3 - metodologias microbiológicas

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Metodologias aplicadas a 
microbiologia na analise clinica.
Introdução
• Diversos tipos de microrganismos estão 
no ambiente.
• Muitos deles adquirem resistência a 
varias substancias produzidas para 
combate-los.
Microrganismos multi-resistentes
Meios de cultura
• São substancias que fornecem tudo que é necessário 
para que o microrganismo se estabeleça e se 
multiplique In vitro.
• Todas as bactérias de interesse sanitário crescem bem 
em condições de laboratório em meios de cultura 
comuns.
• As técnicas de cultivo, isolamento e contagem exigem a 
manipulação de amostras contaminadas, meios de 
culturas e material de vidro estéreis e equipamentos 
diversos.
• Os meios de cultura são preparados industrialmente 
e são disponíveis no mercado desidratados, em pó. 
• Devem se ter cuidado no preparo de meios 
– Checar PH.
– Uso de agua destilada, bi-destilada ou ultra pura.
– Esterelização antes do uso.
• Em relação a sua composição química, os meios de 
cultura são considerados naturais e artificiais e 
básicos e complexos.
Meios de cultura naturais
• Usados na antiguidade
– origem vegetal (frutas, rodelas de batata)
– animal (ovos) 
– industrialização simples (pão). 
• Permitia a observação de microrganismos 
decompositores.
– (bolores, leveduras e bactérias, entre outros)
• Inespecifico, fácil contaminação por diversos 
microrganismos.
Meios de cultura artificiais
• possuem substâncias químicas definidas ou não 
e, em geral, são denominados de meios 
complexos.
– líquidos, 
– semissólidos 
– Sólidos
• Sua característica física depende da concentração 
de Agar-agar ou demais agentes solidificantes em 
sua composição.
Meios liquidos
• Crescimento disperso no volume do meio.
• Superficie com maior concentração de 
oxigênio.
• Crescimento microbiano visualizado 
– turbidez do tubo.
– Mudança de cor do meio.
– Produção de gás.
Crescimento microbiano em meio de 
cultura
• Não apresentam ingredientes solidificantes em sua composição.
• São fornecidos na forma em pó, quando adicionados de água são verdadeiros 
caldos.
• Podem ser usados como
– Reativadores de culturas microbianas (caldo lactosado)
– Seletivos para determinados microrganismos (Caldo verde Brilhante Billis 2%)
– Repiques de microrganismos (Caldo nutriente ou BHI)
– Provas bioquímicas no geral.
• Os Meios de Cultura Líquidos são distribuídos em tubos de ensaio e cobertos 
com tampa de metal ou tampão de algodão. Para detectar a produção de gás, 
coloca-se no interior do tubo um pequeno tubinho invertido (Tubo de Durham) 
e esteriliza-se o conjunto.
• Caldo lactosado • Caldo VB • Caldo BHI
Meios de cultura semissolidos
• Possuem o agente solidificante numa quantidade baixa
– 0,08%, 0,5% ou até 1%
• Consistencia intermediaria entre liquido e solido
• Permite diferentes concentrações de oxigênio
• Utilizada para testes de motilidade da cepa e para 
maior conservação de culturas puras.
• Conhecido como meio estoque. 
• Teste de motilidade
Meios de cultura sólidos
• Tem agente solidificante em sua composição 
variando de 1,5% a 2% 
• Microrganismos ficam presos na superfície do 
agar
• Possibilidade de ver microrganismos a olho nú.
• Permite estimar a quantidade aproximada de 
microrganismos numa amostra.
• Ex: Considerando que uma única célula de E. coli se multiplica a cada 
30 minutos sob condições ótimas de crescimento; em 24 horas, uma 
colônia teria 282 trilhões de bactérias (conglomerados de bactérias).
• Podem ser classificados em 3 tipos:
– Não seletivos: também denominados meios de cultura simples, permitem 
o crescimento de numerosas bactérias, capazes de se desenvolverem com 
esses nutrientes e em pH e temperaturas determinadas.
– Seletivos: são meios de culturas que incluem ou excluem algum 
ingrediente que favorecem o crescimento de um microrganismo 
determinado (por exemplo, a ausência de compostos de nitrogênio 
permitirá o desenvolvimento de bactérias fixadoras de N2 ). Meios 
seletivos são todos aqueles utilizados na confirmação bioquímica das 
bactérias
• De enriquecimento: contêm substâncias específicas para um 
determinado microrganismo ou grupo de 139 microrganismos, o 
qual favorece o seu desenvolvimento seletivo sobre o resto da 
biota microbiana. Por exemplo, a incorporação de Na2 SO4, em 
um ambiente anaeróbio de cultivo, enriquece o crescimento das 
bactérias redutoras do sulfato que utilizam esse composto no 
seu metabolismo como aceptor final de elétrons. A presença de 
ferro gera condições preferenciais para bactérias oxidantes do 
ferro se for um ambiente aeróbio, e de forma idêntica, a 
presença de enxofre, entre muitos outros elementos. Para as 
bactérias de interesse médico de difícil crescimento (fastidiosas), 
adicionam-se gema de ovo, sangue, plasma, soro e leite. 
• Facilita a identificação bacteriana ou de 
grupos bacterianos presentes no meio de 
cultura.
• Os meios de cultura são adquiridos prontos e 
desidratados, e são preparados seguindo as indicações 
dos fabricantes. 
• Os meios de cultura com ágar são preparados e 
esterilizados em balões de vidro.
• Distribuídos em placas de Petri estéreis, onde se deixam 
solidificar a temperatura ambiente.
• Preservam-se na geladeira em caixas plásticas bem 
fechadas para evitar seu ressecamento.
A semeadura é feita da seguinte 
forma...
• Condições de assepsia total.
• Usam-se alças descartáveis ou autoclavaveis para 
semeadura
• Ou gotejamento diretamente no meio de cultura.
• As amostras devem ser agitadas vigorosamente 
para auxiliar na quebra dos conglomerados 
bacterianos formados na amostra.
• Metodologia para inoculação por estrias 
(esgotamento) em placa de Petri para obtenção de 
colônias isoladas 
– 1. Agitar energicamente o tubo com a amostra. 
– 2. Esterilizar a alça bacteriológica na chama.
– 3. Abrir o tubo de ensaio com a suspensão bacteriana a ser 
semeada perto da chama e flambar suavemente a boca –
não esquentar demasiado que pode quebrar o vidro. Não 
deixar a tampa do tubo na bancada para não haver 
contaminação; este deve ficar na palma da mão, a mesma 
que sustenta a pipeta e apertando na parte superior com o 
dedo mínimo. Ao flambar, gera-se uma zona quente ao 
redor da boca do tubo que impede a entrada de 
microrganismos contaminantes do ar
– 4. Introduzir perto da chama a alça bacteriológica 
resfriada no tubo com a cultura, retirar a alça carregada; 
flambar a boca do tubo novamente, tampar o tubo e 
depositá-lo na grade suporte de tubos. Manter sempre 
a alça com o material na mão direita. 
– 5. Com a outra mão, abrir perto do fogo a placa de Petri 
que está na bancada de trabalho em posição invertida, 
com a base para cima. 
– 6. Estriar o cultivo para esgotamento (Figura 5). 
– 7. Fechar a placa de Petri, esterilizar a alça por calor na 
chama e colocar as placas na estufa bacteriológica.
• Em seguida é feita a incubação em estufa bacteriológica na 
temperatura indicada para o microrganismo analisado
• Cada colônia teoricamente se forma de uma única bactéria que 
ficou presa no agar e se reproduziu continuamente.
• Algumas bactérias ficam presas muito próximas e ao se 
multiplicar elas acabam juntando as colônias impossibilitando a 
analise.
• Para evitar isso se deve diluir a amostra em solução salina para 
diminuir a concentração de microrganismos presentes na analise 
e facilitar a leitura dos resultados.
Métodos de Quantificação
• Metodos diretos de quantificação
– Microscopio
– Contagem direta
– câmera de contagem
• Procedimento com câmera de newbawer.
– Microscopio
– Contagem direta
– Lamina com cavidades marcadas
– Quadrados de diferentes tamanhos porem 
gravados na lamina 
– Quantidade exata de amostra diluída
Procedimentos
• 1. Colocar a lamínula sobre a área marcada na câmara de 
contagem. As lamínulas são especiais e devem fornecer a 
profundidade correta da câmara de contagem. Não devem 
ser usadas lamínulas comuns que não proporcionarão o 
volume de 0,1mL. 
• 2. Homogeneizar bem asuspensão bacteriana e sob 
condições de assepsia, transferir 0,1 mL para um tubo de 
ensaio ou para um tubo eppendorf. 
• 3. Adicionar 0,3 mL de corante azul de tripano 0,2% ao 
tubo, obtém-se a diluição 1/4. O uso de microscópio de 
contraste de fase evita o uso de corantes. 
• 4. Misturar bem o tubo e retirar uma alíquota de 0,5 mL
com pipeta (recomenda-se usar pipeta automática). 
• 5. Deve-se encostar a ponta da pipeta na borda da 
lamínula e deixar escorrer suavemente o líquido da 
pipeta. Preencher cuidadosamente a câmara de 
contagem, a suspensão deve preencher apenas um 
lado da câmara e não deve atingir os canais de 
laterais da área de contagem. Deixar as células 
sedimentarem por 2 minutos.
• 6. Focalizar no microscópio a área 
demarcada da câmara de contagem com a 
objetiva de menor aumento (X 10).
• Contagem da área central com mais divisões 
• contagem das quatro áreas com menor divisão 
e dividir o valor por 4 para obter a media.
• Celulas nas linhas divisórias devem ser 
quantificadas
– Contudo deve-se quantificar células nas linhas 
inferior e esquerda apenas
– Celulas localizadas nas linhas superior e direita não 
devem ser quantificadas
• 7. A suspensão utilizada foi inicialmente diluída a 
1/4, portanto o número de células contadas será 
igual à média dos 4 campos ou áreas contadas e 
multiplicadas pelo fator de diluição que foi 4.
• 8. O cálculo é então o seguinte: 
– para obter o número de células/mL, deve-se multiplicar 
o valor obtido por 10.000, pois: 
– 1 mL = 1 cc
– 1 cc = 10 x 10 x 10 mm = 1.000 mm3 
– Na câmara de Neubauer, o número de células contadas 
está contido no volume de 0,1 mm3 , então se deve 
multiplicar por 10, portanto 10 x 1.000 = 10.000
Técnica de quantificação de tubos 
múltiplos
• Utiliza-se meios líquidos para cultivo.
• Maior chance de erro
• Teste probabilístico
• Cada diluição é inoculada repetidas vezes nas mesmas 
condições.
• Após incubação é verificada a a turbidez, a mudança de cor 
ou a produção de gás nos tubos indicando atividade 
bacteriana.
• O resultado vem a partir da combinação de 
tubos positivos de três diluições decimais 
consecutivas
• Utiliza-se uma tabela que indicará a 
densidade bacteriana por 100 mL de 
amostra.
Técnica de contagens em placa de 
petri
• Após estabilização dos microrganismos
• Utiliza-se Lupa para contagem
• Para a leitura, que deve ser cuidadosa se feita 
a olho nu, as colônias devem ser contadas 
com ajuda de uma lupa, pelo menos duas 
vezes cada placa. Placas não contadas no dia 
da leitura podem ser preservadas na geladeira 
entre 5 e 10o C, apenas por 24 horas. 
• Existem duas técnicas utilizadas para contagem 
em placa
– Pour plate: A técnica de “pour plate”, ou de vertido 
em placa, envolve a adição do meio de cultura 
fundido ao inóculo colocado previamente numa placa 
de Petri estéril. 
– Spread plate: A técnica de “spread plate”, ou de 
espalhamento em superfície, e consiste no 
espalhamento ou distribuição homogênea do inóculo 
da amostra na superfície do meio de cultura sólido e 
estéril. 
Resultados
• Os resultados são expressos como nº de colônias 
de bactérias/mL ou Unidades Formadoras de 
Colônias (UFC). mL-1; 
• Após a incubação, são escolhidas as placas de 
Petri com aproximadamente 30 a 300 UFC, e é 
feita a contagem do número de colônias com 
auxílio de um contador de colônias. 
Testes de sensibilidade aos 
antimicrobianos
Antibióticos
Mecanismos de resistência
 Mutações no DNA bacteriano
 Aquisição de plasmídios contendo genes de 
resistência
• Exemplos:
1) Produção de -Lactamases
2) Alterações ribossômicas
3) Alterações de permeabilidade da membrana celular da bactéria
4) Bomba de efluxo
Antibiograma
Finalidade
Avaliar in vitro a interação fármaco x bactéria
• Determinando a sensibilidade
• Concentração inibitória mínima Orientar o Tratamento
Microbiologia Clínica
Teste de sensibilidade - Métodos
• Kirby-Bauer: Difusão com disco (disco-difusão)
• Diluição em caldo (macro ou micro)
• E-test
Disco – difusão ou antibiograma
Princípio
• Qualitativo
• Baixo custo, Rapidez, Padronização e interpretação fácil
• Flexibilidade na escolha dos Antimicrobianos
• 12 antimicrobianos por placa
Princípio do Métodos
Disco-difusão 
Detecção de beta-lactamase (ESBL)
KPC – Klebsiella pneumoniae carbapenemase
Disco – difusão ou antibiograma
Interpretação e relato dos 
resultados
• Sensível: Dosagem habitual do antimicrobiano testado
inibe o crescimento bacteriano
• Intermediário: Concentrações maiores do que as usuais
podem inibir o microrganismo
• Resistente: Não é inibido
Princípio do Métodos
Disco-difusão - Ágar Mueller Hinton
Discos de papel filtro
Fatores de Influências: velocidade de difusão, ph 7,2 a 7,4, estocagem das placas, temperatura e
quantidade de ágar, inóculo bacteriano
Padrão de Turvação de Sulfato de Bário - Escala (0,5) de Macfarland
15 minutos após a colocação dos discos são invertidas e incubadas
Leitura dos halos 24 horas após incubação (Utilizar cepas padrão )
mm
Leitura e interpretação
Macrodiluição em caldo
• Os testes de sensibilidade são indicados para qualquer organismo que contribua a 
um processo infeccioso que justifique quimioterapia antimicrobiana, se sua 
sensibilidade não pode ser predita, de maneira confiável, a partir da identificação 
do organismo
• Deve-se selecionar colônias, isoladas em placas de ágar, de cada tipo de organismo 
que possa desempenhar um papel patogênico e testar sua sensibilidade
• Neste método podemos estimar:
• Concentração inibitória mínima (CIM): menor concentração da droga que inibe 
o crescimento microbiano. 
• Concentração bactericida mínima (CBM): menor concentração da droga que 
mata pelo menos 99,9% do inóculo microbiano. 
• Metodologia
– 1. Preparação dos tubos com as concentrações da 
droga; 
– 2. Preparação do inóculo (0,5 McFarland); 
– 3. Aplicação do inóculo nos tubos; 
– 4. Incubação em anaerobiose. 
• Vantagens 
– Custo mais efetivo; Fácil de ser executado; São 
úteis para isolados único. Pode ser determinada a 
CBM. Utilizado para microrganismos como 
Clostridium spp. (swarming). 
• Desvantagens 
– Dificuldade na determinação da CIM em 
microrganismo que não apresentam turbidez após 
crescimento (Dialister). Não é viável para muitos 
isolados.
Diluição em Ágar
• Na diluição em agar deve ser preparado 
previamente placas de petri com a substancia 
a ser testada diluida no meio de cultura.
• Metodologia
– 1. Preparação das placas com as concentrações da 
droga; 
– 2. Secagem das placas; 
– 3. Preparação do inóculo (0,5 McFarland); 
– 4. Aplicação do inóculo no replicador de Steers; 
– 5. Carimbar nas placas; 
– 6. Esperar secar. Incubação em anaerobiose.
• Vantagens 
– Várias cepas podem ser testadas ao mesmo 
tempo; Viável para todos os anaeróbios, mesmo 
os mais exigentes. 
• Desvantagens 
– Não é conveniente para apenas um isolado; CBM 
não pode ser determinado; Teste dispendioso e 
incômodo.
Microdiluição
• Microplacas onde são preparados meios com 
substancia antibiotica.
• Metodologia
– 1. Preparação da placa com as concentrações da 
droga; 
– 2. Preparação do inóculo (0,5 McFarland); 
– 3. Aplicação do inóculo com carimbador; 
– 4. Incubação em anaerobiose.
• Vantagens 
– Placas podem ser preparadas antecipadamente e 
congeladas ou serem compradas prontas; Viável 
para um único isolado ou vários. 
• Desvantagens 
– Não é favorável para crescimento de muitos 
anaeróbios (Fusobacterium, Porphyromonas, 
Prevotella); Dificuldade na determinação da CIM. 
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Etest®Difusão
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E-test - MIC
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Interpretação do E-test
Figura representativa de um E-TEST
Poder bactericida do soro (PBS)
Teste realizado para verificar o efeito antimicrobiano do soro de pacientes 
em uso de antimicrobiano a pelo menos 72 horas e com infecção grave.
Consiste em expor o microrganismo ao soro do paciente tratado com um 
determinado agente antimicrobianoe observar qual o comportamento do 
microrganismo em relação ao soro do paciente tratado.