Testes NAo treponAmicos

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TESTES DE SÍFILIS
(não treponêmicos)
 São testes que detectam anticorpos não treponêmicos, ou seja, não são específicos para Treponema pallidum, porém estão presentes na sífilis. 
Os testes não treponêmicos podem ser:
 ■ Qualitativos: rotineiramente são utilizados como testes de triagem 
para determinar se uma amostra é reagente ou não.
 ■ Quantitativos: são utilizados para determinar o título dos anticorpos 
presentes nas amostras que tiveram resultado reagente no teste 
qualitativo e também para o monitoramento da resposta ao 
tratamento.
Técnicas utilizadas nos testes para diagnóstico de Sífilis
Essistem 4 técnicas que podemos utilizar nesses tipos de testes
Floculação
 VDRL (Venereal Disease Laboratory) - baseia-se no uso de uma suspensão antigênica composta por uma solução alcoólica contendo cardiolipina, colesterol e lecitina purificada, e utiliza líquor ou soro inativado como amostra (LARSEN; STEINER; RUDOLPH, 1995; BRASIL, 2020).
 Os componentes da suspensão antigênica (colesterol, lecitina e cardiolipina) ligam-se ao acaso, resultando na formação de estruturas denominadas micelas. Os anticorpos anticardiolipinas, quando presentes nas amostras, ligam-se às cardiolipinas das micelas. Consequentemente, a ligação de anticorpos com várias micelas resulta em uma floculação. Os flocos ou grumos podem ser pequenos ou grandes e são visualizados a olho nu ou com o auxílio de um microscópio, dependendo do teste. Nesses testes de floculação, são detectados anticorpos IgM e IgG contra o material lipídico liberado pelas células danificadas em decorrência da sífilis, e possivelmente contra a cardiolipina liberada pelos treponemas. 
 Nesses testes de floculação, são detectados anticorpos IgM e IgG contra o material lipídico liberado pelas células danificadas em decorrência da sífilis, e possivelmente contra a cardiolipina liberada pelos treponemas. Porém, esses anticorpos não são produzidos exclusivamente como consequência da sífilis e de outras doenças treponêmicas. Eles podem surgir em outros agravos que também levam à destruição celular, gerando resultados falso-positivos G. 
TITULAÇÃO NO TESTE QUANTITATIVO
O teste quantitativo deve ser realizado nas amostras que forem reagentes no teste qualitativo. A titulação é obtida por meio de diluições seriadas, e o resultado será o valor da última diluição que apresentar reatividade no teste. Os passos de diluição normalmente são executados segundo um fator 2 de diluição. Ou seja, o título 1:1 significa a análise da amostra pura, ou seja, a amostra foi testada sem diluir; 1:2 significa que o volume da amostra foi diluído em uma parte igual de tampão; 1:4 significa que uma parte da amostra foi diluída em três partes de tampão, e assim por diante. Dessa forma, uma amostra com reatividade no título 1:256 possui mais anticorpos do que uma amostra com reatividade no título 1:1.
1. Preparação da amostra: deve estar livre de partículas e, geralmente, é aquecido a 56°C por cerca de 30 minutos para inativar o complemento, embora essa etapa possa variar dependendo do protocolo do laboratório.
2. Adição do Antígeno: uma solução contendo antígenos lipídicos (cardiolipina, lecitina e colesterol) é preparada. Esses antígenos são o alvo dos anticorpos reagínicos presentes na amostra do paciente. A amostra e o antígeno são misturados em uma lâmina ou placa de vidro.
3. Incubação e Reação de Aglutinação: a lâmina é agitada em um agitador mecânico por alguns minutos para facilitar a reação entre os anticorpos do soro/plasma e os antígenos na mistura. Se os anticorpos reagínicos estiverem presentes, eles se ligarão aos antígenos, formando pequenos grumos visíveis a olho nu ou ao microscópio, dependendo do protocolo usado.
Outros - O RPR *soro e plasma, o USR *soro sem aquecimento (menos utilizado por ser menos padronizado e sensível que o RPR e o VDRL) e o TRUST *soro e plasma são modificações do VDRL que visam aumentar a estabilidade da suspensão antigênica e, no caso do RPR e do TRUST, permitir a leitura do resultado a olho nu. 
Aglutinação
 Nos testes por aglutinação, partículas de látex ou outras substâncias inertes são revestidas com antígenos que reagem com anticorpos presentes no soro do paciente. Quando os anticorpos específicos estão presentes, eles se ligam às partículas revestidas, formando aglomerados visíveis, o que indica uma reação positiva. O teste de aglutinação rápida é vantajoso, pois não requer equipamentos complexos e fornece resultados rápidos.
Imunoenzimáticos 
ELISA (Enzyme – linked immunossorbent assay) - são usadas enzimas e anticorpos marcados para detectar anticorpos específicos no sangue. No caso do ELISA não treponêmico são detectados anticorpos reagínicos semelhantes ao VDRL e RPR. ****pode ser utilizado soro (mais comum), plasma ou liquor (suspeita de neurossífilis)
1. Imobilização do antígeno: O antígeno (treponêmico ou não treponêmico) é fixado na superfície de um poço em uma placa de microtitulação.
2. Adição do soro do paciente: O soro do paciente é adicionado ao poço. Se o paciente tiver anticorpos contra o antígeno fixado, eles se ligarão a ele.
3. Adição de um anticorpo secundário ligado a uma enzima: Esse anticorpo se liga ao anticorpo do paciente (caso ele esteja presente) e carrega uma enzima.
4. Reação enzimática: Um substrato específico é adicionado, que, em contato com a enzima, produz uma mudança de cor. A intensidade da cor é proporcional à quantidade de anticorpos presentes e é medida por um espectrofotômetro, que gera resultados quantitativos ou semiquantitativos.
Imunocromatográficos 
Teste Rápido – é um método rápido e prático usado na triagem inicial que permite detectar anticorpos não específicos contra o Treponema pallidum utilizando uma tira de teste com membranas revestidas com antígenos não treponêmicosque reagem entre si. 
1. Aplicação da amostra: Uma gota de sangue, soro ou plasma é aplicada na área de teste da tira.
2. Migração por capilaridade: A amostra flui pela membrana por capilaridade, passando por áreas que contêm partículas de látex ou ouro coloidal ligadas a antígenos não treponêmicos.
3. Reação com anticorpos: Se os anticorpos reagínicos estiverem presentes, eles se ligam aos antígenos na tira, formando um complexo que fica preso na linha de teste.
4. Aparecimento da linha de teste: Uma linha colorida aparece se o resultado for positivo, indicando a presença de anticorpos não específicos para a sífilis.
OBS: A titulação dos anticorpos de uma amostra é obtida por meio de diluições seriadas, e o resultado a ser descrito no laudo sempre será o valor da última diluição que apresentar reatividade no teste (ex.: a amostra reagente até a diluição 1:16 corresponde ao título 16). Devem ser consideradas reagentes as amostras que apresentarem reatividade em qualquer uma das diluições, mesmo quando houver reatividade somente com a amostra pura (diluição 1:1), o que permitirá a compreensão, por parte do profissional clínico, de que a amostra foi também testada nas demais diluições, nas quais não apresentou reatividade. 
OBS: O fenômeno prozona consiste na ausência de reatividade aparente no teste não treponêmico realizado em uma amostra não diluída que, embora contenha anticorpos anticardiolipina, apresenta resultado não reagente quando é testada. Esse fenômeno decorre da relação desproporcional entre as quantidades de antígenos e anticorpos presentes na reação não treponêmica, gerando resultados falso-não reagentes. Por esse motivo, é fundamental que, todas as vezes que se realizar qualquer teste não treponêmico, a amostra seja sempre testada pura e na diluição 1:8. Esse é um procedimento padrão que deve ser adotado por todos os laboratórios.