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<p>Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>Apresentação</p><p>A imunologia clínica abrange uma extensa relação de exames que podem ser empregados na</p><p>detecção de antígenos ou anticorpos. Muitos desses podem ser manuais e de fácil execução,</p><p>enquanto outros podem utilizar sistemas automatizados. Entretanto, todos têm grande importância</p><p>no direcionamento da intervenção clínica diante de uma patologia infecciosa ou mesmo de uma</p><p>doença autoimune.</p><p>Dessa forma, é de extrema importância que o imunologista clínico conheça as diversas técnicas</p><p>disponíveis, sabendo reconhecer em qual circunstância e tipos de amostras cada uma deve ser</p><p>aplicada, garantindo um resultado fidedigno para o adequado tratamento médico.</p><p>Nesta Unidade de Aprendizagem, você irá aprender sobre as metodologias aplicadas a testes</p><p>sorológicos e imunoensaios, reconhecer a aplicabilidade de reações de aglutinação e ensaios</p><p>conjugados, além de conhecer os imunoensaios automatizados e os ensaios enzimáticos da</p><p>imunologia clínica.</p><p>Bons estudos.</p><p>Ao final desta Unidade de Aprendizagem, você deve apresentar os seguintes aprendizados:</p><p>Diferenciar as metodologias aplicadas a testes sorológicos</p><p>e imunoensaios em imunologia clínica.</p><p>•</p><p>Reconhecer a aplicabilidade das reações de aglutinação e</p><p>ensaios conjugados.</p><p>•</p><p>Caracterizar os imunoensaios automatizados e ensaios enzimáticos em imunologia clínica.•</p><p>Desafio</p><p>A sífilis é uma infecção sistêmica causada pela bactéria Treponema pallidum, que quando não tratada</p><p>precocemente, pode evoluir para uma enfermidade crônica com sequelas irreversíveis em longo</p><p>prazo.</p><p>É uma doença transmitida principalmente por via sexual e vertical. Trata-se de um importante</p><p>agravo em saúde pública, pois além de ser infectocontagiosa e de poder acometer o organismo de</p><p>maneira grave, aumenta significativamente o risco de se contrair a infecção pelo vírus da</p><p>imunodeficiência humana (HIV), pois a entrada do microrganismo é facilitada pela presença das</p><p>lesões sifilíticas.</p><p>Você faz parte do quadro de colaboradores de um laboratório de análises clínicas que passa por</p><p>redirecionamento de recursos. O seu setor de imunologia clínica, que utiliza técnicas para os</p><p>diagnósticos de doenças infecciosas, como a sífilis, tem sido constantemente questionado quanto</p><p>ao seu custo e aplicação.</p><p>Diversas alternativas têm sido propostas para redução de despesas, entretanto, importantes</p><p>ponderações têm sido feitas no sentido de garantir que a confiabilidade e veracidade dos</p><p>resultados sejam mantidas.</p><p>Na condição de profissional, responda:</p><p>a) Quais os testes imunológicos e principais tipos de técnicas podem ser empregados para o</p><p>diagnóstico de sífilis?</p><p>b) Diante da necessidade de reduzir custos, é possível que apenas um desses testes seja mantido?</p><p>Se sim, qual deve ser escolhido?</p><p>Infográfico</p><p>O laboratório de imunologia clínica tem um grande escopo de exames que podem ser realizados.</p><p>Entre eles, o teste de ELISA ou ensaio imunoenzimático é uma das técnicas mais frequentemente</p><p>empregadas. O teste de ELISA é baseado em reações antígeno-anticorpo que são detectáveis por</p><p>meio de reações enzimáticas.</p><p>No Infográfico a seguir, você vai ver mais informações sobre as diferenças entre os tipos de ELISA</p><p>que podem ser utilizados.</p><p>Aponte a câmera para o</p><p>código e acesse o link do</p><p>conteúdo ou clique no</p><p>código para acessar.</p><p>https://statics-marketplace.plataforma.grupoa.education/sagah/1ca3258f-40f0-4c6b-a64f-665595ceb393/98c555dd-bbca-474f-bafa-b9212bcd0454.jpg</p><p>Conteúdo do livro</p><p>O laboratório de imunologia clínica tem a missão de investigar e orientar o clínico no diagnóstico</p><p>das doenças por meio da realização de exames laboratoriais. Para isso, muitas são as técnicas</p><p>disponíveis e que podem ser empregadas na detecção de antígenos e anticorpos relacionados a</p><p>infecções ou doenças autoimunes que perturbam o sistema imunológico.</p><p>No capítulo Imunoensaios e testes sorológicos, da obra Imunologia clínica, base teórica desta</p><p>Unidade de Aprendizagem, você vai aprender a diferenciar as metodologias aplicadas a testes</p><p>sorológicos e imunoensaios, reconhecendo a aplicabilidade das reações de aglutinação e ensaios</p><p>conjugados. Além disso, vai ser capaz de caracterizar os imunoensaios automatizados e os ensaios</p><p>enzimáticos da imunologia clínica.</p><p>Boa leitura.</p><p>IMUNOLOGIA</p><p>CLÍNICA</p><p>Miriãn Ferrão Maciel Fiuza</p><p>Imunoensaios e</p><p>testes sorológicos</p><p>Objetivos de aprendizagem</p><p>Ao final deste texto, você deve apresentar os seguintes aprendizados:</p><p>� Diferenciar as metodologias aplicadas a testes sorológicos e os imu-</p><p>noensaios em imunologia clínica.</p><p>� Reconhecer a aplicabilidade das reações de aglutinação e dos ensaios</p><p>conjugados.</p><p>� Diferenciar os imunoensaios automatizados dos ensaios enzimáticos</p><p>em imunologia clínica.</p><p>Introdução</p><p>A imunologia clínica é uma importante área da saúde, cujo propósito é</p><p>investigar e nortear as decisões clínicas por meio de exames laboratoriais,</p><p>tanto para doenças infecciosas quanto para autoimunes. Dentro dessa</p><p>área, existem muitas técnicas e exames que podem ser realizados para o</p><p>diagnóstico de patologias, desde técnicas simples e manuais até sistemas</p><p>automatizados. Dessa forma, cabe ao imunologista clínico a responsa-</p><p>bilidade de conhecer as possibilidades de diagnóstico imunológico,</p><p>garantindo a sua correta utilização.</p><p>Neste capítulo, você conhecerá as diferenças entre as técnicas apli-</p><p>cadas a testes sorológicos e os imunoensaios. Além disso, conhecerá a</p><p>aplicabilidade das reações de aglutinação e dos ensaios conjugados.</p><p>Por fim, verá qual é a diferença entre imunoensaios automatizados e</p><p>ensaios enzimáticos.</p><p>1 Metodologias aplicadas em imunologia</p><p>clínica: testes sorológicos e imunoensaios</p><p>O sistema imune pode ser dividido em inato e adaptativo (Figura 1). A imu-</p><p>nidade inata é inespecífica e está presente antes da exposição ao antígeno.</p><p>Ela inclui as barreiras físicas, como pele e membranas mucosas, algumas</p><p>células, como as natural killer (NK), e, determinadas proteínas, como os</p><p>interferons. Esse tipo de imunidade tem como principais funções a destruição</p><p>dos microrganismos invasores e a ativação de processos imunes adaptativos.</p><p>Em contrapartida, a imunidade adaptativa ocorre somente após a exposição</p><p>a um antígeno, sendo conduzida por anticorpos produzidos por linfócitos B</p><p>e por dois tipos de linfócitos T: T auxiliares e T citotóxicos; essas células</p><p>possuem memória de longa duração para um antígeno específico.</p><p>Dessa forma, é possível diferenciar esses dois sistemas quanto à sua espe-</p><p>cificidade, memória e necessidade de exposição prévia a antígenos. Entretanto,</p><p>apesar dessa diferenciação, as respostas imunes inata e adaptativa são elementos</p><p>de um sistema integrado de defesa do hospedeiro, no qual inúmeras células e</p><p>moléculas funcionam de forma cooperativa (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI,</p><p>2008; LEVINSON, 2016).</p><p>O campo da imunologia teve início como uma área da microbiologia e</p><p>ganhou espaço por meio de estudos das doenças infecciosas e suas respectivas</p><p>respostas. Nesse contexto, a imunologia cínica tem o propósito de inves-</p><p>tigar o diagnóstico das patogenicidades por meio de exames laboratoriais.</p><p>Ao analisar o perfil imunológico, evidenciado nos resultados, o clínico iden-</p><p>tifica os prováveis mecanismos utilizados pelo sistema imune para controlar</p><p>e/ou eliminar os patógenos relacionados à atividade imune, que ocorre devido</p><p>a um possível distúrbio. Para tornar isso possível, no setor de imunologia, são</p><p>realizados vários exames correlacionados a algumas patologias provocadas</p><p>por alterações ou ativação do sistema imune, visando a detectar componentes</p><p>desse sistema. Esses elementos podem ser evidenciados durante respostas</p><p>provocadas por um possível desequilíbrio ou perturbação na fisiologia do</p><p>organismo. Esses distúrbios podem ocorrer como consequência de alguma</p><p>patologia, crônica ou aguda, doenças autoimunes, entre outras doenças que</p><p>podem acometer o funcionamento do sistema imune do ser humano (LEVIN-</p><p>SON, 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2016).</p><p>Imunoensaios</p><p>e testes sorológicos2</p><p>Figura 1. Células dos sistemas imunes inato e adaptativo.</p><p>Fonte: Adaptada de VectorMine/Shutterstock.com.</p><p>SISTEMA</p><p>IMUNE INATO</p><p>Macrófago</p><p>Neutró�lo</p><p>Monócito</p><p>Mastócito Basó�lo</p><p>Progenitor mieloide</p><p>LINHAGEM MIELOIDE</p><p>CÉLULA-TRONCO</p><p>HEMATOPOIÉTICA</p><p>Eosinó�lo</p><p>Célula dendrítica</p><p>SISTEMA</p><p>IMUNE ADAPTATIVO</p><p>Célula T de</p><p>memória</p><p>Célula T citotóxica</p><p>Progenitor de célula T</p><p>Célula natural</p><p>killer</p><p>Progenitor de</p><p>célula B</p><p>Célula B de</p><p>memóriaProgenitor linfoide</p><p>LINHAGEM LINFOIDE</p><p>Plasmócito</p><p>Célula T</p><p>auxiliar</p><p>A sorologia trata do estudo dos anticorpos sanguíneos e suas reações com</p><p>antígenos. Esse termo é comumente empregado no diagnóstico de doenças</p><p>infecciosas por meio da detecção de anticorpos específicos para o microrga-</p><p>nismo no soro. O soro se refere à porção do sangue obtida após a centrifugação</p><p>da amostra. Para consegui-lo, deve-se sempre utilizar tubo com gel separador</p><p>e/ou ativador de coágulo durante as coletas. Além disso, a palavra “soro” pode</p><p>ser utilizada para aplicações terapêuticas que apresentam anticorpos prontos</p><p>para utilização. Quando são produzidos e utilizados pela mesma espécie, esses</p><p>anticorpos são chamados de homólogos, ao passo que, quando são produzidos</p><p>em uma espécie e utilizados em outra, são chamados de heterólogos.</p><p>3Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>Os soros com aplicação terapêutica possuem vários anticorpos para o mesmo</p><p>antígeno e, em geral, são obtidos de animais anteriormente imunizados com o</p><p>antígeno de interesse. Esse tipo de utilização tem a vantagem de ser imediata</p><p>e em grande quantidade, garantindo benefícios aos pacientes. Entretanto,</p><p>a resposta imune gerada não é constante e desaparece após cerca de 3 me-</p><p>ses (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008; LEVINSON, 2016; TORTORA;</p><p>FUNKE; CASE, 2016).</p><p>Soro e plasma são amostras completamente diferentes. O soro é obtido após coleta,</p><p>coagulação da amostra e posterior centrifugação. Nenhum anticoagulante é utilizado,</p><p>pois o objetivo é que haja a formação do coágulo, processo em que os fatores de</p><p>coagulação são consumidos. Em contrapartida, o plasma é obtido pela adição de um</p><p>anticoagulante ao tubo de coleta. Todas as proteínas e os fatores de coagulação estão</p><p>presentes nessa amostra, pois não foram consumidos para a produção de coágulo. Em</p><p>suma, o soro é o plasma sem fibrinogênio e fatores de coagulação.</p><p>Os antígenos são moléculas capazes de iniciar uma resposta imune, pro-</p><p>movendo a produção de anticorpos específicos com a ativação de linfócitos e</p><p>a liberação de citocinas. A reação imune ocorre pelo reconhecimento e pelo</p><p>encaixe molecular entre um antígeno e seu anticorpo específico. Quando</p><p>essa interação é forte e estável, as funções dos anticorpos são ativadas, como</p><p>ativação do sistema complemento, aumento da atividade das células NK e</p><p>dos granulócitos e opsonização. Trata-se, então, de uma associação similar à</p><p>interação de enzimas com seus substratos ou de hormônios com seus recep-</p><p>tores. Quanto maior for a afinidade do anticorpo pelo seu respectivo antígeno,</p><p>mais forte será a ligação entre eles. Entretanto, antígenos diferentes podem</p><p>apresentar epítopos semelhantes a outros, ou seja, antígenos diferentes podem</p><p>ser reconhecidos pelo mesmo anticorpo. Por esse motivo, é possível que haja</p><p>a ligação de antígenos a anticorpos que não apresentam a sua melhor comple-</p><p>mentaridade por meio de ligações mais fracas com regiões semelhantes, mas</p><p>não idênticas; essa ligação é chamada de reação cruzada. Os IgMs, primeiros</p><p>anticorpos produzidos durante uma infecção, são a classe de anticorpos mais</p><p>suscetível à ocorrência de reações imunes cruzadas. Os testes rápidos também</p><p>Imunoensaios e testes sorológicos4</p><p>são mais sujeitos a apresentarem esse tipo de reação (LEVINSON, 2016;</p><p>TORTORA; FUNKE; CASE, 2016).</p><p>Os testes sorológicos são técnicas utilizadas para a detecção ou quan-</p><p>tificação de antígenos ou anticorpos. Com exceção dos não treponêmicos</p><p>para sífilis e da lâmina de gota espessa para triagem da malária, esses testes</p><p>possuem leitura automatizada e apresentam resultados quantitativos. Os testes</p><p>sorológicos podem utilizar reagentes marcados ou não marcados. As técnicas</p><p>com reagentes não marcados incluem a aglutinação, a precipitação e a imu-</p><p>nodifusão. As reações de precipitação ocorrem pela combinação de antígeno</p><p>solúvel com anticorpo solúvel para produzir complexos insolúveis visíveis.</p><p>Quando as quantidades dos componentes são equivalentes, há a formação</p><p>máxima de precipitado, que diminui conforme um dos dois reagentes fica em</p><p>excesso (LEVINSON, 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2016).</p><p>Nas reações de aglutinação, ocorre interação entre um anticorpo e um</p><p>antígeno multivalente presente em uma partícula (insolúvel), ligação esta que</p><p>resulta na produção de agregados. Sendo assim, as reações de precipitação e</p><p>de aglutinação resultam da ligação entre anticorpos e antígenos solúveis ou</p><p>particulados, respectivamente. Por fim, as técnicas de imunodifusão podem</p><p>ser do tipo radial dupla ou simples. A imunodifusão radial dupla é um mé-</p><p>todo baseado no princípio de que quando reagentes, antígeno e anticorpo são</p><p>colocados para difundir em um meio suporte, o ponto onde se encontram pode</p><p>ser visualizado na forma de linha ou banda de precipitação. Já a imunodifu-</p><p>são radial simples é uma forma quantitativa da dupla em que o anticorpo é</p><p>uniformemente distribuído no gel, ao passo que o antígeno, ou amostra-teste,</p><p>é aplicado em um orifício. A amostra se difunde radialmente no gel, formando</p><p>um halo de precipitação circular ao redor do orifício.</p><p>A imunoeletroforese, um tipo de técnica de precipitação, associa a ele-</p><p>troforese em gel, seguida da imunodifusão, com a precipitação das proteínas.</p><p>O teste é realizado em duas etapas: separação eletroforética de proteínas e</p><p>imunodifusão de cada componente contra o antissoro específico, formando</p><p>uma linha ou arco de precipitação na região de equivalência (LEVINSON,</p><p>2016; MURPHY, 2014).</p><p>As técnicas com reagentes marcados, também chamadas de imunoen-</p><p>saios, abrangem radioimunoensaio, ensaio imunoenzimático (Elisa, enzyme-</p><p>-linked immunosorbent assay), imunofluorescência, Western blotting e testes</p><p>imunocromatográficos. Nesses métodos, os reagentes marcados podem ser</p><p>enzimas, fluorocromos ou isótopos. A partir disso, pode-se perceber que</p><p>muitos são os testes que podem ser realizados no laboratório de imunologia</p><p>5Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>clínica, sendo que a maior parte deles pode ser utilizada para detectar a pre-</p><p>sença de um antígeno ou de um anticorpo. Para isso, um dos componentes —</p><p>o antígeno ou o anticorpo — é conhecido, ao passo que o outro é desconhecido</p><p>(LEVINSON, 2016; MURPHY, 2014).</p><p>A imunofluorescência baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo</p><p>de se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perderem a sua reatividade</p><p>específica com o antígeno (Figura 2). Os fluorocromos são moléculas que</p><p>absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, fluorescência. A reação</p><p>pode ser do tipo direta, quando anticorpos marcados conhecidos se ligam</p><p>diretamente aos antígenos desconhecidos, ou indireta, quando o processo</p><p>ocorre em dois estágios. Como exemplo de reação indireta, um antígeno</p><p>conhecido é fixado em uma lâmina, a amostra (não marcada) é adicionada</p><p>e a preparação é lavada. Se o soro do paciente contiver anticorpos contra</p><p>o antígeno, eles permanecerão ligados aos antígenos presentes na lâmina,</p><p>podendo ser detectados após a adição dos anticorpos anti-IgG humano, seguida</p><p>da análise em microscópio ultravioleta (LEVINSON, 2016).</p><p>Figura 2. Teste de imunofluorescência. (a) Reação de imu-</p><p>nofluorescência direta, na qual o corante fluorescente que é</p><p>conjugado diretamente ao anticorpo interage com o antígeno</p><p>(triângulos escuros) na superfície da célula. (b) Reação de</p><p>imunofluorescência indireta, quando o corante fluorescente</p><p>é conjugado ao anticorpo contra a IgG humana.</p><p>Fonte: Levinson (2010, p. 535).</p><p>Imunoensaios e testes sorológicos6</p><p>O teste de fixação do complemento pode ser</p><p>utilizado para detectar a</p><p>presença ou semiquantificar antígenos ou anticorpos quando um dos ele-</p><p>mentos presentes é conhecido, evidenciando a hemólise final. A reação é</p><p>realizada em duas etapas: na primeira, o antígeno é incubado na presença de</p><p>uma determinada quantidade de complemento. Se o antígeno e o anticorpo</p><p>equivalentes estiverem presentes, a cascata do complemento será ativada pela</p><p>via clássica. Na segunda etapa, o sistema indicador da reação é adicionado,</p><p>o qual se baseia em hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina</p><p>(anticorpo anti-hemácias de carneiro obtido em coelhos). A determinação da</p><p>atividade hemolítica do complemento no sistema indicador permite definir a</p><p>presença ou não de antígeno ou anticorpo na mistura inicial e sua quantidade</p><p>(LEVINSON, 2016; MURPHY, 2014).</p><p>A imunofixação é um método empregado para determinar qual tipo de</p><p>imunoglobulina monoclonal os plasmócitos estão secretando. É um exame</p><p>solicitado quando há pico monoclonal nas gamaglobulinas na eletroforese de</p><p>proteínas, a fim de identificar qual tipo de imunoglobulina está causando o</p><p>aumento. Esse método é mais sensível e rápido do que a imunoeletroforese,</p><p>reunindo as técnicas de eletroforese e imunoprecipitação.</p><p>A técnica de imuno-histoquímica trata da identificação de antígenos nos</p><p>tecidos com anticorpos, através de secção corada; ou seja, utiliza anticorpos</p><p>para identificar proteínas e moléculas em células e tecidos visualizados ao</p><p>microscópio. Nesse método, o anticorpo de detecção, antígeno-específico,</p><p>é marcado com substância fluorescente, elemento radioativo, ouro coloidal ou</p><p>enzima. As amostras são incubadas com substratos enzimáticos, gerando um</p><p>produto que sofre precipitação direta na secção histológica, produzindo uma</p><p>coloração castanha ou vermelha, que representa a distribuição do antígeno-</p><p>-alvo no tecido ou célula analisado (LEVINSON, 2016; MURPHY, 2014).</p><p>2 Aplicabilidade das reações de aglutinação</p><p>e ensaios conjugados</p><p>Todos os métodos com princípio imunológico se baseiam na análise da ligação</p><p>de especificidade entre antígenos e anticorpos. O teste de aglutinação utiliza</p><p>antígenos particulados, como bactérias ou hemácias, ou antígenos que estão</p><p>em partículas inertes, como esferas de látex, cobertas com um antígeno.</p><p>A ligação do anticorpo altera o estado físico do antígeno, ocasionando a</p><p>formação de redes de complexos visíveis, ou seja, os grumos ou flocos que</p><p>7Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>podem ser medidos. Sendo assim, se houver formação de agregados, o teste</p><p>é considerado reagente, indicando que o indivíduo tem anticorpos contra o</p><p>componente pesquisado ou há presença do antígeno, conforme o objetivo</p><p>do teste. Em contrapartida, se não houver formação de agregados, o teste é</p><p>considerado não reagente (LEVINSON, 2014; MURPHY, 2014).</p><p>O grau de aglutinação pode ser definido conforme a concentração do</p><p>aglutinante e do aglutinado. Quanto maior for a quantidade de anticorpos</p><p>presentes na amostra, maior, mais forte e mais provável será a aglutinação. Para</p><p>determiná-la, a amostra deve ser diluída seriadamente e novamente testada.</p><p>O resultado do teste é expresso em reagente, seguido do título, que se trata</p><p>da observação da última diluição testada em que a amostra foi positiva. Para</p><p>acompanhar a eficácia do tratamento, o médico utiliza o dado da titulação,</p><p>pois, quando há melhora na evolução clínica do paciente, ocorre diminuição</p><p>progressiva dos títulos (LEVINSON, 2016; AGGLUTINATION..., 2017).</p><p>Nas diluições, a quantidade de antígeno permanece a mesma, porém o</p><p>número de anticorpos varia conforme as diluições da amostra. Os volumes de</p><p>diluição geralmente são realizados seguindo o fator 2 de diluição, de modo que</p><p>cada tubo ou poço seguinte testado tem metade dos anticorpos suspensos no</p><p>tubo ou poço anterior. Sendo assim, quando a amostra é diluída pela primeira</p><p>vez no título 1:2, isso indica que a amostra foi diluída em duas partes iguais,</p><p>sendo uma de amostra e uma de diluente. Já quando ela for diluída pela segunda</p><p>vez em 1:4, isso indica que a suspensão será dividida em quatro partes, sendo</p><p>uma de amostra e outras três de diluente, e assim consecutivamente. Quanto</p><p>maior for a diluição reagente, maior será a quantidade de anticorpos presente</p><p>na amostra (AGGLUTINATION..., 2017).</p><p>O método de diluição pode ser do tipo aglutinação direta ou indireta, ini-</p><p>bição da aglutinação ou teste de Coombs. A execução desses testes é bastante</p><p>simples, mesmo em amostras que necessitam de diluições seriadas, pois precisa</p><p>apenas da mistura da amostra com uma gota do reagente em uma placa, seguida</p><p>de agitação contínua por alguns minutos. Sendo assim, esses testes apresentam</p><p>um bom custo-benefício. Nas reações de aglutinação direta, são utiliza-</p><p>das partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra ou fragmentada,</p><p>as quais podem ser bactérias, fungos, protozoários e hemácias, que podem ser</p><p>aglutinadas diretamente por anticorpo. Nessa técnica, são realizadas dilui-</p><p>ções seriadas do anticorpo diante de uma quantidade constante do antígeno.</p><p>A aglutinação ocorre após um período de incubação, e o resultado é comumente</p><p>expresso como a máxima diluição em que ocorre a aglutinação (LEVINSON,</p><p>2016; MURPHY, 2014).</p><p>Imunoensaios e testes sorológicos8</p><p>Portanto, a aglutinação direta é caracterizada pela ligação direta entre</p><p>anticorpos e antígenos, que têm como característica um tamanho celular</p><p>relativamente grande, como bactérias e fungos (Figura 3). Um exemplo de</p><p>aplicabilidade dessa técnica é a tipagem sanguínea, também chamada de</p><p>hemaglutinação. A hemaglutinação é uma técnica utilizada para investigar o</p><p>grupo sanguíneo ABO entre doadores e receptores de sangue. A aglutinação</p><p>é induzida por aglutininas ou anticorpos, chamadas de anti-A, que se ligam</p><p>ao grupo sanguíneo A, ou anti-B ou B, que se ligam ao grupo B. Esses antí-</p><p>genos de grupo sanguíneo estão arranjados em várias cópias na superfície das</p><p>hemácias, o que faz as células se aglutinarem quando sofrem reação cruzada</p><p>com os anticorpos.</p><p>Outro exemplo de aglutinação direta é o teste de Widal para salmoneloses,</p><p>utilizado para o diagnóstico de febre tifoide e febre paratifoide. Trata-se de um</p><p>teste de soroaglutinação que se baseia na detecção de anticorpos aglutinan-</p><p>tes contra os antígenos O (somático) e H (flagelar) da bactéria. Além disso,</p><p>os testes de aglutinação para toxoplasmose e tripanossomíase são considerados</p><p>técnicas de aglutinação direta (LEVINSON, 2016; MURPHY, 2014).</p><p>Figura 3. Representação de uma reação de aglutinação direta.</p><p>Os anticorpos (estruturas representadas em Y) irão se ligar diretamente</p><p>aos antígenos presentes no reagente (bactéria). Então, há a formação de</p><p>verdadeiros complexos de interação, os quais podem ser visualizados</p><p>a olho nu como granulações, grumos ou flocos.</p><p>Fonte: Adaptada de Tortora, Funke e Case (2016).</p><p>9Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>Nas reações de aglutinação indireta ou passiva, as hemácias e as par-</p><p>tículas inertes podem ser sensibilizadas por adsorção passiva, podendo ser</p><p>bentoita, látex, sepharose, leveduras, gelatina ou hemácias. Nessa técnica,</p><p>os antígenos solúveis estão associados a outras superfícies que reforçam a</p><p>ligação antígeno-anticorpo, tornando os agregados visíveis na forma de gra-</p><p>nulações, grumos ou flocos; ou seja, há reação entre o anticorpo do paciente</p><p>com um antígeno que está aderido a uma partícula (Figura 4). Na aglutinação</p><p>indireta, as partículas se aglutinam com maior força do que na técnica direta.</p><p>Partículas de látex são esferas de poliestireno utilizadas como suportes na adsorção</p><p>de proteína solúvel e antígenos polissacarídeos. Elas são frequentemente utilizadas e</p><p>funcionam como um sistema indicador da reação antígeno-anticorpo. Esse teste pode</p><p>ser aplicado para pesquisa de antígenos ou anticorpos, sendo comumente utilizado</p><p>para a detecção de fator reumatoide IgM, dirigido contra isotipos de IgG, IgA1, IgM</p><p>ou IgE (LEVINSON, 2016; MURPHY, 2014).</p><p>Figura 4. Representação esquemática de</p><p>uma reação de aglutinação indireta. Os anticorpos</p><p>(Ac) presentes no soro do paciente (estruturas representadas em Y) irão se ligar aos antígenos</p><p>(Ag) presentes no reagente (esferas pequenas em vermelho). Os antígenos são, então, agrupa-</p><p>dos às substâncias que reforçam as ligações Ag-Ac (esferas maiores em amarelo – partículas</p><p>de látex), formando os complexos de aglutinação (granulações, grumos ou flocos).</p><p>Fonte: Adaptada de Agglutination... (2017).</p><p>Partículas</p><p>de látex</p><p>Imunoensaios e testes sorológicos10</p><p>Como muitos antígenos podem se ligar às células ou partículas, a apli-</p><p>cação dos testes de aglutinação indireta é bastante variada. Um exemplo de</p><p>aplicabilidade dessa técnica é o método de hemaglutinação indireta (HAI)</p><p>para a doença de Chagas. Essa reação se baseia na aglutinação de hemácias</p><p>sensibilizadas com antígeno Trypanossoma cruzi, na presença de soro contendo</p><p>anticorpos contra esse parasita (Figura 5). Em geral, o suporte utilizado no</p><p>teste é uma placa de microtitulação. Inicialmente, a amostra é adicionada ao</p><p>suporte e, em seguida, as hemácias sensibilizadas com antígeno de T. cruzi</p><p>são adicionadas. Se houver interação entre antígeno e anticorpo, a aglutinação</p><p>de hemácias pode ser visualizada. O resultado pode ser visualizado a olho</p><p>nu, com a placa de microtitulação colocada contra a luz ou em um espelho</p><p>próprio. Quando há um anticorpo específico contra o antígeno, as hemácias</p><p>se aglutinam, formando uma camada no fundo do poço em forma de tapete.</p><p>Se não houver anticorpo específico, as células formam um botão no fundo do</p><p>poço. O Quadro 1, a seguir, apresenta os critérios para a definição de amostras</p><p>(LEVINSON, 2016; BRASIL, 2001).</p><p>Fonte: Adaptado de Brasil (2001).</p><p>Amostra reagente</p><p>Hemácias distribuídas de maneira homogênea,</p><p>ocupando área maior do que 50% do fundo da</p><p>placa.</p><p>Amostra não reagente</p><p>Hemácia acumulada em formas de botão no fundo</p><p>do poço.</p><p>Amostra</p><p>indeterminada</p><p>Qualquer padrão diferente dos anteriores.</p><p>Quadro 1. Teste HAI: critérios para a definição de amostra reagente, não reagente ou</p><p>indeterminada</p><p>11Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>Figura 5. Representação esquemática das três etapas de uma reação de hemaglutinação</p><p>indireta (HAI).</p><p>Fonte: Adaptada de Brasil (2001).</p><p>Hermácia sensibilizada</p><p>com antígeno</p><p>Aglutinação</p><p>Anticorpo</p><p>1 2 3</p><p>O teste de VDRL (do inglês Veneral Disease Research Laboratory) também</p><p>é um método de aglutinação indireta. Nesse método, são empregados cristais de</p><p>colesterol sensibilizados com lecitina e cardiolipina na pesquisa de anticorpos</p><p>cardiolipídicos da sífilis (Figura 6) ou de autoanticorpos da síndrome antifos-</p><p>folipídica primária ou secundária, geralmente associada ao lúpus eritematoso</p><p>sistêmico. Outros testes que utilizam essa metodologia são: teste para anties-</p><p>treptolisina O, fator reumatoide e proteína C-reativa. A estreptolisina O é uma</p><p>toxina extremamente antigênica liberada pela bactéria Streptococcus pyogenes,</p><p>levando à formação do anticorpo antiestreptolisina O (ASLO). Já o fator reu-</p><p>matoide está presente em várias patologias em que o sistema imune é bastante</p><p>estimulado. Por fim, a proteína C-reativa é uma glicoproteína produzida por</p><p>hepatócitos, utilizada como indicador de processos inflamatórios de origem</p><p>bacteriana ou de destruição tecidual (ARYAL, 2019; MURPHY, 2014).</p><p>Figura 6. (a) Presença de floculação e (b) ausência de floculação na reação de VDRL.</p><p>Fonte: Brasil (2014, p. 5).</p><p>(a) (b)</p><p>Imunoensaios e testes sorológicos12</p><p>As reações de inibição da aglutinação são baseadas na competição entre</p><p>antígenos particulados e antígenos solúveis por um número limitado de locais</p><p>combinatórios em moléculas de anticorpos. A inibição da aglutinação atua</p><p>como um indicador de reação positiva. A investigação da presença do hormô-</p><p>nio da gonadotrofina coriônica (hCG) na urina como teste de gravidez é um</p><p>exemplo de utilização dessa técnica (Figura 7). Nessa metodologia, a amostra</p><p>é incubada com um soro anti-hCG e, junto a essa mistura, são adicionadas</p><p>partículas revestidas com hCG. Se houver Ag hCG na urina, os anticorpos</p><p>se ligarão e ficarão bloqueados na incubação inicial, resultando em um teste</p><p>positivo, no qual não ocorre aglutinação. Na ausência de hCG na urina, ocorre</p><p>aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação</p><p>inicial, de modo que permanecem livres para se aglutinar com as partículas</p><p>revestidas de hCG (LEVINSON, 2016; MURPHY, 2014).</p><p>Figura 7. Esquema representativo das reações de inibição da aglutinação no teste de hCG</p><p>urinário (teste de gravidez).</p><p>Fonte: Adaptada de Montassier (2015).</p><p>Urina Soro anti-hCG</p><p>São incubados e</p><p>colocados em</p><p>uma placa</p><p>Adicionam-se Partículas revestidas</p><p>com hCG</p><p>RESULTADO POSITIVO:</p><p>Presença de hCG</p><p>na urina, sendo assim,</p><p>não há aglutinação.</p><p>Acs se ligaram ao hCG da urina,</p><p>�cando bloqueados na incubação inicial.</p><p>RESULTADO NEGATIVO:</p><p>Ausência de hCG na urina.</p><p>Há, portanto, aglutinação,</p><p>pois os Acs anti-hCG não</p><p>são bloqueados na</p><p>incubação inicial, já que</p><p>não há a presença do</p><p>hormônio na urina.</p><p>Livres, eles podem</p><p>aglutinar com as partículas</p><p>revestidas de hCG.</p><p>13Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>Os ensaios conjugados ou imunoensaios são técnicas imunológicas utili-</p><p>zadas na identificação, caracterização, detecção e quantificação de anticorpos</p><p>e antígenos. Essas técnicas podem ser divididas em radioimunoensaio (RIA),</p><p>ensaio imunoenzimático (Elisa) e imunofluorescência. O RIA é um dos méto-</p><p>dos mais sensíveis para a análise quantitativa de reações Ag-Ac. Essa técnica</p><p>é utilizada para quantificar antígenos ou haptenos que podem ser marcados</p><p>radioativamente. Haptenos são moléculas não imunogênicas, mas que podem</p><p>reagir com os produtos de uma resposta imune específica. Os complexos Ag-Ac</p><p>formados podem ser separados, assim como a quantidade de radioatividade</p><p>pode ser mensurada. Um exemplo de RIA é o ensaio radioalergoabsorvente,</p><p>também chamado de teste RAST, utilizado para avaliar, no soro, a quantidade</p><p>de anticorpo IgE radiomarcado que reage com um antígeno conhecido —</p><p>um alérgeno —, para detectar respostas alérgeno-específicas.</p><p>O teste de Elisa, por sua vez, é um método de ligação direta a anticorpos</p><p>ou a antígenos, sendo frequentemente utilizado no diagnóstico de infecções</p><p>virais. Nessa técnica, uma enzima é quimicamente ligada ao anticorpo.</p><p>O componente não marcado — o antígeno — é ligado a um suporte sólido,</p><p>como um poço de microplaca, que adsorverá certa quantidade de qualquer</p><p>enzima. Essa técnica pode ser aplicada no diagnóstico de infecção pelo vírus</p><p>da imunodeficiência humana (HIV, human immunodeficiency virus), agente</p><p>causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (aids, assim chamada</p><p>a partir do acrônimo original em inglês, acquired immunodeficiency syn-</p><p>drome). Na imunofluorescência, anticorpos ou antígenos são conjugados a uma</p><p>substância que, quando excitada por radiação ultravioleta, emite luz visível.</p><p>Essa técnica possui aplicabilidade na fenotipagem de células tumorais. Além</p><p>disso, ela pode ser utilizada para diagnóstico sorológico de várias doenças</p><p>infecciosas, como doença de Chagas, aids, hepatites e complexos em doenças</p><p>autoimunes (LEVINSON, 2016; MURPHY, 2014).</p><p>Imunoensaios e testes sorológicos14</p><p>3 Imunoensaios automatizados e</p><p>ensaios enzimáticos</p><p>Em virtude da diversidade de exames que podem ser realizados no campo da</p><p>imunologia clínica, vários testes podem ser realizados sem a necessidade de</p><p>equipamentos mais caros e específicos. Entretanto, muitos desses exames,</p><p>principalmente quando são realizados em maior quantidade, podem ser feitos</p><p>de forma automatizada, por meio de sistemas de automação laboratorial, que</p><p>aumentam a eficiência e a sensibilidade analítica dos testes. A citometria de</p><p>fluxo, a imunoturbidimetria e a nefelometria são exemplos de imunoensaios</p><p>automatizados (LEVINSON, 2016: XAVIER; DORA; BARROS, 2016).</p><p>A citometria de fluxo, também chamada de separação celular ativada</p><p>por fluorescência, é frequentemente utilizada para medir as quantidades</p><p>dos</p><p>diferentes tipos de células sanguíneas imunologicamente ativas. Esse método</p><p>detecta a fluorescência associada a células marcadas com anticorpos mono-</p><p>clonais ou com corantes fluorescentes em um meio líquido em movimento.</p><p>A utilização da citometria de fluxo permite a investigação de vários parâme-</p><p>tros em uma célula por vez, permitindo a análise de milhares de células por</p><p>minuto. Essa técnica tem como base a marcação da célula com anticorpos</p><p>monoclonais contra antígenos presentes no citoplasma e na membrana da</p><p>célula (Figura 8). Esses anticorpos podem ser de dois tipos: anticorpos ou</p><p>antianticorpos (anticorpos secundários), ambos marcados com fluorescência.</p><p>Como se trata de uma reação Ag-Ac, apenas as células que possuem o antígeno</p><p>investigado irão se ligar à marcação fluorescente. As células marcadas passam</p><p>por um fino capilar, que permite a passagem de uma única célula por vez,</p><p>onde são atingidas por um feixe de laser. Cada célula dispersa a luz de uma</p><p>forma, e o seu corante fluorescente é excitado, liberando o seu sinal. A leitura</p><p>será realizada por um sistema de sensores óticos, que detectam os parâmetros</p><p>individuais de cada célula, como o tamanho, a granulosidade e a emissão de</p><p>fluorescência (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008; MURPHY, 2014).</p><p>15Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>Figura 8. Funcionamento de um citômetro de fluxo.</p><p>Fonte: Adaptada de Murphy (2014).</p><p>A citometria de fluxo é utilizada nos analisadores hematológicos auto-</p><p>matizados, nos quais é aplicada para diferenciar as populações de linfócitos</p><p>em um hemograma. Nesse caso, geralmente não são utilizados feixes de luz</p><p>laser nem anticorpos monoclonais fluorescentes, utilizando-se somente luz</p><p>normal. Além disso, são medidos apenas dois parâmetros: o FSC (caracterís-</p><p>ticas de espelhamento frontal), que fornece informações sobre o tamanho e a</p><p>forma da célula, e o SSC (características de espelhamento lateral), que obtém</p><p>informações sobre a granulosidade e a complexidade celular interna. Esses</p><p>parâmetros são particulares de cada célula, e a sua diferenciação em popu-</p><p>lações com características semelhantes é o que possibilita a identificação de</p><p>linfócitos, monócitos e neutrófilos (McPHERSON; PINCUS, 2012; XAVIER;</p><p>DORA; BARROS, 2016).</p><p>Imunoensaios e testes sorológicos16</p><p>Uma das principais vantagens da técnica de citometria de fluxo é a possibilidade de se</p><p>obter informações de vários parâmetros em uma grande e diversificada população de</p><p>células. Isso possibilita que as células cancerígenas sejam identificadas e quantificadas</p><p>em relação às células normais, facilitando o diagnóstico diferencial de leucemias e</p><p>linfomas (XAVIER; DORA; BARROS, 2016).</p><p>A imunoturbidimetria é uma técnica utilizada para a detecção da turbidez</p><p>causada pela presença de imunocomplexos em uma amostra. Essa metodologia</p><p>é capaz de detectar grandes partículas, identificando a redução da transmissão</p><p>de luz (absorbância), devido à presença de partículas em suspensão, e detec-</p><p>tando diminuições pequenas na emissão do sinal total. O princípio da imu-</p><p>noturbidimetria é o seguinte: em uma solução em que está havendo interação</p><p>Ag-Ac, a presença de complexos insolúveis dispersa a luz, e a quantidade dessa</p><p>dispersão é equivalente à concentração dos imunocomplexos. Dessa forma,</p><p>uma maior quantidade de antígeno ou anticorpo implica uma maior dispersão</p><p>da luz, que será mensurada no espectrofotômetro, permitindo a determinação</p><p>da presença de anticorpos em solução. Essa técnica possui utilidade para a</p><p>dosagem de proteínas em vários fluidos corporais, como soro, urina e líquido</p><p>cerebrospinal (LCS). Além disso, ela pode ser utilizada para a detecção de</p><p>anticorpos específicos, além de antígenos, como antiestreptolisina O, proteína</p><p>C reativa, fator reumatoide, entre outros (McPHERSON; PINCUS, 2012;</p><p>XAVIER; DORA; BARROS, 2016).</p><p>A nefelometria é uma técnica que mede a interação de Ag-Ac em solução,</p><p>detectando a formação de imunocomplexos por meio do monitoramento de</p><p>alterações na dispersão de uma luz incidente. A quantidade de imunocomplexos</p><p>formados a partir da adição da amostra é comparada com uma curva-padrão,</p><p>que apresenta a densidade ótica gerada por quantidades conhecidas do padrão</p><p>reagente. Em geral, os equipamentos de nefelometria são espectrofotômetros</p><p>com um detector para luz dispersa, em ângulos de 15 a 90° em relação ao</p><p>feixe que incide sobre a cubeta. As fontes luminosas podem ser lâmpadas de</p><p>mercúrio, lâmpadas de tungstênio e luz laser. A nefelometria é útil para a</p><p>detecção de classes específicas de anticorpos, de anticorpos específicos contra</p><p>patógenos, proteína C reativa, proteínas do sistema complemento, entre outras</p><p>(IMBODEN; HELLMANN; STONE, 2014; LEVINSON, 2016).</p><p>17Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>Os ensaios enzimáticos são métodos quantitativos em que a interação</p><p>Ag-Ac é analisada pela medida da atividade enzimática. Essas técnicas utilizam</p><p>antígenos ou anticorpos marcados com enzimas que permitem a detecção,</p><p>a titulação e a quantificação de componentes de interesse biológico. Esses</p><p>ensaios têm alta sensibilidade, apresentando vantagens de se utilizar reagentes</p><p>estáveis, e não radioisótopos, podendo ser adaptados para testes simples ou</p><p>automatizados. O ensaio de Elisa foi desenvolvido como opção ao radioimuno-</p><p>ensaio para a detecção de antígenos e anticorpos. Apesar de haver variações,</p><p>o princípio básico do teste é a imunoimobilização de um dos reagentes em</p><p>uma fase sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com</p><p>preservação das atividades da enzima e do anticorpo. Contudo, esse teste é</p><p>capaz de detectar quantidades muito pequenas de antígenos ou anticorpos.</p><p>Sendo assim, ele tem como objetivo a quantificação ou verificação da pre-</p><p>sença de um antígeno ou anticorpo. Entre as técnicas de Elisa disponíveis,</p><p>os métodos mais comuns são: direto, indireto e de competição (Figura 9).</p><p>O Elisa direto é uma técnica utilizada para a detecção do antígeno, em que</p><p>uma placa contém, aderidos na parte sólida, anticorpos para a patologia a</p><p>ser investigada. Já o Elisa indireto é utilizado para a detecção do anticorpo,</p><p>em que a placa contém antígenos aderidos à sua parte sólida. Por fim, no método</p><p>Elisa de competição, um antígeno marcado é utilizado para competir com o</p><p>alvo. Quanto maior for a quantidade de antígeno da amostra (não marcado),</p><p>menor será a ligação do antígeno marcado, de modo que a cor fica mais fraca</p><p>na presença do alvo da amostra (LEVINSON, 2010, 2016).</p><p>Imunoensaios e testes sorológicos18</p><p>Figura 9. Tipos de ensaio de Elisa.</p><p>Fonte: Adaptada de rumruay/Shutterstock.com.</p><p>Substrato</p><p>Substrato</p><p>Substrato</p><p>Substrato</p><p>Elisa direto Elisa indireto ELISA sanduíche ELISA competitiva</p><p>Conjugado de</p><p>anticorpo primário</p><p>Conjugado de</p><p>anticorpo secundário</p><p>Anticorpo de captura</p><p>Antígeno</p><p>inibidor</p><p>Antígeno</p><p>Antígeno</p><p>Antígeno</p><p>AntígenoAntígeno</p><p>O Western blotting é um dos métodos enzimáticos mais utilizados para</p><p>a identificação de proteínas e glicoproteínas específicas, reconhecidas por</p><p>anticorpos marcados. Nessa técnica, as proteínas são separadas, conforme</p><p>o seu tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil</p><p>sulfato de sódio (SDS-PAGE). Após a separação, as proteínas são transferidas,</p><p>eletroforeticamente, do gel para uma membrana de nitrocelulose. O Western</p><p>blotting é um método qualitativo, em que o aparecimento de uma banda em</p><p>um blot indica a presença de um anticorpo na amostra ensaiada na mem-</p><p>brana ou de um antígeno na mistura que foi submetida à eletroforese. Após o</p><p>bloqueio da membrana, a identificação das frações separadas e transferidas</p><p>é feita mergulhando-se as tiras de nitrocelulose em uma solução contendo</p><p>os anticorpos específicos para as frações. Os anticorpos interagem com os</p><p>19Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>antígenos imobilizados e são revelados colocando-se a membrana em uma</p><p>solução contendo anti-imunoglobulina marcada com a enzima. Para a visu-</p><p>alização, adiciona-se o cromógeno, que, sob a ação da enzima, dá origem a</p><p>um precipitado colorido (LEVINSON, 2016).</p><p>Na imunocromatografia, considerada um teste rápido, há uma matriz</p><p>constituída de membrana de nitrocelulose ou náilon, coberta por acetato</p><p>transparente, para facilitar a visualização do resultado. Parte da membrana</p><p>é fixada com o antígeno ou o anticorpo na forma de linhas ou pontos, ao</p><p>passo que o restante é bloqueado com uma proteína inerte, como nos testes</p><p>de Elisa. A técnica de quimiluminescência também é baseada na ligação de</p><p>Ag-Ac, na qual, em geral, não há liberação de calor, pois a energia é liberada</p><p>na forma de luz. Nessa técnica, o antígeno ou o anticorpo é conjugado em</p><p>uma substância que, quando ativada, emite luz visível. Dessa forma, a emis-</p><p>são de luz é proporcional ao componente pesquisado. Essa reação envolve</p><p>várias etapas. Inicialmente, uma microesfera de poliestireno é revestida com</p><p>o anticorpo monoclonal contra o antígeno investigado. Logo após, a amostra</p><p>é adicionada e incubada, com agitação intervalada. O antígeno não fixado</p><p>é retirado após lavagem e, então, o anticorpo monoclonal específico para</p><p>o antígeno pesquisado conjugado à enzima é adicionado. Novamente, uma</p><p>incubação é realizada, e mais uma lavagem é feita para retirar o anticorpo</p><p>não fixado. Então, o substrato da enzima é adicionado, e a reação é incubada.</p><p>Em seguida, um substrato quimiluminescente, que sofre hidrólise na presença</p><p>da enzima, é adicionado, produzindo substâncias instáveis que geram emissão</p><p>de luz (fótons) (LEVINSON, 2016; MURPHY, 2014).</p><p>Os testes imunológicos têm sido amplamente utilizados no diagnóstico de Sars-CoV-2,</p><p>agente causador da Covid-19, como, por exemplo: os testes Elisa, que se baseiam em</p><p>uma reação enzimática; o imunoensaio quimioluminescente (CLIA), que utiliza uma</p><p>reação química para tornar a reação antígeno-anticorpo visível; e a imunofluorescência,</p><p>em que a leitura do resultado é feita a partir da fluorescência formada na reação do</p><p>antígeno com o anticorpo. Além disso, os testes sorológicos rápidos baseados em</p><p>imunocromatografia, que pesquisam a presença de anticorpos contra o vírus em cerca</p><p>de 20 minutos, têm sido utilizados.</p><p>Imunoensaios e testes sorológicos20</p><p>ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. 6. ed. Rio de</p><p>Janeiro: Elsevier, 2008. 564 p.</p><p>AGGLUTINATION Assays. In: MICROBIOLOGY. Lumen Learning, Portland, 2017. Disponível</p><p>em: https://courses.lumenlearning.com/microbiology/chapter/agglutination-assays/.</p><p>Acesso em: 6 out. 2020.</p><p>ARYAL, S. C-Reactive Protein (CRP) Test- Principle, Uses, Procedure and Result Interpre-</p><p>tation. Microbiology Info, [S. l.], 15 Aug. 2019. Disponível em: https://microbiologyinfo.</p><p>com/c-reactive-protein-crp-test-principle-uses-procedure-and-result-interpretation/.</p><p>Acesso em: 6 out. 2020.</p><p>BRASIL. Ministério da Saúde. Programa Nacional de DST e Aids. Coordenação da Política</p><p>Nacional de Sangue e Derivados. Doença de Chagas: triagem e diagnóstico sorológico</p><p>em unidades hemoterápicas e laboratórios de saúde público. Brasília: Ministério da</p><p>Saúde, 2001. 34 p. Disponível em: http://telelab.aids.gov.br/media/joomdle/videos/14/</p><p>manualChagas.pdf. Acesso em: 6 out. 2020.</p><p>BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de</p><p>DST, Aids e Hepatites Virais. Testes para o diagnóstico da sífilis. Brasília: Ministério da</p><p>Saúde, 2014. 23 p. (Aula 2). Disponível em: https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.</p><p>php/22193/mod_resource/content/1/S%C3%ADfilis%20-%20Manual%20Aula%202.</p><p>pdf. Acesso em: 6 out. 2020.</p><p>IMBODEN, J. B.; HELLMANN, D. B.; STONE, J. H. Reumatologia. 3. ed. Porto Alegre: AMGH;</p><p>Artmed, 2014. 644 p. (Série Current Diagnóstico e Tratamento).</p><p>LEVINSON, W. Microbiologia médica e imunologia. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.</p><p>663 p.</p><p>LEVINSON, W. Microbiologia médica e imunologia. 13. ed. Porto Alegre: AMGH; Artmed,</p><p>2016. 800 p.</p><p>MCPHERSON, R. A.; PINCUS, M. R. (ed.). Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos</p><p>laboratoriais de Henry. 21. ed. Barueri: Manole, 2012. 1664 p.</p><p>MONTASSIER, H. J. Reações Ag-Ac. Jaboticabal: Departamento de Patologia Veterinária,</p><p>Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de</p><p>Mesquita Filho”, 2015. 16 p. (Notas de aula). Disponível em: https://www.fcav.unesp.br/</p><p>Home/departamentos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-8--interacoes-antigeno-</p><p>-anticorpo.pdf. Acesso em: 6 out. 2020.</p><p>MURPHY, K. Imunobiologia de Janeway. 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 888 p.</p><p>TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre: Artmed,</p><p>2017. 964 p.</p><p>XAVIER, R. M.; DORA, J. M.; BARROS, E. (org.). Laboratório na prática clínica: consulta</p><p>rápida. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2016. 1056 p.</p><p>21Imunoensaios e testes sorológicos</p><p>Os links para sites da web fornecidos neste capítulo foram todos testados, e seu fun-</p><p>cionamento foi comprovado no momento da publicação do material. No entanto, a</p><p>rede é extremamente dinâmica; suas páginas estão constantemente mudando de</p><p>local e conteúdo. Assim, os editores declaram não ter qualquer responsabilidade</p><p>sobre qualidade, precisão ou integralidade das informações referidas em tais links.</p><p>Imunoensaios e testes sorológicos22</p><p>Dica do professor</p><p>O teste sorológico é baseado na sorologia, ou seja, no estudo do líquido separado do sangue após</p><p>centrifugação e formação do coágulo. O exame sorológico tem o objetivo de identificar a presença</p><p>de antígenos pertencentes a vários microrganismos e de anticorpos que são desenvolvidos como</p><p>resposta à presença desses agentes infecciosos no sangue do paciente.</p><p>Nesta Dica do Professor, você aprenderá mais sobre antígenos e anticorpos, além de compreender</p><p>melhor como ocorre a interação entre essas moléculas.</p><p>Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.</p><p>https://fast.player.liquidplatform.com/pApiv2/embed/cee29914fad5b594d8f5918df1e801fd/c0f577b6bd1d8786b6d7fecc9da08e99</p><p>Exercícios</p><p>1) A sorologia se refere ao estudo dos anticorpos sanguíneos e suas reações com antígenos. O</p><p>termo é frequentemente utilizado no diagnóstico de doenças infecciosas por meio da</p><p>detecção de anticorpos específicos para o microrganismo no soro.</p><p>Qual o procedimento necessário para obtenção dessa amostra?</p><p>A) Para obter o soro, o paciente não precisa estar em jejum, mas a amostra deve ser coletada em</p><p>tubo com anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetracético).</p><p>B) Para obter o soro, o paciente deve estar em jejum e a amostra deve ser coletada em tubo com</p><p>anticoagulante heparina.</p><p>C) Para obter o soro, o sangue deve ser coletado em tubo com anticoagulante EDTA (ácido</p><p>etilenodiamino tetracético) e a amostra deve ser centrifugada.</p><p>D) Para obter o soro, o paciente deve estar em jejum e a amostra deve ser coletada em tubo com</p><p>anticoagulante heparina.</p><p>E) Para obter o soro, o sangue deve ser coletado em tubo com gel separador e/ou ativador de</p><p>coágulo e a amostra deve ser centrifugada.</p><p>2) Os testes sorológicos podem utilizar reagentes marcados ou não marcados. As técnicas com</p><p>reagentes não marcados incluem a aglutinação, a precipitação e a imunodifusão.</p><p>Assinale a alternativa que melhor apresenta a definição da técnica de precipitação.</p><p>A) Nas reações de precipitação ocorre interação entre um anticorpo e um antígeno multivalente</p><p>presente em uma partícula (insolúvel).</p><p>B) As reações de precipitação ocorrem pela combinação de antígeno solúvel com anticorpo</p><p>solúvel para produzir complexos insolúveis que são visíveis, os precipitados.</p><p>C) A técnica de precipitação é baseada no princípio de que quando reagentes, antígeno e</p><p>anticorpo, são colocados a difundir em um meio suporte, o ponto em que se encontram pode</p><p>ser visualizado na forma de linha.</p><p>D) A técnica de precipitação é empregada para determinar, pela formação de precipitados, qual</p><p>tipo de imunoglobulina monoclonal os plasmócitos estão secretando.</p><p>E) A precipitação baseia-se na capacidade de as moléculas de anticorpo se ligarem</p><p>covalentemente a fluorocromos sem perderem</p><p>sua reatividade específica com o antígeno.</p><p>3) O teste de aglutinação utiliza antígenos particulados, como bactérias ou hemácias, ou</p><p>antígenos que estão em partículas inertes, como esferas de látex, cobertas com um antígeno.</p><p>Qual das afirmações melhor descreve o princípio desta técnica?</p><p>A) A ligação do anticorpo altera o estado físico do antígeno e há formação de redes de</p><p>complexos visíveis, os grumos ou flocos que podem ser medidos.</p><p>B) A aglutinação tem como princípio a capacidade das moléculas de anticorpo de se ligar</p><p>covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica.</p><p>C) A aglutinação tem como princípio a utilização de complemento, que é incubado junto da</p><p>amostra.</p><p>D) É utilizada para determinar qual tipo de imunoglobulina monoclonal os plasmócitos estão</p><p>secretando.</p><p>E) Nesta técnica anticorpos são utilizados para identificar proteínas e moléculas em células e</p><p>tecidos visualizados ao microscópio.</p><p>4) A técnica de hemaglutinação indireta para a doença de Chagas é um exemplo de método</p><p>baseado na aglutinação. Essa reação se baseia na aglutinação de hemácias sensibilizadas</p><p>com antígeno Trypanosoma cruzi, na presença de soro contendo anticorpos contra o parasita.</p><p>Quais são os critérios para definição de uma amostra reagente?</p><p>A) Uma amostra é considerada reagente quando as células formam um botão no fundo do poço.</p><p>B) Uma amostra é reagente quando as hemácias, ligadas a fluorocromos, emitem fluorescência</p><p>após excitação com luz ultravioleta.</p><p>C) Uma amostra é reagente quando as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo</p><p>do poço em forma de tapete.</p><p>D) Uma amostra é considerada reagente quando ocorre inibição da aglutinação, pois atua como</p><p>um indicador de reação positiva.</p><p>E) Uma amostra é considerada reagente quando as hemácias emitem radiatividade.</p><p>5) A imunoturbidimetria é uma técnica utilizada para detecção da turbidez causada pela</p><p>presença de imunocomplexos em uma amostra.</p><p>Como se pode definir o princípio desse método?</p><p>A) Trata-se de uma técnica que mede a interação antígeno-anticorpo em solução, detectando a</p><p>formação de complexos imunes por meio do monitoramento da redução na dispersão de uma</p><p>luz incidente.</p><p>B) O princípio da técnica é baseado na separação das proteínas, conforme o seu tamanho, por</p><p>eletroforese em gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).</p><p>C) Trata-se de uma técnica alternativa ao radioimunoensaio para a detecção de antígenos e</p><p>anticorpos.</p><p>D) Em uma solução em que está havendo interação antígeno-anticorpo, a presença de</p><p>complexos insolúveis dispersa a luz e a quantidade dessa dispersão é equivalente à</p><p>concentração dos imunocomplexos.</p><p>E) A técnica se baseia na fluorescência associada a células marcadas com anticorpos</p><p>monoclonais ou com corantes fluorescentes, em um meio líquido.</p><p>Na prática</p><p>A imunologia clínica é composta por diversas técnicas que podem ser empregadas em dosagens</p><p>hormonais, nos diagnósticos de doenças autoimunes, oncológicas e infecções virais. Diante da</p><p>pandemia causada pela Covid-19, a importância desses métodos tornou-se ainda mais evidenciada,</p><p>ressaltando a necessidade de conhecimento, investimentos, desenvolvimento e atualização</p><p>constante das técnicas.</p><p>Na Prática, um caso brasileiro de desenvolvimento de um novo teste imunológico para a</p><p>investigação do vírus causador da Covid-19, o Sars-CoV-2.</p><p>Aponte a câmera para o</p><p>código e acesse o link do</p><p>conteúdo ou clique no</p><p>código para acessar.</p><p>https://statics-marketplace.plataforma.grupoa.education/sagah/be795316-39bf-4ebc-a22a-d43c02df149a/312d0576-80c3-4f51-8514-be87c6199a5d.jpg</p><p>Saiba +</p><p>Para ampliar seu conhecimento a respeito desse assunto, veja a seguir as sugestões do professor:</p><p>Aglutinação: direta ou indireta?</p><p>A sorologia emprega várias técnicas para o estudo dos anticorpos e suas reações com antígenos,</p><p>como a aglutinação, que pode ser do tipo direto e indireto, conforme a investigação realizada. Para</p><p>saber mais sobre essa técnica, assista à aula a seguir sobre a diferença entre a aglutinação direta e</p><p>indireta.</p><p>Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.</p><p>Imunização ativa, passiva e adotiva I Soro e vacina –</p><p>Imunologia (Bio Aulas)</p><p>Dentro da imunologia, muitas são as terminologias utilizadas, e algumas podem ser facilmente</p><p>confundidas, como imune, imunidade, imunização, soros e vacinas. Para saber mais sobre esses</p><p>conceitos, assista à aula a seguir sobre imunização ativa, passiva, adotiva, soro e vacina.</p><p>Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.</p><p>Testes sorológicos para Covid-19: interpretação e aplicações</p><p>práticas</p><p>Leia sobre os testes sorológicos para Sars-CoV-2 que podem ser utilizados como exame</p><p>complementar para diagnóstico de infecção prévia ou recente por Covid-19.</p><p>https://www.youtube.com/embed/WdE3Q7UkVwM</p><p>https://www.youtube.com/embed/3pe__xyi-78</p><p>Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.</p><p>https://jic-abih.com.br/index.php/jic/article/view/316</p>