Marcadores Moleculares em Coffea canephora

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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA 
E TECNOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL 
CAMPUS ERECHIM 
 
 
 
 
 
 
JOSAMAIQUE GILSOM VENERAL 
 
 
 
 
 
 
MARCADORES MOLECULARES 
 
 
Disciplina: Tópicos de Biologia Molecular 
Aplicada à Alimentos. 
 
Docente: Denise Olkoski 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ERECHIM 
2012 
BASEADO NOS CONCENITOS APRENDIDOS EM AULA, NOS MATERIAIS DE 
APOIO E OUTRAS FONTES RELEVANTES, RESPONDA AS SEGUINTES 
QUESTÕES SOBRE O ARTIGO INTITULADO: 
“ESTUDO COMPARATIVO DO NÍVEL DE POLIMORFISMO E 
INFORMATIVIDADE ACESSADO PELOS MARCADORES RAPD, AFLP E SSR, NO 
ESTABELECIMENTO DE RELAÇÕES GENÉTICAS EM Coffea canephora.” 
 
1) Explique e compare cada um dos marcadores moleculares utilizados no artigo 
a ser analisado? 
 
RAPD - Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimórfico amplificado 
ao acaso): o uso da reação da polimerização em cadeia (PCR) proporciona a 
amplificação de um segmento de DNA, delimitado por dois iniciadores (ou 
primers), comumente com 10 pares de bases, que são complementares a dois sítios 
de nucleotídeos: um em cada fita do DNA. Os produtos resultantes da amplificação 
podem ser visualizados como bandas em géis de agarose ou poliacrilamida. 
Diferenças ao nível do DNA são inferidas pela presença ou ausência de um 
determinado fragmento amplificado (banda no gel). 
 
AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism (Polimorfismos de 
Comprimento de Fragmentos Amplificados): é resultante do uso combinado de 
enzimas de restrição e da reação da polimerização em cadeia. Suas principais 
características são a alta especificidade e resolução e poder de amostragem. 
Nos protocolos dos AFLPs constam pelo menos sete etapas importantes: 
1° - Digestão do DNA – duas enzimas de restrição cortam o DNA em pedaços de 
4 e 6 pares de bases; 
2° - Ligação dos adaptadores - ligação de adaptadores específicos de dupla cadeia 
nos extremos de restrição; 
3° - Primeira amplificação - consiste na amplificação dos fragmentos agora ligados 
aos adaptadores através da reação da polimerização em cadeia com o uso de 
iniciadores, complementares aos adaptadores com uma extra base a mais na 
extremidade 3‟. Nessa etapa, somente 25% dos fragmentos serão amplificados; 
4° - Segunda amplificação - é feita com uma pequena amostra da primeira 
amplificação. Neste caso são utilizados iniciadores que são compostos de todas 
as bases dos primers da primeira amplificação, mais duas a três bases na 
extremidade 3‟, dependendo do nível de polimorfismo da espécie ou da 
população; 
5° - Preparo do gel – etapa de limpeza dos materiais envolvidos no preparo do gel 
(geralmente de poli-acrilamida) e preparação do gel. Qualquer defeito no gel 
pode causar a perda de reação completa; 
6° - A corrida do gel – envolve o carregamento e a corrida propriamente dita; 
7° - O processamento do gel – essa etapa consiste no tratamento do gel com 
radioisótopos, com moléculas fluorescentes (terminações coloridas) ou com 
nitrato de prata, para visualizar as bandas no gel. 
SSR – Simple Sequence Repeats (Sequências Simples Repetidas) ou 
Microssatélites, consistem em pequenas sequências com um a cinco pares de base 
que se repetem em série em número variável (geralmente de uma dezena a uma 
centena de vezes). Receberam essa denominação porque quando se analisava DNA 
por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio apareciam bandas que 
ficavam ao lado da banda principal. A estas bandas foi atribuído o nome de DNA 
satélite, pois pareciam pequenos satélites ao lado de um planeta. Mais tarde esse 
DNA foi caracterizado como sendo regiões de DNA repetitivo. Posteriormente, foi 
verificado que as repetições podiam ser classificadas em longas (satélites), curtas 
(minissatélites) ou muito curtas (microssatélites). 
 
Comparando os marcadores utilizados no trabalho, podemos dizer que: em 
relação aos RFLPs, os RAPDs são mais baratos, requerem menor tempo e não 
necessitam de radioisótopos. No entanto, uma desvantagem dos RAPDs é sua 
natureza dominante (incapacidade de discriminar entre homozigotos e 
heterozigotos) e também o desconhecimento da localização das marcas no genoma. 
As bandas observadas no gel após a eletroforese são codificadas como presentes ou 
ausentes (1 e 0, respectivamente) em cada indivíduo. Isso leva a um baixo grau de 
polimorfismo para os RAPDs. Nesse sentido, os RFLPs e SSRs, sendo 
codominantes, fornecem maior polimorfismo e informações que os RAPDs. Ainda, 
comparativamente aos RFLPs, os microssatélites proporcionam 3 a 4 vezes mais 
polimorfismo ou informação. Entretanto, para o uso rotineiro dos microssatélites, 
há a necessidade de primeiro amplificar uma região, posteriormente sequenciá-la e 
em terceiro lugar, sintetizar os iniciadores específicos para cada loco. Uma vez feito 
isto, o loco marcador pode ser utilizado indefinidamente naquela espécie. Desta 
forma, existe um custo elevado e trabalho no início, mas o custo subsequente é 
baixo e a simplicidade a posteriori, é muito grande. 
 
2) Explique o que é e qual a importância do polimorfismo para um marcador 
molecular? 
As mutações no DNA ocorrem de diversas formas. Nesse sentido, a taxa 
média de mutação que ocorre naturalmente pode atingir 1x10-7. Ainda, Agentes 
químicos e físicos (radiações) são utilizados em laboratório para aumentar esta taxa. 
Neste contexto, uma mutação é dita silenciosa quando o codon é alterado, mas não 
muda o amino ácido codificado e consequentemente, não muda a cadeia peptídica. 
Ela é neutra quando, mesmo alterando o amino ácido, a proteína permanece com 
a mesma função. Aqui surge o conceito de polimorfismo a nível molecular: 
diferentes genótipos com o mesmo ou diferentes fenótipos. A mutação com o efeito 
mais crítico é aquela que provoca a inserção ou remoção de uma base (frameship). 
Como consequência, todos os codons localizados após a mutação ficam alterados, 
ou seja, a cadeia se torna diferente do padrão anterior. Sabe-se que, algumas 
mutações ocorrem naturalmente e as mutações mais comuns são aquelas de ponto, 
onde apenas uma base é alterada. Outras mutações com profundas implicações no 
fenótipo são aquelas decorrentes de deleções, adições, inversões e transposições. 
A possibilidade de identificação de um maior nível de polimorfismo por 
parte dos marcadores moleculares, permitem: a) a identificação de genes de 
resistência a doenças, insetos e pragas; b) melhoramento ou modificação genética 
de espécies vegetais e animais; c) determinação da fonte de amostras de DNA, 
como, por exemplo, em testes de paternidade ou na ciência forense, e entre outros. 
 
3) Quais os critérios que devem ser levados em consideração para optar por um 
determinado marcador molecular? Justifique. 
A escolha do marcador a ser utilizado depende de diversos fatores, como o 
tipo de estudo, as facilidades laboratoriais e os custos envolvidos. As características 
mais importantes a serem consideradas quando se comparam marcadores para um 
determinado estudo são a capacidade multiplex (número de locos amplificados em 
uma única reação), o número de alelos por locos e a proporção de locos 
polimórficos. A natureza dominante ou co-dominante do marcador também é 
crucial para alguns estudos. 
A escolha correta do marcador a ser utilizado implica na diminuição de 
custos e de tempo de processo e, bem como, na obtenção com sucesso (ou 
insucesso), do objetivo almejado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RERERÊNCIAS 
 
NODARI, R.O., GUERRA, M.P., DANTAS, A.C.M., STEFENON, V.M., TENFEN, 
S.Z.A., KLABUNDE, G.H.F. FIT 5806 – BIOTECNOLOGIAS - APOSTILA (v.2016). 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS 
AGRÁRIAS. 2016. 
ABAD, A.C.A., LOPES, F.A., PINHEIRO, J.W. MOTA, R.A. MARCADORES 
MOLECULARES E SUAS APLICAÇÕES NAS PESQUISAS EM BOVINOS. Acta 
Veterinaria Brasilica, v.8, n.1, p.10-18, 2014. 
FERRÃO, L.F.V., SOUZA, F.F., CAIXETA, E.T., ZAMBOLIM, E.M., ZAMBOLIM, L., 
SAKIYAMA, N.S. ESTUDO COMPARATIVO DO NÍVEL DE POLIMORFISMO E 
INFORMATIVIDADE ACESSADO PELOS MARCADORESRAPD, AFLP E SSR, 
NO ESTABELECIMENTO DE RELAÇÕES GENÉTICAS EM Coffea canephora. 
VII Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil, 22 a 25 de Agosto de 2011, Araxá - MG