Microscopia em Citologia

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AGRONOMIA
Citologia
Aula: Microscopia, processamento de tecidos e coloração
Prof. Dr. André de Almeida Silva
Microscopia
O que é?
Ciência que estuda os métodos e as aplicações em que se usa
o Microscópio (MO) para a observação de objetos, ou
pormenores de objetos, com dimensões inferiores ao limite de
resolução do olho humano (0,1 mm)
Microscopia
 MO simples ou Lupa ou estereoscópio: possui apenas uma lente ou um sistema
de lentes centradas, produz imagem ampliada (maiores de 0,1mm)
 MOc composto: possui dois sistemas de lentes centradas, ocular e objetiva, para
produzir uma imagem bem mais ampliada.
Microscopia
Microscopia de Luz: Também chamada de microscopia óptica, permite a
observação de detalhes de até 200 nanômetros. Os microscópios ópticos são,
geralmente, utilizados em laboratórios de análises e se dividem em:
*Microscópio ultravioleta
*Microscópio de fluorescência
*Microscópio de contraste de fase
*Microscópio de polarização
Microscopia
Microscopia Eletrônica: Utilizam um feixe de elétrons. Sua capacidade de ampliação é
superior a dos microscópios de luz, atingindo um nível de resolução de 0,2
nanômetros. Os tipos principais são:
*Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
*Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)
Microscopia
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET):
 Este tipo permite examinar detalhes, ampliando o objeto em até um
milhão de vezes. Para a observação neste tipo de microscópio é
necessário que o material seja cortado em camadas bem finas.
 Além da grande resolução, os microscópios que utilizam essa
tecnologia podem medir características como dureza e elasticidade do
material.
Microscopia
Microscopia
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV):
Capazes de produzir imagens em alta resolução, estes
microscópios ampliam em até 100 mil vezes objeto e
permitem obter imagens tridimensionais, sendo bastante
utilizados para a observação da estrutura superficial da
amostra.
Microscopia
Microscopia
História:
 Robert Hooke: em 1665 observou células de cortiça em cortes finos, que se
apresentavam ao MO com um aspecto similar a pequenos favos de mel
empilhados (chamou de cellulae)
Microscopia
História:
 Anos antes, Leeuwenhoeck, outro cientista já havia observado pequenos seres
vivos em amostras de água (posteriormente chamados de bactérias).
Microscopia
História:
 À medida que se dava a evolução do MO, o conhecimento dos diferentes MOs
(microrganismos) também ocorria.
 Outro desenvolvimento diz respeito às técnicas inerentes à preparação do 
material para observação e diferentes colorações.
Microscopia
Parte Mecânica:
Pé ou Base 
Braço ou coluna 
Platina
Tubo ou canhão
Revólver ou Porta –objetiva
Parafusos macrométrico e micrométrico
Parte Óptica:
Sistema de iluminação
Espelho ou lâmpada
Condensador
Diafragma
Sistema de ampliação
Ocular
Objetivas (imersão)
Microscopia
Microscopia
Parte Mecânica:
Microscopia
Parte Mecânica:
Microscopia
Parte Mecânica:
Microscopia
Parte Óptica (sistema de iluminação):
Microscopia
Parte Óptica (sistema de ampliação):
Microscopia
Aumento final
•10X ..........................
•40X..........................
10X x 40X : 400X
Microscopia
Como utilizar o microscópio óptico
1.Ligar.
2. Descer a mesa ao máximo.
3. Colocar na objetiva de menor número (vrm).
4. Aumentar a intensidade se luz.
5. Colocar a lâmina para a análise.
6. Alcançar o foco entanto observa a lâmina pelas oculares ao mesmo tempo em que,
vagarosamente sobindo a mesa movimentando o macrômetrico.
7. Movimentar o micrométrico para alcançar o foco.
8. Após mudar de objetiva, SOMENTE achar o foco pelo micrométrico.
*perigo de quebrar a lamina.
**após o uso do microscópio para a análise, devemos voltar a objetiva ao menor aumento, abaixar a mesa
ao máximo, tirar a lâmina e não se esquecer de desligar o microscópio.
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
TÉCNICASHISTOLÓGICAS
 Visa a preparação dos tecidos destinados à visualização ao MO
 A luz deve atravessar o tecido a ser visualizado
 Obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas
finas e transparentes
TÉCNICASHISTOLÓGICAS
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
Visão geral
 Os tecidos devem ser preparados de modo a preservar sua estrutura original (o
máximo
possível): artefatos
 Artefatos: alterações produzidas nos tecidos e células pelas técnicas utilizadas
 Passos: fixação dos tecidos, desidratação, inclusão, microtomia (corte em fatias
bem finas), coloração e montagem das lâminas
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
1.Obtenção do material
 Uso correto da obtenção do material (animais de
laboratório)
2.Fixação do material
 Utiliza-se formol a 10%. O formol evita o processo da autólise (autodigestão),
impede a
destruição do tecido, promove um endurecimento do tecido para facilitar a coloração.
 Tempo: entre 12 a 24 horas
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
3.Clivagem do
material
 Cortes de acordo com o objetivo
(direcionamento)
4.Desidratação
 Tecidos devem ser desidratados (água não é
miscível
na parafina ou resina)
 Feita através da imersão em soluções alcoólicas
em concentrações graduais e crescentes até
finalizar em álcool absoluto (desidratação
homogênea e evitar danos na estrutura do tecido).
5.
Diafanização
 Após a desidratação o tecido ainda não pode receber o banho de parafina pois a
mesma não se mistura com o álcool. O tecido deve ser, portanto, imerso em um
produto químico em que ambos o álcool e parafina sejam solúveis.
 Infiltração do tecido por um solvente da parafina que seja ao mesmo
tempo desalcolizante: xilol (agente clarificador, porque torna o tecido semi
translúcido, quase transparente).
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
6. Inclusão
 Amostras são colocadas (incluídas) na parafina (MO) ou em resina (MO e ME)
 Imersa na parafina derretida e colocada em estufa a 60°C. essa temperatura ira
evaporar o xilol e os espaços do tecido serão preenchidos pela parafina (rigidez).
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
7.
Microtomia
 Realizado por um aparelho (micrótomo) que faz cortes microscópicos, variando
geralmente
de 1 a 10 μm de espessura.
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
8. Coleta ou Pescagem
 Os cortes parafinados são inseridos cuidadosamente em um aparelho aquecedor a
56°C, e
depois são “pescados” já mas lâminas que serão coradas
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
9.
Coloração
 Os cortes dos tecidos são incolores após a microtomia. A coloração irá contrastar as
estruturas teciduais.
 A ação do corantes se baseia na interação entre os radicais ácidos ou básicos dos
corantes com os tecidos (HE).
Microscopia: processamento de tecidos e coloração
9.
Selagem
 Após fazer a coloração das lâminas deixar secar e proceder com a colocação da
lamínula
com o entellan (montagem permanente das lâminas)
Microscopia
Colorações mais comuns: