultures. Gram staining techniques were used for the morphological characterization of the 
microorganisms found, and the structural staining of the endospores was carried out using Green 
Malachite dye, and their motility was subsequently studied using Manitol Nitrate Mobility 
(MNM). From this study it was possible to assess the microbial diversity of soil samples, their 
structural and morphological characteristics, and to experience several basic techniques used in 
microbiology analyzes. 
 
 
Keywords: Microorganisms; soil sample; PCA; Sabouraud; LB; staining of gram; endospores. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 – Introdução 
Sendo a Microbiologia uma ciência 
relativamente recente, dado que apenas foi 
reconhecida como tal devido às importantes 
experiências de Louis Pasteur (1822-1895) e 
Robert Koch (1843-1910), é hoje, no entanto, 
uma vasta área de saber que está em constante 
evolução, contribuindo para grandes avanços em 
diversas áreas, como por exemplo, na Medicina, 
na medida em que são agentes de doenças e 
produtores de antibióticos, na indústria 
alimentar, visto que contribuem na produção de 
bebidas, queijos, conservas, como também na 
Agricultura, e das mais diversas áreas de 
investigação. A sua origem teve início no 
momento em que começou a ser possível a 
observação de seres que não seria possível a sua 
observação a olho nu sem o auxilio de 
instrumentos de ampliação – os microscópios. 
[3] 
Globalmente, a importância dos micróbios 
advém, não só das reações metabólicas que 
levam a cabo e do conjunto de interações – 
benéficas ou nocivas – que estabelecem com os 
outros seres vivos, mas também pela sua vasta 
exorbitância representando individualmente 
cerca de dois terços de toda a matéria viva 
existente na Terra. [2] 
A vastidão do mundo microbiano inclui 
bactérias, microalgas, fungos e parasitas, 
nomeadamente protozoários, mas também vírus, 
uma vez que estes não possuem células, apesar 
de precisarem delas para se replicarem, 
constituindo um grupo à parte dos seres vivos. 
[2] 
Tanto o Homem como os outros seres vivos 
superiores, animais ou plantas, são suscetíveis de 
serem colonizados por estes microrganismos, 
adquirindo eles especificidades biológicas 
próprias, de acordo com os hospedeiros ou com 
os ecossistemas da sua preferência. Devido ao 
enorme avanço do conhecimento científico, os 
microrganismos são hoje estudados em diversas 
áreas científicas tais como: Bacteriologia (estudo 
das bactérias e o seu desenvolvimento), 
Micologia (estudo dos fungos existentes na 
Natureza e a sua interação com o Homem e o 
ambiente), Ficologia ou Algologia (estudo das 
algas existentes em águas doces e marinhas) e a 
Virologia (estudo dos vírus). [2][3] 
Os microrganismos têm disponíveis diversas 
fontes de energia que utilizam consoante as 
propriedades e caracteristicas do seu grupo. 
Podem ser classificados, principalmente, em 
autotróficos, produzindo o seu próprio nutriente 
de fontes simples de carbono, ou heterotróficos, 
utilizando móleculas já existentes. Podem ainda 
ser designados de unicelulares, se forem 
constituidos apenas por uma única célula, como 
é o caso das bactérias, microalgas, fungos e 
protozoários, como multicelulares, se forem 
constituídos por mais do que uma célula e ainda, 
procariotas e eucariotas, dependendo da sua 
complexidade estrutural, sendo mais simples ou 
mais complexos, respetivamente. 
A distribuição dos micróbios no planeta é 
universal. Encontram-se nos solos, nas águas 
superficiais e profundas, na atmosfera e habitam 
as camadas superficiais e muscosas interiores de 
todos os seres vivos, incluindo o Homem, 
fazendo parte da flora normal dos seres vivos. [2] 
Em Microbiologia, quando se refere a ocorrência 
de crescimento microbiano tal é entendido não 
na prespetiva de uma célula individual, mas de 
uma população celular, ou seja, é definido pelo 
aumento do número de indivívuos de uma 
população e não pelo aumento do tamanho de 
uma célula individual. A determinação do 
número de células pode ser obtida por: Métodos 
diretos, de contagem ao microscópio ou em 
cantadores eletrónicos, ou Métodos indiretos, de 
contagem de células viáveis. [2] 
O crescimento é um processo dinâmico que 
requer energia e nutrientes para a síntese de 
componentes e manutenção celular. A maior 
parte dos estudos microbiológicos dependem da 
capacidade de cultivar e manter os 
microrganismos no laboratório, e para que isso 
suceda, as preparações nutrivas utilizadas para o 
crescimento dos microrganismos são designadas 
de meios de cultura e dependem da espécie de 
miscorganismo que pretende cultivar, uma vez 
que diferentes microrganismos podem 
apresentar grandes diferenças quanto às 
exigências nutricionais, de modo que, são 
também utilizados no isolamento e manutenção 
de culturas puras, bem como na identificaçao de 
microrganismos de acordo com as suas 
características fisiológicas e bioquímicas. Uma 
vez que existe a probabilidade de duas células 
muito próxmias ou de agregados de células 
poderem originar apenas uma colónia, a 
contagem é expressa em unidades formadoras de 
colónias (UFC) e é feita a partir de métodos 
indiretos em placa, no presente trabalho, foi 
utilizado o método por espalhamento e o método 
por incorporação. [2] 
Figura 2 - Balança 
Figura 3 - Banho de água 
Figura 1 – Bico de 
Bunsen 
Figura 4 – Autoclave Figura 5 - Microscópio 
Figura 6 - Estufa 
Após o isolamento de um microrganismo, 
interessa proceder à sua caracterização, pelo que 
se sucede à coloração de Gram, uma técnica que 
irá caracterizar dois grupos de reação à 
coloração, como é o caso das bactérias Gram-
positivo e Gram-negativo, o que, associado à 
morfologia, permite a orientação a seguir com 
vista à identificação .[2] 
 
2 – Materiais e Métodos 
 
2.1 Métodos 
 
Os processos de esterilização e desinfeção 
permitem o controlo do desenvolvimento dos 
microrganismos. São métodos essenciais no 
tratamento e prevenção de infeções e na 
prevenção da contaminação de culturas 
microbianas puras. [2] 
A seleção do método adequado depende, além da 
natureza do próprio agente, do tipo de material 
contaminado a tratar. No presente estudo foi 
utilizado o método por calor húmido, que pode 
ser obtido em autoclaves, aparelhos especiais de 
esterilização, que tem de estar a 1,2 atmosferas, 
a 121ºC durante 15 minutos. Esta combinação de 
temperatura e tempo cria as condições 
necessárias para a eliminação de uma população 
de 106 esporos de Geobacillus 
stearotermophilus, que são as formas 
microbianas que apresentam a maior capacidade 
de resistência. [2] Durante 
todo o processo foram 
respeitadas as condições de 
segurança, trabalhando 
sempreem condições de 
assepsia, utilizando como 
desinfetante o calor do bico 
de Bunsen, e lavando com 
álcool todos os matérias 
utilizados, assim como as 
bancadas de trabalho. 
 
2.2 Equipamentos utilizados 
Para a realização das várias técnicas foram 
utilizados os seguintes equipamentos: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.3 Amostras 
 
A amostra utilizada foi retirada do solo do jardim 
da Universidade Lusófona de Humanidade e 
Tecnologias (ULHT) fornecida pela docente. 
 
2.4 Microorganismos utilizados: 
 
Foram utilizadas culturas puras previamente 
isoladas de: 
- Bacillus subtilis 
- Escherichia coli 
 
2.5 Meios de Cultura 
 
Os meios de cultura utilizados foram: 
- Nutriente Agar (WL) 
- Sabouraud Dextrose Agar (Sabouraud) 
 
2.6 Reagentes: 
 
Para a coloração das bactérias Gram-positivo e 
Gram-negativo foram utilizados os seguintes 
reagentes: 
 
- Violeta de cristal 
- Lugol 
- Álcool 
- Safranina 
- Verde malaquite 
Figura 6 - Preparação do 
meio de cultura Nutriente 
Agar após estrelização no 
Autoclave 
3 – Procedimento 
 
3.1 Preparação dos meios de cultura 
Para se cultivar com sucesso um determinado 
microrganismo é necessário compreender as 
suas necessidades nutricionais e depois fornecer 
esses nutrientes na forma e proporção correta no 
meio de cultura. Preparou-se dois meios de 
cultura: um meio universal sólido, o nutriente 
agar, que tem como finalidade a inoculação e 
manutenção de bactérias, e um meio seletivo 
sólido, o Sabouraud, suplementado com 
cloranfenicol, antibiótico que impede a 
proliferação de células bacterianas, promovendo 
o desenvolvimento individual de fungos e 
leveduras. [4] Entende-se por meio universal 
aquele que permite o crescimento bacteriano em 
geral, sem satisfazer contudo, nenhuma 
exigência em especial, e de meio seletivo os que 
contém substâncias que inibem o 
desenvolvimento de determinados grupos de 
microrganismos, permitindo o crescimento de 
outros. Relativamente ao processo prático, para 
preparar o meio de cultura universal: pesou-se 
15,44 gramas de Nutriente Agar que após ser 
pesado, foi colocado num Erlenmeyer de 500 ml, 
juntando pouco a pouco, 200 ml de água 
destilada. Para preparar o meio seletivo: pesou-
se 19,65 gramas de Sabouraud que após ser 
pesado, foi colocado num Erlenmeyer de 500 ml 
juntando pouco a pouco, 300 ml de água 
destilada. O meio sólido difere do meio líquido 
uma vez que o primeiro é acrescentado Agar, 
polímero sulfatado complexo de unidades de 
galactose, cuja função será fornecer nutrientes ao 
meio de cultura. [5] De seguida, preparou-se 
uma rolha para o Erlenmeyer, utilizando algodão 
enrolado sobre si mesmo e uma gaze para 
envolver e fechar a rocha. No fim utilizou-se 
ainda, papel de alumínio com a finalidade de 
proteger a rolha da humidade. Antes de ir para o 
autoclave, foi identificado de modo a que 
houvesse a certificação do bom funcionamento 
de esterilização. No autoclave, permaneceu 
durante 15 minutos, a 121ºC a pressão 1,2 
atmosferas. Uma vez que não é dissolvido à 
temperatura ambiente, colou-se dentro do banho 
de água para que atingisse a temperatura de 60ºC 
de modo a que pudesse ser vertido para as 
respetivas placas de Petri, solidificando atingido 
a temperatura média de 40ºC. Em condições de 
assepsia, colocou-se em cada placa de Petri 20 
mL do volume total de cada meio de cultura. De 
modo a que, o vapor de água não contaminasse 
as amostras, colocou-se as caixas do avesso. 
 
 
 
 
 
3.2 Preparação de uma suspensão não 
pasteurizada e pasteurizada 
Os microrganismos do solo caracterizam-se por 
serem diversificados e abundantes, fator que 
contribui para que as avaliações quantitativas da 
micro população do solo sejam difíceis e 
limitadas. A sua ocorrência depende do tipo de 
solo, profundidade, temperatura, regime hídrico 
e outros fatores ambientais. Incluem bactérias, 
protozoários e algas. [2] 
Primeiramente e em condições de assepsia, 
pesou-se, aproximadamente, 1g de Terra para 
um tubo estéril. Foi pipetado 10ml de água 
igualmente estéril. De seguida, utilizou-se o 
método das diluições, para que o número de 
colónias fosse minimamente contável, uma vez 
que, como já referido anteriormente, o solo está 
abundantemente coberto de microrganismos. 
Procedeu-se à preparação da solução-mãe que 
foi sujeita a uma pasteurização de 80ºC durante 
10 minutos em banho de água e outra que não foi 
sujeita a este tratamento. A Pasteurização é um 
processo de aquecimento entre 60ºC-90ºC cujo 
objetivo será reduzir logaritmicamente um 
número de organismos viáveis. O nome deriva 
do seu criador Louis Pasteur. [6] 
Com as diluições mãe preparadas (pasteurizada 
e não pasteurizada) efetuou-se diluições até 106 
para que seja feita a quantificação de 
microrganismos em meio sólido. 
Figura 7 - Rolha de 
algodão 
Figura 8 - Técnica das diluições seriadas 
Após as diluições preparadas, foram pipetados 
100 µl para caixas de Petri de meio de cultura 
universal e meio de cultura seletivo. Para que 
posteriormente, seja feita a contagem dos 
microrganismos, foi feita a inoculação através da 
técnica de espalhamento em placa à superfície, 
para o crescimento de microrganismos aeróbios, 
isto é, que necessitam de oxigénio para crescer, 
e a técnica de incorporação que visa o 
crescimento de microrganismos tanto aeróbios 
como anaeróbios, ou seja, que crescem com a 
ausência ou não de O2. 
Nesta última foi pipetado 1ml de cada fator de 
diluição e depois verteu-se, aproximadamente, 
20ml de meio de cultura universal (meio 
liquefeito), de modo a que os microrganismos 
fiquem submersos pelo meio de cultura, para que 
haja crescimento superficialmente (aeróbios) e 
no seu interior (anaeróbios). Por fim, procedeu-
se à incubação das placas em estufa em que as 
bactérias foram incubadas a 30ºC durante 72 
horas e os fungos filamentosos e leveduras a 
25ºC durante 5 a 7 dias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.3 Contagem e caracterização macroscópica 
das colónias obtidas 
Após os dias necessários ao crescimento das 
bactérias, fungos e leveduras, procedeu-se à 
caracterização macroscópica dos 
microrganismos e à calculação das ufc/g de solo 
pasteurizado e não pasteurizado. 
Relativamente à sua caracterização 
macroscópica verificandou-se os seguintes 
resultados: Para o meio de cultura universal não 
pasteurizado, verificou-se que no fator de 
diluição 10-1 seria impossível a sua 
caracterização, uma vez que apresentavam-se 
em grande número. Para o fator 10-2 apresentava 
cinco colónias com caracteristicas diferentes, 
nomeadamente: 
- Superfície lisa, opaca, brilho ceroso, 
pigmentação verde, forma circular, margem 
inteira e elevação elevada 
- Superfície rugosa, opaca, brilho ceroso, 
pigmentação verde, forma rizoide, margem 
ondulada e elevação achatada 
- Superfície pulverulenta, opaca, brilho baço, 
pigmentação amarela, forma e margem 
filamentosa, e elevação convexa 
- Superfície pulverulenta, opaca, brilho baço, 
pigmentação branca, forma e margem 
filamentosa e elevação elevada 
- Superfície rugosa, opaca, brilho ceroso, 
pigmentação verde, forma rizoide, margem 
ondulada e elevação achatada 
Para o fator 10-3, verifou-se a existência de 3 
tipos de colónias: 
- Superficie lisa, opaca, brilho ceroso, 
pigmentação verde, forma circular, margem 
inteira e elevação achatada. 
- Superficie pulverulenta, opaca, brilho baço, 
pigmentação branca, forma filamentosa, 
margem inteira e elevação elevada 
- Superficie lisa, opaca, brilho ceroso, 
pigmentação verde, forma circular, margem 
inteira e elevação umbiculada. 
Analogamente ao meio de cultura seletivo não 
pasteurizado para o fator de diluição 10-1, a sua 
caracterização foi igualmente impossível, devido 
ao grande número de colónias existentes. Para o 
fator 10-2 o meio de cultura apresentou tipos de 
colonias com caracteristicas que diferem apenas 
na sua pigmentação, nomeadamente: 
- Superficie pulverulenta, opaca, brilho baço, 
pigmentação amarela/branca/verde, forma 
filamentosa, margem dentada e elevaçãoelevada. Já para o fator de diluição 10-3, 
observou-se apenas uma cólonia com as 
seguintes caracteristicas: superficie 
pulverulenta, opaca, brilho baço, pigmentação 
branco/verde, forma filamentosa, margem 
inteira e elevação elevada. 
Para o isolamento das colónias foram utilizadas 
as técnicas de estriação em placa e a técnica de 
isolamento de fungos filamentosos e bolores, 
ambas consistem na obtenção de culturas puras. 
Figura 9 - Diluições a partir da 
solução-mãe 
Figura 10 - Técnina de 
espalhamento em placa 
à superfície [5] 
Figura 11 - Técnica de incorporação [5] 
Figura 14 - Culturas puras 
pela técnica de estriação em 
placa 
Figura 15 - cultura pura pela 
técnica de isolamento de 
fungos filamentosos ou 
bolores 
 
Para o isalamento por estriação foi utilizado o 
meio universal, cujo objetivo foi retirar com uma 
alça de platina uma amostra das bactérias para 
que, por estriamento destas fosse possível a sua 
expansão e consequentemente o seu isolamento, 
uma vez que ao longo da placa o seu estriamento 
foi sendo cada vez menor, possibilitando a 
análise da cultura pura. Para o isolamento de 
fungos, foi utilizado o meio seletivo, uma vez 
que, como explicado anteriormente, continha um 
antibiótico incorporado para que inibisse o 
crescimento de bactérias. Nesta técnica, cortou-
se um pedaço de nutriente Agar, com o auxilio 
de duas lancetas, onde o fungo pretendido estaria 
inserido, individualizando-o noutro meio de 
cultura para procedesse ao seu crescimento puro. 
 
3.4 Obtenção de cultras puras e 
caracterização morfológica de 
microrganismos 
 
Observou-se o resultado das técnicas referidas 
anteriormente, nomeadamente, a técnica de 
estriação em placa à superficie e a técnica de 
isolamento de fungos filamentosos e bolores, 
verificando-se a existência de culturas puras em 
ambos os resultados. A partir dessa mesmas 
culturas procedeu-se à sua conservação 
repicando com uma ança os microrganismos 
para tubos contendo um meio de manutenção. 
Depois de realizar o processo icubar os tubos a 
30ºC durante 48 horas para bactérias, e a 25ºC 
durante 5 dias para os fungos. Para que a 
conservação seja aproximadamente 1 mês, 
guardar no frigorifico, se for definitiva, 
conservar a -80ºC com 15% de glicerol. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Por fim efetuou-se a coloração de Gram para a 
cultura pura obtida e para duas fornecidas pela 
docente, nomeadamente, Bacillus sp e 
Escherichia coli. A coloração Gram permite 
distinguir entre bactérias Gram-positivas e 
Gram-negativas com base na coloração 
diferencial com um complexo de violeta de 
cristal-iodo e uma contra corante de safranina. 
As paredes celulares de organismos Gram-
positivos retêm este complexo após o tratamento 
com álcool e apresentam-se com a cor violeta, 
enquanto os organismos gram-negativos 
descoloram após o tratamento violeta cristal e 
Figura 12 - Colónias em meio de cultura 
universal não pasteurizado (Azul) e seletivo 
não pasteurizado (Rosa) com fatores de 
diluição de 10-1 a 10-3e meios de cultura por 
incorporação 10-1 e 10-2 
Figura 13 - Técnica de estriação em placa [1][5] 
Figura 16 - Culturas puras em meio de 
manutenção/conservação 
apresentam-se de coloração vermelha, uma vez 
que foi usada a sefranina. O método é útil para 
avaliar a contaminação bacteriana de amostras 
de cultura de tecidos ou para examinar o estado 
de coloração de Gram e características 
morfológicas de bactérias isoladas de culturas 
bacterianas misturadas ou isoladas. [7] O que 
permite diferenciar as bactérias em relação à 
coloração Gram é a parede celular, uma vez que, 
as bactérias Gram-positivo apresentam uma 
parede celular predominantemente constituída 
por peptidoglicano, macromolécula típica dos 
procariotas. Enquanto as bactérias Gram-
negativo têm uma parede celular mais complexa, 
distinguindo-se da das bactérias Gram-positivo, 
por possuirem elevado teor em lípidos e menor 
quantidade de peptidoglicano.[2] Durante o 
processo de coloração foram utilizadas quatro 
lâminas, três foram coradas com violeta cristal 
durante 1 minuto, de seguida, fixou-se o corante 
com lugol durante 1 minuto, após a fixação, 
utizou-se alcool por duas vezes e por fim a 
safranina durante 60 segundos. A última foi 
corada com verde malaquite. Os endosporors, 
estruturas formadas no interior de células 
bacterianas, são extremamente resistentes à 
desidratação, altas temperaturas, radiação 
ionizante, e penetração de substâncias químicas. 
Células que não os possuam designam-se células 
vegetativas, como o Bacillus subtilis. Fixou-se 
as amostras pelo calor, uma vez que o calor mata 
as células para que o corante penetre, e fixa-as 
para que não sejam arrastadas pelos líquidos 
durante o processo de coloração. Após a fixação 
da amostra, cubriu-se o esfreganço com verde 
malaquite e aqueceu-se à chama levemente. 
Após arrefecer, corar com a safranina para que 
haja um contraste entre o endosporo (coloração 
verde) e as células vegetativas (vermelho). De 
seguida lavou-se com àgua corrente deixando 
secar por cerca de 5 minutos. Após concluidos os 
processos, observou-se ao microscópio. [8][9] 
 
 
Figura 18 - Imagem microscópica 10x1000 de bactérias 
Gram-negativas (E. coli) 
 
Figura 19 – Imagem microscópica 10x1000 de bactérias 
Gram-positivas (Bacillus Subtilis) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.5 Estudo da motilidade/mobilidade 
bacteriana 
Para estudar a motilidade bacteriana, foi 
realizada a inoculação por picada (com uma 
ança) das culturas puras obtidas em meio 
Manitol Nitrate Mobility, cujo objetivo será 
diferenciar bactérias com base na sua motilidade, 
capacidade de fermentar o manitol e ainda de 
reduzir o nitrato. A natureza semi-sólida do meio 
devido ao agar a 0,35% ajuda a detectar a 
Figura 17 - Imagem microscópica 10x1000 
da cultura Bacillus subtilis após a 
coloração de endosporos bacterianos 
Figura 20 - Coloração Gram [9] 
motilidade. As bactérias móveis produzem 
crescimento difuso em todo o meio, enquanto as 
bactérias não móveis crescem apenas ao longo 
da linha de inoculação. [6] Após a inoculação, 
incubar a 30ºC durante 48 horas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 – Resultados 
 
Tabela 1 - Resultados da contagem macroscópica das 
colónias obtidas 
 
 
Tabela 2 - Resultados da contagem sob a fórmula 
UFC=(nºtotal de colónias/(volume do inóculo)*(Fator de 
diluição) 
 
 
 
5 - Discussão 
De acordo com os resultados obtidos, e com o 
que seria expectável, verificou-se que quanto 
maior for o fator de diluição, menor será a 
presença de microrganismos. Analisando a 
relação entre a amostra pasteurizada e não 
pasteurizada, concluiu-se que houve diferenças 
significativas relativamente ao meio universal e 
seletivo, verificando-se a ausencia de colonias 
no meio seletivo em amostras de solo 
pasteurizado e a presenca destas no meio seletivo 
de solo nao pasteurizado. 
 
6 – Conclusão 
Conseguiu-se atingir o objetivo proposto da 
observação da diversidade microbiana nas 
amostras do solo estudadas. Macroscopicamente 
foram visualizadas colónias de bacterias e 
fungos e microscopicamente as suas 
características morfológicas. Com o presente 
estudo verificou-se essencial o cumprimento das 
normas de segurança e higiene exigidas, uma vez 
que foram observadas contaminações ambientais 
nas amostras. 
Como limitação observámos que o número de 
elementos de cada grupo, assim como a vasta 
diversidade de colónias, dificultaram a contagem 
das mesmas, contribuindo para uma 
considerável margem de erro associada. 
Como primeiro contacto com o tema da 
microbiologia laboratorial, o uso das técnicas e 
dos métodos estudados foram úteis e positivos 
para o aprofundamento do tema abordado, assim 
como bastante interessantes, na medida em que 
podem facilitar a compreensão da sua 
aplicabilidade nas ciências da nutrição. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 21 - Resultado da inoculção por picada de 
culturas puras em meio Manitol Nitrate Mobility. 
Bactérias nãomóveis uma vez que o seu crescimento 
está apenas na linha de inoculação. 
9 
 
 
Referências: 
 
[1] FDA’s Bacteriological Analytical ManualCenter for Food, “Laboratory Methods - BAM: Aerobic 
Plate Count,” 2001. . 
[2] N. Ferreira, Wanda F. Canas; Sousa, João Carlos F.; Lima, Microbiologia. Lidel, 2016. 
[3] SHYAM CHATHURANGA, “Classification of Microorganisms • Smart Science Pro,” 2014. . 
[4] “Chloramphenicol - MeSH - NCBI.” [Online]. Available: 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/mesh?Db=mesh&Cmd=DetailsSearch&Term=%22Chloramphenicol
%22%5BMeSH+Terms%5D. [Accessed: 04-Apr-2018]. 
[5] “Agar | - PubChem.” [Online]. Available: 
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/71571511#section=Top. [Accessed: 05-Apr-2018]. 
[6] P. Stehlik, “Towards a complex approach to waste treatment in food processing,” in Handbook of 
Water and Energy Management in Food Processing, Elsevier, 2008, pp. 45–82. 
[7] R. Coico and I. John Wiley & Sons, Current protocols in microbiology. Wiley, 2010. 
[8] E. Mauricio, “Protocolo de Microbiologia Prática,” 2018. 
[9] “Gram Stain | MICRB 106.” [Online]. Available: 
https://online.science.psu.edu/micrb106_wd/node/6064. [Accessed: 07-Apr-2018].