relatorio_pratica RT-PCR

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<p>CENTRO UNIVERSITÁRIO LEONARDO DA VINCI</p><p>NÚCLEO DE EDUCAÇÃO A DISTÂNCIA - NEAD</p><p>RELATÓRIO DE PRÁTICA VIRTUAL</p><p>IDENTIFICAÇÃO</p><p>1. Acadêmico: Fabiana de Brito Caetano</p><p>2. Matrícula: 5675189</p><p>3. Curso: BRF Farmácia</p><p>4. Turma: FLC 90078 BFR</p><p>5. Disciplina: Biologia Molecular</p><p>6. Tutor externo: Darc Helen Martins Sousa</p><p>DADOS DA PRÁTICA</p><p>1. Título: RT-PCR</p><p>2. Semestre: 2/2024</p><p>3. Data: 21/10/2024</p><p>INTRODUÇÃO</p><p>A transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR – reverse transcription polymerase chain reaction) é um método de biologia molecular utilizado desde o início da década de 1980. A partir de conhecimentos em virologia baseados em enzimas responsáveis pela replicação viral, os cientistas estudaram a atividade da enzima transcriptase reversa (RT – reverse transcriptase). Essa enzima consegue sintetizar uma fita da molécula de DNA, tendo como molde uma fita de RNA. Cabe lembrar que muitos vírus têm o genoma de RNA, como o HIV (vírus da imunodeficiência humana), o HCV (vírus da hepatite C), o coronavírus e o vírus da dengue, dentre outros (DANTAS JUNIOR, 2004). Utilizando a atividade dessa enzima, os vírus conseguem inserir seu material genético no DNA da célula hospedeira. Ou seja, para que isso ocorra, é necessária a síntese de um DNA complementar ao RNA viral. E é nessa etapa que a transcriptase reversa age. Sua importância é foco de investigações na farmacologia, visando ao desenvolvimento de drogas inibitórias da RT. Muitas já existem, fazendo parte, por exemplo, dos coquetéis antirretrovirais para tratamento da AIDS. Atualmente, a RT-PCR é amplamente utilizada nas ciências ômicas, ou seja, em uma análise global dos RNAs de uma determinada célula sob um certo estímulo. Essa parte da ciência é chamada de Transcriptoma, e nela se quantificam quais RNAs estão mais expressos e quais estão inibidos ou com quantidade diminuída. Pode-se analisar a expressão gênica em diferentes tecidos e entre organismos diferentes, assim como em ensaios com fármacos e outras terapias (NOLAN, 2006).</p><p>OBJETIVOS</p><p>· Neste experimento, você realizará a técnica de reação da transcriptase reversa (RT – reverse transcriptase) seguida da reação em cadeia da polimerase (PCR – polymerase chain reaction), entendendo o procedimento da reação.</p><p>· compreender as etapas teóricas e práticas relacionadas à RT-PCR;</p><p>· identificar a participação e a importância de todos os reagentes necessários para o funcionamento dessa técnica molecular;</p><p>· analisar os resultados de acordo com os objetivos centrais do experimento.</p><p>MATERIAIS</p><p>· Jaleco;</p><p>· Luvas;</p><p>· Máscara;</p><p>· Óculos;</p><p>· Tubo Eppendorf;</p><p>· Tubo Eppendorf contendo amostra de RNA;</p><p>· Oligo Dt;</p><p>· dNTP;</p><p>· Buffer RT;</p><p>· DTT;</p><p>· RNAse inibidor;</p><p>· Transcriptase reversa;</p><p>· Termociclador;</p><p>· Buffer amplificação 10x;</p><p>· Primer F;</p><p>· Primer R;</p><p>· Taq DNA polimerase;</p><p>· Água ultrapura;</p><p>· Micropipeta;</p><p>· Ponteira.</p><p>METODOLOGIA</p><p>1. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO</p><p>Coloque os equipamentos de proteção individual localizados no “Armário de EPIs”. 5</p><p>2. REALIZANDO O MIX</p><p>Na capela, pipete no Eppendorf: 1 µL de oligo dT, 7 µL da amostra de RNA, 1 µL de dNTP, 4 µL de água ultrapura e leve ao termociclador. Configure-o da seguinte forma: 1 ciclo a 5 minutos a 65°C. Na segunda parte, coloque “off” no Hot Lid, selecione “tube” e 13 µL no volume da amostra.</p><p>3. EXECUTANDO A TRANSCRIPÇÃO REVERSA</p><p>Retire o tubo do termociclador e coloque no suporte. Em seguida, coloque no tubo: 4 µL de Buffer RT, 1 µL do DTT, 1 µL de RNAse inibidor, 1 µL de transcriptase reversa e leve ao termociclador. Configure-o da seguinte forma: 1 ciclo a 25°C por 5 minutos, 1 ciclo a 50°C por 60 minutos e 1 ciclo de 70°C por 15 minutos. Na segunda parte, coloque “off” no Hot Lid, selecione “tube” e 20 µL no volume da amostra.</p><p>4. REALIZANDO A POLIMERIZAÇÃO</p><p>Retire o tubo do termociclador. Em seguida, coloque no tubo: 5 µL de Buffer 10x, 2,5 µL de MgCl2, 0,5 µL de primer F, 0,5 µL de primer R, 8 µL de dNTP, 0,5 µL de Taq DNA polimerase, 5 µL da amostra e 28 µL de água ultrapura, e leve ao termociclador. Configure-o da seguinte forma: 1 ciclo a 95°C por 11 minutos, 28 ciclos a 94°C por 1 minuto, 28 ciclos de 59°C por 1 minuto, 28 ciclos a 72°C por 1 minuto e 1 ciclo de 60°C por 60 minutos. Na segunda parte, coloque off no Hot Lid, selecione tube e 50 µL no volume da amostra. Feche o termociclador e os recipientes abertos na capela.</p><p>RESULTADOS E DISCUSSÕES</p><p>AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS</p><p>1. Qual a diferença do RT-PCR para um PCR convencional?</p><p>A PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) é uma variação da técnica de PCR, a qual permite que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente. O resultado é visualizado em Tempo Real durante a amplificação da sequência de interesse, com capacidade ainda de gerar resultados quantitativos com maior precisão.</p><p>2. O que são os dNTPs?</p><p>Os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfato) são os blocos construtores de DNA, fornecendo os nucleotídeos adenina, timina, citosina e guanina necessários para construir a nova cadeia de DNA.</p><p>Os dNTPs são utilizados na técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), na fase de extensão das novas cadeias de DNA.</p><p>3. Explique como ocorre a ação da trancripitase reversa e da Taq DNA polimerase?.</p><p>A transcriptase reversa e a Taq DNA polimerase são enzimas que atuam em processos diferentes, mas que podem ser combinados em técnicas como a RT-qPCR:</p><p>· Transcriptase reversa</p><p>Uma enzima que realiza a transcrição "ao contrário", produzindo DNA a partir de RNA. A transcriptase reversa é encontrada em alguns tipos de vírus, como o HIV e o vírus da hepatite B. A ação da transcriptase reversa ocorre da seguinte forma:</p><p>1. O DNA é formado em fita simples.</p><p>2. O RNA é degradado.</p><p>3. A transcriptase reversa transforma a fita de DNA simples em dupla hélice.</p><p>4. A enzima integrase ajuda a integrar o DNA formado ao DNA da célula hospedeira.</p><p>· Taq DNA polimerase</p><p>Uma enzima que sintetiza DNAs de diversos tamanhos e naturezas. A Taq DNA polimerase é a enzima mais utilizada na PCR (reação em cadeia da polimerase). A Taq DNA polimerase mantém a sua atividade em diferentes meios reacionais.</p><p>A RT-qPCR (PCR de transcrição reversa quantitativa) combina a transcrição reversa e a PCR quantitativa para detectar e amplificar alvos específicos.</p><p>REGISTRO FOTOGRÁFICO</p><p>Durante a prática realize um registro fotográfico em que você aparece executando a prática. Você pode tirar um selfie.</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>Laboratório Virtual: Sumário Teórico RT-PCR</p><p>image1.jpeg</p><p>image2.jpeg</p><p>image3.png</p>