Biologia Molecular IV

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BIOLOGIA 
MOLECULAR
Biologia Molecular – Parte IV
Livro Eletrônico
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Pollyana Lyra
Sumário
Apresentação .....................................................................................................................................................................3
Biologia Molecular – Parte IV ..................................................................................................................................4
Técnicas de Biologia Molecular para Diagnóstico de Doenças Humanas ......................................4
Histórico ................................................................................................................................................................................4
Eletroforese em Gel ........................................................................................................................................................6
Hibridização de Ácidos Nucleicos ..........................................................................................................................8
Clonagem de DNA ..........................................................................................................................................................16
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ...........................................................................................................19
Engenharia de DNA .....................................................................................................................................................27
Sequenciamento .............................................................................................................................................................31
Questões de Concurso ...............................................................................................................................................44
Gabarito ..............................................................................................................................................................................56
Gabarito Comentado ...................................................................................................................................................57
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ApresentAção
Caros estudantes, neste momento daremos início à nossa quarta aula de Biologia Molecu-
lar, na qual falaremos sobre as principais tecnologias de ácidos nucleicos que nos permitiram 
realizar diagnósticos precisos de diversas condições patológicas.
Aqui descobriremos como foi possível determinar as sequências de nucleotídeos dos 
fragmentos de DNA por técnicas moleculares altamente específicas. Preparado(a)? Então, va-
mos começar!
Profª. Pollyana Oliveira
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BIOLOGIA MOLECULAR – PARTE IV
técnicAs de BiologiA MoleculAr pArA diAgnóstico de doençAs HuMAnAs
Histórico
Calma, é curto!! Porém, é importante ver este breve histórico sobre o tema. Então... no iní-
cio dos anos 1970, foi possível isolar pela primeira vez um fragmento específico de DNA entre 
os muitos milhões de pares de nucleotídeos de um cromossomo típico. Isso possibilitou a 
criação de novas moléculas de DNA in vitro, introduzindo-as novamente em organismos vivos.
Obs.: � Estas técnicas foram denominadas de diversas maneiras, tais como “DNA-recombinan-
te”, “splicing de genes” e “engenharia genética”, e possibilitaram a criação de cromos-
somos com combinações genéticas que jamais poderiam ser formadas naturalmente.
É importante ir se acostumando com essas expressões americanizadas quando se estuda 
Biologia Molecular, pois, além de um vocabulário próprio, essa área herdou muitos termos es-
trangeiros que acabam aparecendo em provas.
Continunando...
Em conjunto, estas técnicas inovadoras são conhecidas como tecnologia de DNA-re-
combinante!!!
Ou seja... quando essas técnicas SE SOMAM... são chamadas de Tecnologia de DNA-Re-
combinante!
Isso acaba tendo um impacto na biologia molecular, pois permitiram que as células e suas 
macromoléculas pudessem ser estudadas de diferentes maneiras.
Imagina só... uma análise combinatória de genes resultando em produtos diversifica-
dos... rsrs
Coisa de doido!
Bom, elas também possibilitaram o nosso conhecimento atual da organização e história 
evolutiva de genomas complexos dos eucariotos, levando à descoberta de classes inteiras 
de genes e proteínas. Estas técnicas fornecem um novo modo de determinar as funções das 
proteínas e de domínios individuais dentro delas, revelando uma série de relações entre elas e 
isso acaba sendo ferramenta para revelar os mecanismos pelos quais a expressão gênica em 
eucariotos é regulada.
Veja algumas das aplicações da tecnologia de DNA recombinante para a vida humana:
• Detectar as mutações do DNA, que são responsáveis por doenças herdáveis;
• Na ciência forense, identificar e absolver possíveis suspeitos de um crime;
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• Produzir produtos farmacêuticos, incluindo a insulina para diabéticos e a proteína de 
coagulação do sangue Fator VIII, para hemofílicos;
• Outros produtos, como os detergentes, possuem proteases estáveis que digerem man-
chas de comida e material orgânico, assim como são obtidas por tecnologia de DNA.
Discutiremos mais adiante as técnicas básicas da análise de DNA, bem como as sequên-
cias de DNA podem ser isoladas e produzidas em larga escala pelas técnicas de clonagem de 
DNA e a reação em cadeia da polimease (PCR).
Parece complexo, né? E é! Não se engane.... se ajeite na cadeira aí, se concentre... que essa 
aula é a cereja do bolo da Bio Mol...
Bom, vamos pensar... se em uma amostra contendo diversas cópias idênticas da mesma 
molécula de DNA, cada molécula fosse fragmentada de forma diferente, produzindo um con-
junto de fragmentos ao acaso, como seria possível isolar e purificar um gene específico?
Difícil, né?
Isto é possível devido a uma classe de enzimas bacterianas conhecidas como nucleases 
de restrição.
Sabe o que ela faz? Catalisa a hidrólise de uma ligação fosfodiéster em um ácido nucleico, 
“cortando” o DNA em sítios específicos, determinados por uma curta sequência de nucleotíde-
os. As nucleases podem ser usadas para produzir um conjunto de fragmentos específicos do 
DNA no genoma.
É como se fossem tesouras moleculares que cortam sempre na sequência específica....
E que sequência é essa?
Normalmente são sequências curtas (4 a 8 pares de nucleotídeos) e ocorrem ao acaso em 
qualquer molécula longa de DNA.
Para quem acredita no “a caso”, né....
Desta forma, podem ser usadas para analisar DNA de qualquer origem. Estas nucleases 
são insumos importantes na tecnologia de DNA.Atualmente, estão listadas mais de 100 des-
sas enzimas, cada uma capaz de cortar uma sequência distinta do DNA.
A sua utilidade se justifica pelo fato de que uma determinada nuclease sempre “cortará” 
uma determinada molécula de DNA exatamente nos mesmos sítios.
EXEMPLO
Por exemplo, em uma amostra de DNA de tecido humano, o tratamento com uma nuclease de 
restrição sempre produzirá o mesmo conjunto de fragmentos de DNA. Deste modo, as sequên-
cias-alvo das nucleases de restrição variam em relação à frequência com a qual elas ocorrem 
no DNA, o que possibilita a clivagem de longas moléculas de DNA em fragmentos com tama-
nhos que possam ser adequados para cada aplicação em particular.
Depois que uma grande molécula de DNA é clivada em pequenos pedaços utilizando uma 
nuclease de restrição específica, os fragmentos precisam ser separados uns dos outros. Isto é 
possível usando a eletroforese em gel, primeira técnica que vamos abordar.
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eletroforese eM gel
Aqui, você vai pensar assim: tenho milhares de retalhos de DNA misturados e quero sepa-
rá-los... a separação pode ser feita por corrente elétrica dependendo da carga do fragmento...
Agora, vamos à fundamentação teórica.
Os ensaios de eletroforese se valem do princípio que determina que a carga global de uma 
fita de DNA é negativa. Portanto, uma solução que possua íons livres (eletrolítica) e que tenha 
moléculas de DNA em suspensão pode ser purificada aplicando uma certa voltagem. Ao final 
do processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao cátodo (positivo), atraente de moléculas 
de carga negativa.
No entanto, o foco da técnica é separar os fragmentos por tamanho, uma vez que a reação 
gera fragmentos de mesma extensão. A solução é “peneirar” o resultado da PCR por “peneiras” 
moleculares. As cadeias são “empurradas” através da peneira pela corrente elétrica e, con-
forme o tamanho dos seus poros, elas serão retidas ou liberadas. Na verdade, nos valemos 
do fato de que cadeias maiores demoram mais tempo para passar pelos poros da “peneira”, 
e cadeias menores viajam mais rapidamente através dela. A distância que o fragmento per-
correu a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de 
tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os marcadores de 
tamanho molecular (Ladders = Escadas), que são misturas de trechos de DNA com tamanhos 
variáveis, normalmente equidistantes entre si.
EXEMPLO
Por exemplo, um Ladder de 50bp significa, na prática, que ele mostrará várias bandas, cada 
uma maior 50 pares de base do que a anterior (50bp, 100bp, 150bp, 200bp, 250bp e assim por 
diante).
Existem dois modelos básicos de eletroforese: baseada em géis de agarose ou em géis 
de poliacrilamida. As duas substâncias formam tramas de poros de tamanhos variáveis, pos-
sibilitando a separação dos fragmentos, que terá sua eficiência dependente da concentração 
do polímero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicada. Em qualquer um dos casos, 
essas substâncias são dissolvidas numa solução-tampão eletrolítica, obrigatoriamente a mes-
ma que recobrirá o gel na cuba de eletroforese e possibilitará a passagem de corrente elétrica 
(Tampão de Corrida). Para eletroforese de DNA, normalmente, utiliza-se o TBE (Tris-Borato 
EDTA) e o TAE (Tris-Acetato EDTA).
Quanto à aplicação das amostras no gel, é importante ressaltar que, antes disso, elas são 
misturadas a uma outra (Tampão de amostra), cuja função é aumentar a viscosidade da amos-
tra e, dessa forma, impedir que esta comece a flutuar no tampão de corrida antes que a vol-
tagem seja aplicada no sistema. Além disso, o tampão de amostra possui um corante, que 
possibilita a visualização do andamento da corrida. Usualmente, pode-se utilizar uma mistura 
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de Azul de Bromofenol (Corante), Xileno-Cianol e Glicose, que aumentam a viscosidade, dissol-
vidos no tampão de corrida apropriado para cada reação. Apesar da sua versatilidade e relativo 
baixo nível de dificuldade de realização, a eletroforese convencional tem a desvantagem de 
identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho, e não quanto à sequência.
Agarose – polissacarídeo em forma de pó. Quando suspenso em solução aquosa e aqueci-
do, dissolve-se completamente, solidificando-se vagarosamente conforme a temperatura cai. 
Enquanto está em forma líquida, é colocado num molde que lhe dará o formato de um bloco 
quando resfriar. Enquanto isso, são feitos pequenos furos (poços) em uma das suas extremi-
dades, perpendicularmente ao seu comprimento com o uso de um “pente”; formando os poços 
que receberão o produto da PCR.
Aplica-se uma voltagem entre as extremidades do gel que varia entre 10 e 200V, e corrente 
de 50 a 3000mA. São utilizadas concentrações de 0,5 a 3% de agarose no gel. Quanto maior a 
concentração, maior a sua capacidade de distinguir fragmentos de tamanhos próximos, fator 
denominado definição.
EXEMPLO
Por exemplo, um gel de agarose a 1% pode separar fragmentos com uma diferença de tama-
nho de 80 pares de bases, enquanto a 2,5% pode-se separar fragmentos com diferença de no 
mínimo 30 pares de bases.
A visualização dos produtos no gel após a corrida se dá pela reação de ligação do DNA 
com Brometo de Etídio (EtBr). Este composto tem a capacidade de se intercalar nas fendas da 
cadeia de DNA e apresenta fluorescência quando excitado com radiação ultravioleta. Pode-se 
adicionar o EtBr (10µg/mL) no gel liquefeito antes da corrida ou levar o bloco a uma solução de 
EtBr com a mesma concentração e deixar descansar por alguns minutos.
Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose. As bandas com maior peso molecular ficam na 
parte superior do gel e as bandas com menor peso, na parte inferior.
Fonte: Modificada e traduzida de Portal Embrapa.
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EXEMPLO
Exemplo de Aplicação
A leitura do gel de agarose é um dos trabalhos do analista de laboratório que atua em Biologia 
Molecular... e veja só que honra! Eu executo esse trabalho atualmente!! E no caso da aplica-
ção em questão (tipagem HLA para exames pré-transplantes)... após a leitura em sala escura 
e análise do padrão de positividade dessas bandas, utilizamos software com algoritmo que 
“traduz” a combinação lida em um tipo HLA específico....
Vamos para outra técnica?
HiBridizAção de Ácidos nucleicos
Identificar e medir proteínas específicas em misturas biológicas complexas, como o san-
gue, são objetivos importantes na prática científica e diagnóstica. A identificação de genes 
anormais no DNA genômico é cada vez mais importante na investigação clínica e no aconse-
lhamento genético.
Várias técnicas de blotting são usadas para identificar proteínas únicas ou sequências de 
ácidos nucleicos. Elas foram desenvolvidas para seremaltamente específicas e sensíveis e se 
tornaram ferramentas importantes em biologia molecular e na pesquisa clínica.
Princípio Geral
Os métodos de blotting são bastante simples e, geralmente, consistem em quatro etapas distintas:
1) separação eletroforética de proteínas ou de fragmentos de ácidos nucleicos na amostra;
2) transferência e imobilização em papel;
3) apoio, suporte e ligação da sonda analítica à molécula-alvo no papel;
4) visualização da sonda ligada.
As moléculas em uma amostra são, primeiramente, separadas por eletroforese e, em 
seguida, transferidas para um meio de suporte, ou membrana. Isso imobiliza a proteína ou 
fragmentos de DNA, fornece uma réplica da separação original e facilita a análise bioquímica 
subsequente.
Depois de ser transferida para o meio de suporte, a proteína imobilizada ou fragmento áci-
do é localizado pelo uso de sondas, como anticorpos ou DNA, que se ligam especificamente à 
molécula de interesse. Por fim, a posição da sonda que está ligada à molécula-alvo imobilizada 
é visualizada, geralmente por autorradiografia.
Três técnicas principais de blotting foram desenvolvidas e são comumente chamadas de 
Southern, Northern e Western blotting:
• Southern blotting permite que fragmentos de DNA sejam identificados com sondas de 
DNA, que hibridizam por pontes de hidrogênio a fragmentos complementares de cro-
mossomos.
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• Northern blotting permite que moléculas individuais de RNA mensageiro (mRNA) sejam 
identificadas e medidas após a hibridização com suas sequências complementares de 
DNA (as sequências de DNA das quais o mRNA foi transcrito).
• Em contrapartida, o Western blotting permite que determinadas proteínas sejam identi-
ficadas por meio de anticorpos específicos, como sondas analíticas.
DICA
Pense em um conteúdo que cai em provas... então, é este!
Northern e Southern Blotting
Um pré-requisito para Northern e Southern blotting é a disponibilidade de DNA clonado ou 
sintético, ou seja, sequências de DNA que possam ser usadas como sondas para o gene de 
interesse. Southern blotting é uma técnica de hibridização de DNA.
EXEMPLO
Esta técnica é frequentemente usada para identificar, por exemplo, a localização de um único 
gene no DNA cromossômico.
Antes que a análise de Southern blotting possa ser realizada, fragmentos de DNA devem 
ser produzidos a partir de cromossomos por digestão enzimática com endonucleases de res-
trição. Essas enzimas são obtidas de microrganismos e digerem o DNA de fita dupla em sítios 
de clivagem determinados pela sequência do ácido nucleico.
Como as endonucleases de restrição clivam apenas DNA, esses locais de clivagem pro-
duzem um número de fragmentos de um único comprimento específico de DNA. Variantes 
alélicas de um determinado gene podem ser detectadas se as diferenças na sequência do 
ácido nucleico incluírem os sítios de clivagem, pois digestão pela enzima de restrição apro-
priada produzirá diferentes fragmentos de genes alélicos. Mutações podem resultar na perda 
de sítios de clivagem ou na introdução de locais de clivagem adicionais. Estas diferenças nos 
fragmentos produzidos a partir de um gene são referidos como polimorfismos de comprimen-
to do fragmento de restrição (RFLPs).
Após a digestão enzimática do DNA cromossômico, os fragmentos de DNA resultantes são 
submetidos à eletroforese em agarose, que separa os fragmentos de acordo com o tamanho, 
e os fragmentos menores de DNA migram para mais longe do campo elétrico. O gel é, então, 
coberto com uma folha de nitrocelulose, sobre o qual o DNA é absorvido. Antes da hibridação, 
uma leve desnaturação em solução alcalina garante que o DNA no blotting esteja em fita sim-
ples. A folha de nitrocelulose é, aqui, incubada com a sonda do gene, geralmente DNA clonado. 
A sonda do gene é marcada com rádio e hibridizada por pontes de hidrogênio aos fragmentos 
de DNA cromossômico de fita simples que contêm sequências de ácidos nucleicos comple-
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mentares. Em seguida, a folha de nitrocelulose é seca e coberta por um filme fotográfico ou de 
raios X para permitir a localização do gene em estudo.
Northern blotting envolve essencialmente o mesmo processo descrito acima, exceto que o 
DNA complementar é usado para sondar o RNA. O RNA mensageiro é, primeiramente, separa-
do de acordo com o seu tamanho por eletroforese e, em seguida, transferido para os papel an-
tes que as sondas genéticas usam para localizar a mensagem de interesse. Com este método, 
as transcrições de genes específicos podem ser estudadas e medidas.
Figura 2 – Técnica de Northern blotting. Etapas: isolamento do RNAm do RNA total; extração 
de RNA (total ou o RNAm+poli-A); blotting (borrão) na membrana de nylon ou nitrocelulose; imo-
bilização do RNA na membrana; preparo da sonda de hibridização; hibridização da sonda com a 
membrana de nylon; detecção da hibridização por radioatividade ou quimioluminescência.
Fonte:Traduzida de MyBioSource.
Western Blotting
Os anticorpos específicos contra a proteína em estudo são necessários na técnica de Wes-
tern blotting.
EXEMPLO
As fontes desses anticorpos podem ser amostras de soro, por exemplo, de pacientes com 
infecções conhecidas, ou preparações de anticorpos policlonais purificados.
A interação de anticorpos e a proteína alvo (o antígeno), quando imobilizada em um supor-
te de papel, pode ser identificada com anticorpos. A mistura contendo a proteína sob investi-
gação é, primeiramente, separada em seus componentes por eletroforese em géis de poliacri-
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lamida e, em seguida, as proteínas são transferidas para o papel de nitrocelulose. O anticorpo 
primário se liga à sua proteína alvo e é imobilizado no suporte de blotting. O complexo antíge-
no-anticorpo pode, então, ser identificado com anticorpos contra os anticorpos primários, que 
são marcados com iodo radioativo, possibilitando serem visualizados por autorradiografia.
Figura 3 – Té nica de Western blotting. Etapas: extração e quantificação das proteínas; eletro-
forese em gel de poliacrilamida; transferência das proteínas para uma membrana; incubação da 
membrana com um anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada.
Fonte: Traduzida de MyBioSource.
Aplicações Diagnósticas das Técnicas de Blotting
Os polimorfismos de DNA foram identificados pela primeira vez no gene da globina II da 
hemoglobina. Desde então, as sondas de DNA têm sido usadas cada vez mais em investigação 
médica, em especial para identificar genes associados a doenças genéticas.
Os polimorfismos de comprimento dos fragmentos de restrição foram encontrados na do-
ença de Huntington, na anemia falciforme, na doença renal policística e na fibrose cística. Na 
investigação de doenças com transmissãogenética, como doença cardíaca isquêmica, foram 
utilizadas sondas de DNA com resultados elucidativos.
Tais investigações melhoraram, portanto, a nossa compreensão de muitas doenças, bem 
como a nossa capacidade de diagnosticar algumas delas antes do desenvolvimento dos sinto-
mas. Além disso, o diagnóstico pré-natal tem grande potencial em aconselhamento genético e 
já está sendo aplicado a condições como as distrofias musculares de Duchenne e de Becker.
Southern blotting também tem sido aplicado à investigação de doenças malignas.
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EXEMPLO
Por exemplo, carcinoma hepatocelular, um dos cânceres mais comuns no mundo, é reconheci-
do há anos como associado à infecção pelo vírus da hepatite B.
As técnicas de blotting mostraram que o DNA do vírus da hepatite B é incorporado ao ge-
noma de ambas as linhagens celulares de carcinoma hepatocelular e tumores.
Essas informações aumentam a nossa compreensão da carcinogênese e nos levam a bus-
car melhorias para o tratamento e prevenção destes tipos de câncer.
Figura 4 – Detecção de fragmentos específicos de DNA por Southern blotting. A mistura de 
fragmentos de DNA de dupla fita gerados pelo seu tratamento com nucleases é separada de 
acordo com o peso molecular na eletroforese. Uma folha de papel de nitrocelulose ou papel de 
nylon é colocado sobre o gel, e os fragmentos de DNA separados são transferidos para a folha 
pelo blotting. O gel é mantido em um suporte de esponja em um banho de solução alcalina, e 
o tampão é sugado através do gel e do papel de nitrocelulose pelo papel toalha empilhado em 
cima da nitrocelulose. À medida em que o tampão é absorvido, os fragmentos de fita simples 
são transferidos do gel para a superfície da folha de nitrocelulose, onde se adere firmemente. 
Esta transferência é necessária para manter o DNA firme no local onde a hibridização acontece. 
A folha de nitrocelulose é cuidadosamente retirada do gel. A folha contendo a banda corres-
pondente ao DNA de fita simples está dentro de um saco plástico selado, contendo tampão, e a 
sonda de DNA marcado radioativamente, específica para a sequência de DNA desejada. A folha 
é exposta por um longo tempo à sonda sobre condições favoráveis de hibridização. A folha re-
movida do saco é lavada rigorosamente, ficando retido no papel apenas o DNA hibridizado com 
a sonda. Depois de ser autorradiografado, o DNA que está hibridizado com a sonda aparecerá 
como bandas na autoradiografia.
Fonte: Traduzida de Microbe Notes.
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Limitações
Como nem tudo é perfeito... assim como a imensa maioria das técnicas laboratoriais, es-
ses testes possuem algumas limitações...
A utilidade desses testes depende da ligação genética quando o local exato do gene anor-
mal é desconhecido. As sondas normalmente detectam sequências de ácidos nucleicos pró-
ximas, e não sequências dentro do gene afetado. Como a recombinação de “troca” ocorre 
entre genes de cromossomos pareados em cerca de 5% das amostras, o marcador da sonda 
não estará mais fisicamente associado ao gene anormal, resultando em uma probabilidade de 
detectar o transporte do gene de apenas 95%. A precisão deste método obviamente varia, de-
pendendo da proximidade da sequência do ácido nucleico que está sendo identificado no gene 
em estudo. Logo, quanto maior a distância, maior a probabilidade de erro. Tal limitação não se 
aplica a sondas para genes já conhecidos.
Um outro problema potencial ao aplicar essas técnicas para doenças hereditárias é a de 
genes heterogêneos para distúrbios clinicamente semelhantes. Por isso, informações relativas 
ao prontuário de um paciente são essenciais para a análise precisa de certas doenças, como 
doença maníaco-depressiva autossômica dominante, sobre a qual se tem ciência de que exis-
te heterogeneidade genética.
Northern blotting, que utiliza sondas de DNA que hibridizam com sequências de RNA com-
plementares, é uma ferramenta ideal para estudar os produtos da transcrição gênica.
EXEMPLO
Por exemplo, a superexpressão de certas proteínas em células neoplásicas pode ser exami-
nada para determinar se o aumento é causado pela amplificação do gene (um aumento no 
número de genes), que é regulado em um nível de transcrição devido à desrepressão do gene 
(onde um gene resulta em aumento do mRNA), ou é devido a mecanismos pós-transcricionais, 
como excreção celular reduzida.
A amplificação gênica tem se mostrado responsável pela resistência adquirida a drogas 
em células tumorais em pequenos carcinomas celulares, onde a resistência ao metotrexato é 
conferida pela amplificação do gene para diidrofolato redutase. Foi demonstrado in vitro que a 
resistência a múltiplas drogas, conferida pelo gene de resistência a múltiplas drogas (MDR-1), 
está associada ao aumento do RNA em tumores.
Western blotting é amplamente utilizado em pesquisa. Proteínas individuais de uma mistu-
ra de proteínas como plasma ou outros fluidos corporais podem ser identificados e, depois, es-
tudados mais profundamente removendo o anticorpo marcador, tornando a técnica uma ferra-
menta poderosa. Ela tem tido ampla aplicação principalmente em pesquisas sobre a síndrome 
da imunodeficiência adquirida. O método permite que amostras de soro de pacientes sejam 
rastreadas para anticorpos contra uma variedade de antígenos virais. Ele usa os anticorpos no 
soro como “sondas” para mostrar a presença de antígenos virais conhecidos que foram exe-
cutados em uma tira eletroforética. Por meio de antissoros positivos, antígenos de diferentes 
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fontes podem ser estudados e identificada a reatividade cruzada. Desta forma, o HIV-I e HIV-II 
podem ser detectados e diferenciados. A especificidade do Western blotting também é usada 
para confirmar resultados positivos do ensaio imunoenzimático (ELISA) para o vírus da AIDS, 
reduzindo assim os riscos de encontrar resultados falsos positivos.
EXEMPLO
A técnica tem sido aplicada a outras doenças virais, incluindo a hepatite B, assim como pode 
ser usada, por exemplo, para testar a produção de anticorpos no soro de pacientes vacinados 
com vacinas sintéticas.
Western blotting também pode servir ao estudo da química de proteínas aplicada a áreas 
como enzimologia e oncologia.
EXEMPLO
Por exemplo, para encontrar diferentes isoenzimas e seu padrão de distribuição em tecidos 
saudáveis.
Da mesma forma, a identificação e localização de marcadores tumorais dentro de mate-
riais neoplásicos podem ser facilmente obtidos com o antissoro.
Hibridização in situ
Técnicas nas quais sondas de ácidos nucleicos são usadas foram desenvolvidas para lo-
calizar sequências específicas de ácidos nucleicos enquanto ainda são parte do cromossomo. 
A técnica chamada hibridização in situ pode ser utilizada para detectartanto sequências em 
cromossomos quanto de RNA nas células. Na primeira aplicação, sondas de ácidos nucleicos 
marcadas com corantes fluorescentes ou isótopos radioativos são hibridizados com os cro-
mossomos inteiros que foram rapidamente expostos a um pH muito alto para separar as duas 
fitas de DNA. As regiões cromossômicas que ligam as sondas marcadas podem ser então 
visualizadas.
A hibridização in situ também pode revelar a distribuição de um determinado RNA nas célu-
las de um tecido. Esta técnica levou a grandes avanços no conhecimento do desenvolvimento 
embrionário, tornando mais facilmente visível as alterações nos padrões de expressão dos 
genes que ocorrem nas diferentes células do embrião.
A maioria dos genes possui uma família de parentes próximos em algum lugar do genoma, 
muitos dos quais provavelmente possuem funções relacionadas. Uma vez que um membro da 
família gênica tenha sido isolado, outros membros da família podem ser isolados com relati-
va facilidade pelo uso das sequências do primeiro gene com sondas de hibridização de DNA. 
Membros diferentes de uma família de genes não possuem sequências idênticas, por isso a 
hibridização é feita em condições que detectem um pareamento imperfeito entre a sonda e o 
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seu DNA correspondente para formar uma dupla hélice estável. Esta estratégia pode permitir 
que um gene de uma espécie seja isolado usando sondas derivadas dos genes corresponden-
tes de uma outra espécie mais acessível experimentalmente.
Como alternativa aos exames bacteriológicos tradicionais, vários métodos de diagnóstico 
in situ, utilizando anticorpos ou sondas de oligonucleotídeos, estão sendo desenvolvidos para 
detecção de patógenos específicos.
Hibridização fluorescente in situ (FISH) é um método histoquímico que permite a visuali-
zação, identificação, enumeração e localização simultânea de microrganismos in situ, sem a 
necessidade de cultivos celulares. É um método que consiste na visualização direta em mi-
croscópios óticos fluorescentes em cortes histológicos. Também permite que sequências de 
ácidos nucleicos sejam examinadas no interior de células sem alterar sua morfologia ou inte-
gridade de seus compartimentos. Com isso, há a combinação da precisão da genética mole-
cular com a informação visual do microscópio ótico.
No procedimento histoquímico da FISH, o princípio básico é o anelamento da sonda com a 
sequência alvo, para a visualização em microscópio fluorescente. Entende-se por sonda, uma 
sequência de oligonucleotídeos complementares e específicos marcados com substâncias 
fluorescentes os quais se anelarão ao alvo. Há duas possíveis marcações das sondas, a direta 
e a indireta. O processo mais utilizado, por ser mais rápido e de fácil execução, é a marcação 
direta. Um ou mais fluorocromos são diretamente conjugados às sondas que se ligam nas regi-
ões 5’ ou 3’ do alvo. A marcação indireta pode aumentar a sensibilidade ligando uma molécula 
de digoxigenina à sonda. Em etapa subsequente, ocorre ligação de anticorpo conjugado com 
fluorocromo a esta digoxigenina. Processo alternativo à técnica indireta seria a utilização de 
amplificação do sinal por reação enzimática, usando peroxidase em substituição ao fluorocro-
mo semelhante às etapas finais de uma coloração por imuno-histoquímica. A FISH tem quatro 
procedimentos básicos:
1) fixação e permeabilização da amostra;
2) hibridização;
3) lavagem para remoção das sondas em excesso; e,
4) detecção pela microscopia fluorescente.
Antes da hibridização, as amostras contendo os microrganismos são fixadas para proteger 
o RNA da degradação de RNAses endógenas e permeabilizadas para permitir que as sondas 
penetrem na célula. As sondas utilizadas em FISH são, geralmente, oligonucleotídeos entre 15 
e 30 bases com única molécula fluorescente ligada covalentemente ao 5’-terminal.
A FISH tem uma grande variedade de aplicações dentro de diferentes campos de investi-
gação, incluindo análise de danos cromossomais, mapeamento genético, toxicologia molecu-
lar, genômica comparativa, biologia evolutiva, ecologia microbiana e diagnóstico de doenças. 
Além disso, pode ser aplicada em detecção de microrganismos em ambientes complexos, 
como microbiota intestinal, cavidade oral, infecções do trato respiratório, hemoculturas, sim-
bioses e em estações de tratamento de água.
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clonAgeM de dnA
O termo clonagem de DNA é utilizado em dois sentidos distintos:
1) refere-se ao ato de produzir diversas 
cópias idênticas de uma molécula 
de DNA.
2) refere-se ao isolamento de um determinado 
segmento de DNA ou um gene específico do resto 
do DNA de uma célula, uma vez que este isolamento 
é facilitado pela produção de diversas cópias 
idênticas do DNA de interesse.
Como vimos nas aulas anteriores, a enzima DNA-ligase sela novamente os cortes na estru-
tura do DNA que surgem durante a replicação e o reparo do DNA. Esta enzima se tornou uma 
das ferramentas mais importantes na tecnologia do DNA-Recombinante, pois ela permite a 
ligação de quaisquer fragmentos de DNA.
Uma vez que duas moléculas de DNA tenham sido unidas pela ligase, a célula não pode 
detectar que os dois DNAs eram originalmente separados e tratarão o DNA resultante como 
uma única molécula. Caso este novo fragmento de DNA seja introduzido no DNA da célula 
hospedeira, ele será replicado e transcrito como se fosse uma parte original do DNA da célula.
Em muitas aplicações da tecnologia de DNA, é necessário clonar um fragmento de DNA, 
geralmente um gene. O mais simples é introduzir o DNA a ser copiado em uma bactéria de di-
visão rápida; cada vez que esta bactéria replicar seu próprio DNA, ela também gera cópias do 
DNA introduzido. A fim de manter o DNA transfectado na célula bacteriana, um plasmídeo ou 
genoma viral é usado como transportador ou vetor. Um típico vetor de clonagem plasmidial é 
uma pequena molécula de DNA circular de vários milhares de pares de nucleotídeos. O vetor 
deve conter uma origem de replicação, que permita que ele se replique na célula bacteriana 
independentemente do cromossomo bacteriano. Também é necessário um sítio de clivagem 
da nuclease de restrição, para que o plasmídeo possa ser aberto e o novo fragmento de DNA 
inserido. O plasmídeo também contém um gene para alguma propriedade selecionável, como 
a resistência a antibióticos, possibilitando que a bactéria recombinante seja identificada.
Existem dois grupos básicos de plasmídeos:
•	 Plasmídeos conjugativos: contém um 
operon denominado tra que contém 
genes envolvidos na transferência do 
plasmídeo para uma outra célula, por 
meio da conjugação.
•	 Plasmídeos não conjugativos: são incapazes 
de iniciar a conjugação e, por esse motivo, 
não há movimento independente para outra 
bactéria, mas podem ser transferidos com 
plasmídeos conjugativos durante a conjugação
Existem cinco classes principais de plamídeos:
Plasmídeos de fertilidade (F), que contém apenas tra-genes. A sua única função é a inicia-
ção da conjugação bacteriana.
Plasmídeos de resistência (R), que contém genes que os tornam resistentes a antibióticos 
ou venenos.
Col-plasmídeos, que contém genes que codificam colicinas,proteínas que podem matar 
outras bactérias (toxinas bacterianas).
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https://pt.wikipedia.org/wiki/Conjuga%C3%A7%C3%A3o_bacteriana
https://pt.wikipedia.org/wiki/Antibi%C3%B3tico
https://pt.wikipedia.org/wiki/Veneno
https://pt.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADntese_prot%C3%A9ica
https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Colicina&action=edit&redlink=1
https://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna
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Plasmídeos degradativos, que permitem a digestão de substâncias pouco habituais, como 
o toluol ou o ácido salicílico.
Plasmídeos de virulência, que transformam a bactéria num agente patogênico.
Numa única célula podem coexistir vários tipos diferentes de plasmídeos. A E. coli, por 
exemplo, tem até sete. Dois plasmídeos podem ser incompatíveis, e a sua interação resulta na 
destruição de um deles. Os plasmídeos podem, portanto, ser colocados em “grupos de incom-
patibilidade”, que dependem da sua capacidade de coexistir numa única célula.
Para inserir o DNA a ser clonado, o plasmídeo purificado é submetido a uma nuclease de res-
trição que o cliva em um único local, e o fragmento de DNA a ser clonado é covalentemente inse-
rido nele usando a DNA-ligase. A molécula de DNA-Recombinante é introduzida em uma bactéria 
(E. coli, por exemplo) pela transformação. A bactéria cresce em solução nutritiva, onde duplica a 
cada 30 minutos. Cada vez que a duplicação ocorre, o número de cópias da molécula de DNA-
-Recombinante também se duplica, produzindo centenas de milhões de cópias do plasmídeo. As 
bactérias são, então, lisadas, e os DNAs plasmidiais muito pequenos são purificados do restante 
do conteúdo celular. O DNA plasmidial purificado conterá milhões de cópias do fragmento original 
do DNA. Este fragmento de DNA poderá ser recuperado cortando-o do DNA plasmidial por meio 
de uma enzima de restrição e separando-o do resto do DNA plasmidial por eletroforese em gel.
Figura 5 – Tecnologia do DNA recombinante.
Fonte: Educação Globo.
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Acabamos de ver como qualquer fragmento de DNA pode ser produzido em 
grande quantidade. Mas num genoma com cerca de 60.000 genes, como um 
determinado gene humano é isolado pela clonagem?
Para isto, o DNA total extraído de uma amostra de tecido ou de uma cultura de células 
humanas é clivado em um conjunto de fragmentos pela fragmentação mecânica realizada ao 
acaso ou pelo tratamento com nucleases de restrição. O conjunto dos fragmentos de DNA 
clonados obtido é conhecido como biblioteca de DNA ou biblioteca genômica, uma vez que os 
fragmentos de DNA são derivados do DNA genômico.
O DNA humano é inicialmente clivado por uma nuclease de restrição, que produz milhões 
de fragmentos distintos de DNA. Esta mistura de fragmentos é inserida em vetores plasmidiais 
em condições que favoreçam a inserção de um fragmento de DNA em cada molécula do plas-
mídeo. Estes plasmídeos recombinantes são misturados com a cultura de E. coli na concen-
tração que possibilite somente uma molécula de plasmídeo ser incorporada por uma bactéria. 
Se as colônias derivadas de uma única bactéria são isoladas em placas de Petri, cada colônia 
bacteriana representará um clone de um fragmento específico do DNA humano.
Como, então, seria possível encontrar apenas um determinado fragmento de DNA na am-
pla biblioteca de DNA humano?
Uma pequena quantidade de uma determinada proteína purificada e diversos fragmentos 
pequenos de sua sequência de aminoácidos são obtidos pelo sequenciamento da proteína. 
Por meio da aplicação do código genético ao contrário, as sequências de DNA que codificam 
estes aminoácidos podem ser deduzidas, e uma sonda de DNA apropriada pode ser preparada 
por síntese química. Com esta sonda, os clones bacterianos raros contendo o DNA humano 
complementar à sonda podem ser identificados por hibridização do DNA.
O DNA da biblioteca de DNA complementar (cDNA) não é genômico (cromossomial), mas 
sim copiado dos mRNAs presentes em um determinado tecido ou cultura de células. Para 
preparar uma biblioteca de cDNA, o mRNA total é extraído das células e cópias de DNA cha-
madas de cDNA das moléculas de mRNA são produzidas pela enzima transcriptase reversa. 
As moléculas de cDNA são clonadas para produzir a biblioteca de cDNA. Com esta biblioteca 
é possível isolar a sequência codificante completa de um determinado gene sem os íntrons.
Clones genômicos representam uma amostra ao acaso de todas as sequências encon-
tradas nos genomas, e contêm, na maioria das vezes, as mesmas sequências, independente-
mente do tipo de célula da qual o DNA se originou. Clones genômicos de eucariotos contêm 
sequências repetitivas de DNA, íntrons, regiões regulatórias, DNAs espaçadores e sequências 
codificadoras de proteínas. Já os clones de cDNA contêm apenas sequências codificantes e 
genes que foram transcritos em mRNA nos tecidos dos quais o RNA proveio. Como vimos, as 
células de tecidos diferentes produzem conjuntos distintos de mRNA, por isso, uma biblioteca 
distinta de cDNA será obtida para cada tipo tissular. Os padrões de expressão gênica são alte-
rados durante o desenvolvimento, e as bibliotecas de cDNA são construídas para refletir genes 
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expressos por células em estágios diferentes do desenvolvimento. A maior das vantagens dos 
clones de cDNA é que eles possuem sequências codificantes não interrompidas do gene.
reAção eM cAdeiA dA poliMerAse (pcr)
Vamos à famosa PCR... tão falada em tempos de pandemia....
A invenção da reação em cadeia da polimerase (PCR) por Kary B. Mullis na década de 1980 
foi um dos eventos mais relevantes da biologia molecular. Sua influência é comparável à des-
coberta da estrutura de dupla hélice do DNA ou à clonagem de DNA.
Diversas vertentes desta elegante abordagem para promover a replicação do DNA em es-
cala exponencial e sequência específica in vitro abriu novas possibilidades de investigação 
científica e revolucionaram o diagnóstico médico. O diagnóstico clínico laboratorial foi um dos 
primeiros campos a adotar a metodologia de PCR, principalmente porque a excelente sensi-
bilidade e especificidade na detecção de ácidos nucleicos por PCR permitiu a identificação 
de microorganismos que eram difíceis de cultivar ou confirmar sua presença pela análise de 
seus produtos.
O método consiste na multiplicação de um trecho específico do DNA, por exemplo, um 
gene, utilizando didesoxinucleotídeos como monômeros até um ponto em que sua concentra-
ção em determinada solução seja tão alta que possa ser facilmente detectável por métodos 
simples e clássicos de separação e identificação de substâncias.
A multiplicação destes trechos específicos se dá alternando-se a temperatura de ensaio 
em três etapas distintas:
a) Desnaturação das cadeias do DNA genômico, e consequenteseparação da dupla fita;
b) Anelamento dos primers, usados para delimitar a sequência a ser amplificada;
c) Alongamento, onde pela ação da enzima polimerase, sob temperatura de 72ºC, ocorre a 
adição de desoxinucleotídeos e a síntese de novas fitas de DNA.
A reação sempre parte de um DNA molde, extraído da amostra, ou de uma amostra de 
RNA, convertida para cDNA (DNA complementar). O ideal é que o ácido nucleico esteja livre 
de impurezas (proteínas, lipídeos, outro ácido nucleico, reagentes de extração etc.) e numa 
concentração mínima de 5µg/mL, apesar de quantidades bem menores poderem ser utilizadas 
(em medicina forense, chegou-se a utilizar quantidades de até 10-12 mol de DNA).
A PCR convencional é baseada no uso da enzima DNA-Polimerase para copiar um molde 
de DNA em ciclos repetidos de replicação. A polimerase é guiada para a sequência a ser co-
piada por pequenos oligonucleotídeos iniciadores (primers) que são hibridizados ao DNA-mol-
de no início e no final da sequência de DNA de interesse. Estes primers são desenhados de 
modo que eles forneçam um iniciador para a replicação do DNA em cada uma das duas fitas 
originais. Uma vez que os iniciadores devem ser quimicamente sintetizados, a PCR pode ser 
utilizada para clonar DNA cujas sequências inicial e final sejam conhecidas. Guiada pelos ini-
ciadores, a DNA-polimerase é usada para fabricar diversas cópias da sequência de interesse. 
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A PCR tem alta sensibilidade e pode detectar uma única cópia de uma determinada sequência 
pela amplificação em uma quantidade que possa ser detectável, por exemplo, por coloração 
após separação por eletroforese em gel.
Figura 6: Etapas da PCR convencional realizada em termociclador. Desnaturação: a tempe-
ratura é aumentada a cerca de 96ºC para separar a fita dupla. Anelamento: a temperatura é 
diminuída a cerca de 72ºC para permitir o pareamento complementar dos primers na fita molde 
de DNA. Extensão: a polimerase extende os primers e adiciona os dinucleotídeos para formar 
a nova fita de DNA. Amplificação é exponencial, o processo é repetido e a região de interesse é 
amplificada exponencialmente.
Fonte: Traduzida de monitoria de genética on WordPress.com
Posteriormente, a transcrição reversa (RT) de RNA para cDNA antes da amplificação foi 
introduzida como RT-PCR, o que permitiu a detecção sensível de vírus de RNA e mRNA, ex-
pandindo muito o uso da PCR. Além disso, a vantagem da diferenciação fácil de sequências 
de ácidos nucleicos amplificados foi usada para tipagem de microrganismos, bem como de 
polimorfismos de genes de mamíferos, como os de antígenos de histocompatibilidade em 
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transplantes. As abordagens iniciais de PCR, possuíam algumas desvantagens como procedi-
mentos complicados de várias etapas de amplificação e detecção do produto por eletroforese. 
A forte influência do operador na metodologia clássica de PCR frequentemente deu origem a 
resultados falso-positivos por carreamento de produtos e a resultados falso-negativos por ini-
bição da reação de PCR, principalmente devido à purificação incompleta dos ácidos nucleicos. 
As limitações da técnica provocaram uma série de inovações tecnológicas de instrumentação 
de PCR, culminando em metodologias com detecção contínua dos produtos de amplificação, 
também denominada PCR em tempo real. Essas tecnologias agora permitem a quantificação 
de qualquer alvo de ácido nucleico, além da detecção e diferenciação, porque a informação 
cinética sobre a acumulação do produto é coletada em tempo real.
Mais adiante estudaremos os métodos padrão estabelecidos e geralmente aceitos de PCR, 
bem, como os aspectos que influenciam criticamente os resultados do diagnóstico, além dos 
ensaios de PCR multiplex, nos quais é possível extrair o máximo de informações de uma única 
amostra por amplificação simultânea de múltiplas sequências alvo.
Agora, vamos aprofundar um pouco mais e diferenciar alguns princípios que podem te 
confundir em provas...
PCR em Tempo Real versus PCR Tradicional
A PCR em tempo real foi introduzida pela primeira vez por Higuchi et al para analisar a ciné-
tica da PCR, construindo um sistema para detectar produtos de PCR durante o processo de sua 
amplificação. Neste sistema em tempo real, o corante fluorescente brometo de etídio intercala-
-se preferencialmente em produtos de amplificação em fita, o que aumenta sua fluorescência. 
O progresso da amplificação por PCR pode ser monitorado continuamente em tempo real por 
aquisição de sinais de fluorescência em cada ciclo de reação de amplificação durante os inter-
valos em que o DNA de fita dupla (dsDNA) está presente. Assim, as informações quantitativas 
do processo de PCR são obtidas traçando a intensidade do sinal de fluorescência versus núme-
ro de ciclos. Isso contrasta com a abordagem tradicional de PCR em que apenas informações 
qualitativas são obtidas pela detecção da presença ou ausência de um produto específico de 
dsDNA por eletroforese em gel no final da amplificação.
O monitoramento direto do produto da PCR em tempo real também tem a vantagem de os 
poços de reação não precisarem ser reabertos após a PCR. Isso minimiza o potencial de con-
taminação da amostra com produtos de amplificações anteriores.
O aumento de informações que podem ser extraídas de espécimes, a facilidade de pro-
cessamento das amostras e a prevenção de resultados falso-positivos têm sido os principais 
incentivos para a introdução da PCR em tempo real em laboratórios de diagnóstico clínico.
A PCR em tempo real tem sido aplicada em muitas áreas, como na detecção e quantifi-
cação de DNA e RNA de micróbios, genotipagem de parasitas, monitoramento da transcrição 
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de genes quantificando as concentrações de mRNA em relação a genes expressos de forma 
contínua (genes de manutenção ou de referência), e tipagem de polimorfismos genéticos.
Esses dados sugerem que os métodos de PCR em tempo real substituirão uma grande 
porcentagem dos ensaios tradicionais de PCR nos próximos anos.
Composição química de ensaios de PCR: a composição básica de uma PCR em tempo real 
é semelhante a uma PCR tradicional, e consiste em:
• uma DNA polimerase termoestável;
• primers oligonucleotídicos;
• fluoróforos de ligação a dsDNA ou oligonucleotídeo marcado com sondas fluorescentes;
• nucleotídeos;
• MgCl2, KCl e Tris-HCl;
• Facilitadores de amplificação, como albumina de soro fetal bovino ou detergentes não 
iônicos, são algumas vezes adicionados para aumentar a eficiência da amplificação;
• Frequentemente, a uracil-N-glicosilase é adicionada para evitar a contaminação por ar-
raste de produto de uma PCR por produtos degradantes de PCRs anteriores em que o 
TTP foi substituído por dUTP.
A DNA polimerasetermoestável mais utilizada é a Taq DNA polimerase, numa concentração 
que varia de 1 a 4U por microlitro de solução. Normalmente, a maioria das DNA polimerases 
disponíveis no mercado são fornecidas conjuntamente com uma solução-tampão específica, 
cuja composição varia de acordo com o fabricante. Basicamente, estas soluções contêm íons 
diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) que otimizam as condições de reação. Alguns tampões con-
têm ainda detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a formação de dímeros 
das cadeias enzimáticas, proteínas estabilizantes (BSA: albumina sérica bovina) e algumas 
substâncias que agem na desnaturação da fita molde de DNA (DTT = ditiotreitol, β-mercapta-
noetanol), quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases.
Um reagente de importância crítica é o MgCl2, que atua como doador muito estável de íons 
Mg2+, que são cofatores indispensáveis para atividade da enzima polimerase.
Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima para a síntese das fitas-filhas. São compos-
tos por dinucleotídeos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) desoxilados no carbono 5’ da desoxirribose. 
São adicionados pela polimerase complementarmente à fita-mãe. Adiciona-se uma mistura 
de todos os dNTPs em concentrações iguais à reação. Os dNTPs são ligados à fita-mãe pela 
polimerase numa área delimitada pelos primers.
Nested PCR: para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômi-
co é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo sequências localizadas 
fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real sequência-alvo. 
Estas duas etapas podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separada-
mente, caracterizando o Semi-Nested PCR.
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PCR Competitiva: além do DNA molde, é adicionado à reação um outro trecho de DNA, de 
sequência, tamanho e concentração conhecidos (controle), cujas extremidades são comple-
mentares também aos primers que irão amplificar a sequência-alvo. O resultado é a amplifi-
cação de dois trechos de DNA: a de interesse e a controle. Esta última, levando-se em conta a 
quantidade inicial e dados sobre a eficácia da reação serve de padrão para a quantificação do 
DNA alvo. Se conhecemos a quantidade final do fragmento controle e as condições da reação, 
podemos dizer o quanto de DNA-alvo foi amplificado. Esta técnica é utilizada principalmente 
em kits diagnósticos para determinar carga viral de HIV.
RT-PCR em tempo real: a RT-PCR em tempo real é o padrão ouro para quantificação de 
mRNAs e seu amplo uso é parcialmente responsável pelo atual crescimento exponencial na 
aplicação de PCR em tempo real. O primeiro passo é a transcrição reversa de RNA para cDNA, 
seguida pela PCR em tempo real.
A transcrição reversa pode ser realizada separadamente da PCR como parte da RT-PCR de 
duas etapas, ou precedendo a PCR em uma reação de uma etapa no poço de PCR. A vantagem 
do sistema de duas etapas é que um pool de cDNA pode ser criado e usado para quantificação 
de múltiplos mRNAs alvo.
A PCR em tempo real de duas etapas normalmente utiliza oligonucleotídeos aleatórios ou 
oligo(dT), uma etapa de RT-PCR usa predominantemente os primers de PCR específicos para 
iniciar a transcrição reversa. O RNA é usado como modelo para transcrição reversa, mas o uso 
de poli(A)+ do RNA aumenta a sensibilidade. O tratamento com DNase de ácidos nucleicos 
extraídos é necessário se a RT-PCR não discriminar entre alvos genômicos DNA e cDNA. As 
transcriptases reversas mais usadas são: transcriptase reversa do vírus da mieloblastose aviá-
ria (AMV-RT) e transcriptase reversa do vírus Moloney da leucemia murina (MMLV-RT).
As concentrações de mRNAs encontradas por PCR em tempo real são geralmente relacio-
nadas aos níveis de transcritos de referência de genes de manutenção na mesma amostra.
Um mRNA de padrão interno ideal deve ter expressão constante entre amostras diferentes, 
ou entre indivíduos da mesma espécie. Em duplex ou multiplex RT-PCR, a concentração do 
mRNA de referência deve ser 100 vezes menor que o mRNA do analito, a fim de evitar a inibição 
competitiva da PCR do mRNA da cópia inferior. A expressão desses controles internos também 
deve ser independente de alterações fisiológicas normais e patológicas. Os três transcritos de 
referência mais usados são RNAs ribossômicos (rRNAs), -actina (ACTB) e gliceraldeído-3-fos-
fato.desidrogenase (GAPDH).
PCR em tempo real multiplex: PCRs em tempo real duplex e multiplex são reações nas 
quais dois ou mais conjuntos de primers e sondas amplificam e detectam simultaneamente 
dois ou mais fragmentos alvo. Essas reações são possíveis porque sondas marcadas com 
corantes fluorescentes com diferentes espectros de excitação e emissão podem ser usadas 
e discriminadas concorrentemente em plataformas de PCR em tempo real. Vários fotodetec-
tores e compensação eletrônica de espectros de emissão sobrepostos garantem a especifi-
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cidade e precisão dos dados. Em teoria, a PCR multiplex economiza tempo e custo, e reduz o 
volume de amostra necessário. No entanto, a PCR multiplex em tempo real está repleta de uma 
série de desafios técnicos; todas as amplificações devem ser projetadas para parâmetros de 
reação idênticos; as amplificações em paralelo competem entre si; e, a probabilidade de intera-
ção indesejável entre amplificações aumenta com o número de alvos em uma PCR multiplex. 
Por essas razões, abordagens multiplex bem-sucedidas são utilizadas quase exclusivamente 
para tipagem de polimorfismos genéticos em tempo real. Além do mais, esta técnica pode sim-
plificar alguns experimentos, como a investigação de paternidade, na qual vários marcadores 
genômicos devem ser analisados. É útil, ainda, para a introdução de um controle de reação.
Coleta de Amostras para PCR
A coleta e o processamento de amostras para PCR em tempo real se enquadram em gran-
de parte em duas categorias:
1) amostras para PCR em tempo real de alta sensibilidade de alvo de baixa cópia, como 
microrganismos, para os quais a quantidade de espécimes pode ser limitante; ou
2) espécimes para tipagem genética para os quais a quantidade de espécimes não é 
limitante.
Amostras para alvos de baixa cópia requerem preservação cuidadosa dos ácidos nuclei-
cos, remoção de inibidores de PCR e maior recuperação durante a extração ácida. Frequente-
mente, o fator limitante na detecção de alvos de baixa cópia é a preservação e recuperação do 
alvo na extração do ácido nucleico.
Para a tipagem genética de alvos de alta cópia, é importante que os inibidores de PCR se-
jam quantitativamente removidos durante a extração ácida enquanto as taxas de preservação 
e recuperação da amostra são menos preocupantes.
É um equívoco pensar que o congelamento imediato é a melhor abordagem para preser-
vação do ácido nucleico. Na verdade, os ácidos nucleicos em amostras congeladas se tornam 
expostos a nucleases durante o descongelamento, e alvos de baixa cópia podem ser facilmen-
te perdidos. É imperativo coletar amostras de baixa cópia especificamente para análise de PCR 
em conservantes de ácido nucleico, como isotiocianato de guanidínio, antes do congelamento.Na maioria dos casos, fará sentido coletar qualquer amostra especificamente para PCR em 
tempo real.
Outros fatores que afetam a estabilidade e a propriedade das amostras também devem 
ser considerados, incluindo anticoagulantes, agentes estabilizadores, temperatura, tempo an-
tes do processamento inicial, esterilidade e, até mesmo, a degradação endógena de tipos de 
amostra específicos.
Extração de Ácidos Nucleicos
Em ensaios de PCR em tempo real, a extração ideal de ácidos nucleicos de uma ampla va-
riedade de amostras clínicas é um dos passos mais subestimados, mas ainda assim desafia-
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dores e importantes. A extração adequada deve liberar de forma eficiente os ácidos nucleicos 
das amostras, remover os inibidores de PCR, evitar a degradação de ácidos nucleicos e garan-
tir a concentração adequada dos ácidos nucleicos após a extração. Isso é relativamente fácil 
de alcançar para vírus e alvos de amplificação de mamíferos, mas muito mais difíceis e incon-
sistentes para alvos de ácidos nucleicos de bactérias, fungos, protozoários e parasitas. Esses 
patógenos frequentemente possuem membranas externas altamente resistentes, e métodos 
específicos para ruptura dessas membranas são necessários para recuperação de ácidos nu-
cleicos desses organismos. Em alguns casos, a concentração de organismos-alvo por meios 
físicos aumenta a sensibilidade dos ensaios.
A presença de substâncias inibidoras nas amostras pode influenciar fortemente o desem-
penho da PCR e a sensibilidade de detecção. Inibidores de PCR normalmente interferem com 
a ação da DNA polimerase, mas também pode degradar ácidos nucleicos, ou interferir com o 
procedimento de lise celular. Sais biliares e polissacarídeos complexos nas fezes, grupamento 
heme, imunoglobina G e lactoferrina no sangue, colágeno em amostras de alimentos e subs-
tâncias no solo foram identificadas como inibidores de PCR.
As preparações de ácido nucleico usadas como amostras em ensaios de PCR em tempo 
real incluem ácidos nucleicos totais, DNA purificado, RNA total e poli(A)+RNA. Há diversos kits 
comerciais de qualidade garantida disponíveis para extração de ácidos nucleicos, os quais são 
altamente recomendáveis para uso em laboratório. É imperativo, no entanto, validar a recupera-
ção e remoção de inibidores de PCR de qualquer método de extração de ácido nucleico antes 
do uso na rotina. Além disso, a reprodutibilidade dos resultados após ciclos de congelamento 
e descongelamento de ácidos nucleicos devem ser avaliados.
As amostras de tecidos de origem animal ou vegetal que serão submetidas à extração de 
DNA devem sofrer fragmentação e digestão enzimática das proteínas. Para produzir a frag-
mentação, as amostras podem ser cortadas, submetidas a congelamento em nitrogênio lí-
quido e rapidamente pulverizadas por processo manual (utilizando um bastão) ou mecânico 
(utilizando equipamentos para esse fim). Quantidades da amostra (entre 200mg e 1g) são 
adicionadas a uma solução-tampão de digestão (na proporção de 1, mL de tampão para cada 
100 mg de tecido) e colocadas em banho-maria em temperatura próxima a 50ºC, para que 
ocorra a digestão. O tempo de incubação pode variar entre 8 e 16 horas, ou até que a amostra 
se apresente totalmente digerida, ou seja, apresente aspecto viscoso.
O método mais utilizado para purificação do DNA é a extração com fenol tamponado, que 
provoca a desnaturação das proteínas de maneira eficiente. O clorofórmio também é usado 
como agente desnaturante das proteínas contidas na amostra. A mistura de fenol e de clo-
rofórmio é muito eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade hi-
drófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos. O álcool isoamílico 
previne a formação de espuma quando a mistura é agitada, o que torna mais fácil a separação 
da fase orgânica e da fase aquosa. A proteína que foi desnaturada pelo tratamento com fenol 
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e clorofórmio forma uma camada na interface das duas fases, separando-se do DNA que se 
mantém na fase aquosa.
A precipitação do DNA é feita por meio da utilização de etanol absoluto associado a uma 
solução com alta concentração de um sal catiônico. O etanol induz a transição estrutural nas 
moléculas de ácido, fazendo-as se agregarem, com consequente precipitação. A precipitação 
com etanol absoluto, além de concentrar o DNA, ajuda a remover resíduos de fenol e de cloro-
fórmio presentes na amostra. O etanol a 70% é utilizado para remover resíduos de sais. Embora 
tanto o cloreto de sódio quanto o acetato de sódio e o acetato de amônio sejam eficazes na 
precipitação do DNA, é mais difícil remover o cloreto de sódio em razão da sua menor solubi-
lidade em etanol.
A purificação do DNA é feita por meio do uso de uma coluna que contém fragmentos de 
sílica (coluna de purificação). Inicialmente, o DNA se liga à membrana da coluna de extração e, 
em seguida, é lavado até que apresente alta pureza. No final do protocolo, o DNA é eluído com 
água quente ou com tampão TE. A utilização de kits comerciais permite a purificação do DNA 
nas amostras de maneira homogênea e rápida
Automação: a necessidade laboratorial universal de extração e análise de ácidos nucleicos 
de grandes números de amostras em instrumentos de alto rendimento deu origem a grandes 
esforços na automação desses procedimentos. A automação tem o potencial de reduzir a 
variabilidade na preparação da amostra e a probabilidade de contaminação. Dispositivos fluí-
dicos automatizados estão disponíveis no mercado para extração, purificação e concentração 
de ácidos nucleicos.
Esses dispositivos usam principalmente lise química e térmica para liberar ácidos nuclei-
cos a partir de amostras. No entanto, a extração de ácidos nucleicos de organismos com mem-
branas ainda requer métodos especializados, como ruptura mecânica, que ainda não foram 
automatizados.
As limitações para os atuais formatos de instrumentos automatizados são:
1) que esses instrumentos são caros, tanto na aquisição quanto na operação;
2) que a recuperação de ácidos nucleicos de amostras com alvos de baixa cópia precisa 
ser validado; e
3) que este equipamento funcione corretamente somente se continuamente operado e 
mantido por pessoal altamente treinado.
Aplicações: existem três aplicações especialmente úteis para a PCR:
1) A PCR pode ser utilizada para clonar diretamente um determinado fragmento de DNA, 
como um gene, de uma célula. O molde original para a reação de PCR pode ser tanto DNA 
quanto RNA, este último requerendo um cDNA obtido por RT- PCR.
2) Baseado em sua alta sensibilidade, a PCR pode detectar infecções virais em estágios 
precoces. Curtas sequências complementares do genoma viral são usadas como iniciadores 
e, após muitos ciclos de amplificação, a presença ou ausência do mesmo em uma única cópia 
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do genoma viral pode ser determinado em uma amostra. Para muitas infecções virais, a PCR 
é o método mais sensível e já está substituindo o uso de anticorpos contra proteínas de capa 
viral para detectar as doenças.
3) A PCR também possui aplicação na medicina forense. Sua sensibilidade torna possível 
trabalhar com uma amostra bastante escassa – traços mínimos de sangue e tecidos conten-
do restos de apenas algumas poucas células – e ainda obter uma impressão digital de DNA 
(fingerprint) da pessoa da qual a amostra proveio. Usando um conjunto cuidadosamente sele-
cionado de pares de primers que cubram as partes altamente variáveis do genoma humano, a 
PCR pode gerar uma impressão digital característica do DNA de cada indivíduo.
engenHAriA de dnA
Vimos anteriormente que moléculas de DNA-Recombinante são geralmente produzidas 
usando a DNA-ligase para unir duas moléculas de DNA. Para a produção de uma biblioteca de 
DNA, uma das duas fitas de DNA é o vetor, derivado de um plasmídeo bacteriano ou viral, en-
quanto a outra é o fragmento de um cromossomo ou um cDNA. Esta molécula de DNA-Recom-
binante pode servir também como um vetor para a inserção e clonagem de mais moléculas 
de DNA e, assim, por repetição deste procedimento, um DNA clonado pode ser gerado, sendo 
diferente de qualquer DNA que ocorra naturalmente. Por meio de etapas repetitivas de clona-
gem, DNAs sintéticos e de ocorrência natural podem ser unidos em diversas combinações 
para produzirem moléculas mais longas de DNA da sequência desejada.
Uma das mais importantes contribuições da clonagem de DNA e da engenharia genética 
é que elas possibilitaram a produção de qualquer proteína, incluindo as raras, em grandes 
quantidades. Isto é possível com o uso de vetores especialmente projetados conhecidos como 
vetores de expressão. Estes vetores incluem sequências gênicas regulatórias e promotoras de 
DNA necessárias para permitir que um DNA adjacente que codifica uma proteína seja transcri-
to nas células.
O vetor de expressão é replicado em cada ciclo da divisão celular, dando origem a células 
capazes de sintetizar grandes quantidades da proteína de interesse. Uma vez que a proteína é 
produzida dentro da célula, ela deve ser purificada da célula hospedeira por meio da lise celular 
seguida por cromatografia.
Estas técnicas são utilizadas para produzir diversas proteínas de interesse em grandes 
quantidades, suficientes para a realização de estudos detalhados de estrutura e função que 
antes eram possíveis para apenas poucas proteínas.
EXEMPLO
Por exemplo, a proteína Fator VIII é atualmente produzida a partir de culturas de células de 
mamíferos geneticamente modificadas e, por isso, são livres de contaminação viral. Muitas 
outras proteínas úteis, como a insulina, o hormônio do crescimento e proteínas do capsídeo 
viral para uso em vacinas, também são produzidas por engenharia genética.
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A maioria dos RNAs está presente somente em pequenas quantidades nas células, sendo 
muito mais difíceis de purificar que outros componentes celulares. No entanto, a tecnologia 
de DNA pode ser usada para produzir grandes quantidades de qualquer molécula de RNA, uma 
vez que seu gene tenha sido isolado. O método mais eficiente se baseia na síntese do RNA de 
interesse in vitro na ausência de qualquer outro RNA.
Agora que os projetos de sequenciamento genômico estão identificando rapidamente no-
vos genes a partir da sequência do DNA, seria possível com o uso destas técnicas modernas, 
descobrir qual a função das proteínas nas células e no organismo como um todo?
Certamente, a tecnologia do DNA-recombinante tornou possível um tipo distinto de estra-
tégia genética. Em vez de começar com um mutante gerado ao acaso e usá-lo para identificar 
o gene e sua proteína, utiliza-se um gene clonado, produzindo nele mutações in vitro. O gene 
alterado é reintroduzido ao organismo mutante no qual a sua função pode ser revelada. Nesta 
técnica, a sequência codificante de um gene clonado pode ser alterada para mudar as proprie-
dades funcionais do produto protéico ou até eliminá-lo. A região regulatória de um gene pode 
ser também alterada para que a quantidade produzida de uma proteína seja alterada ou que 
o gene seja expresso em uma célula diferente do normal em um tempo diferente durante o 
desenvolvimento.
É desejável alterar a proteína codificada pelo gene em apenas um ou poucos aminoácidos. 
Para isso, utiliza-se a técnica de mutagênese sítio-dirigida, alterando aminoácidos seleciona-
dos, podendo determinar quais as partes da cadeia polipeptídica são cruciais para os proces-
sos fundamentais, como enovelamento da proteína, interações entre proteína-ligante e catálise 
enzimática.
Organismos nos quais um gene novo foi introduzido ou aqueles cujos genomas foram 
alterados de outras formas usando técnicas de DNA recombinante são conhecidos como or-
ganismos transgênicos.
Para estabelecer a função de um gene mutado in vitro, é preferível substituir o gene normal 
pelo alterado para que a função da proteína mutante possa ser analisada na ausência da pro-
teína normal. Esta substituição gênica pode ser obtida pela recombinação homóloga entre o 
DNA-mutante introduzido e o DNA-cromossomal em alguns organismos haploides, tais como 
bactérias e leveduras. Recombinação homóloga com um DNA introduzido que contenha uma 
deleção no gene de interesse pode levar a ocorrência de uma grande deleção no gene normal 
e sua inativação completa ou nocaute.
É possível, embora mais difícil, obter substituição de genes em organismos diploides com 
genomas grandes e complexos. Caso o gene normal seja substituído por um gene com uma 
deleção ou um gene modificado de outra forma, técnicas transgênicas possibilitam a produção 
de organismos complexos em que certos produtos gênicos estão faltando por completo.
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EXEMPLO
Por exemplo, camundongos nocauteados, ou seja, linhagens de camundongos que possuem 
um determinado gene inativado de maneira permanente, são produzidos. O estudo de camun-
dongos com genes nocaute que comandam o desenvolvimento trouxe avanços consideráveis 
na identificação das funções precisas dos genes no processo complexo do desenvolvimento 
dos mamíferos.
Microarranjos de DNA
Os microarranjos, ou chips de DNA, em alusão ao componente eletrônico que carrega mi-
lhões de transistores, são lâminas sólidas, nas quais fragmentos de DNA fita simples, deno-
minados sondas, são depositados e imobilizados de forma ordenada e em áreas específicas, 
chamadas de spots. Na lâmina, cada spot contém milhões de cópias de um único e determi-
nado transcrito que pode posteriormente ser identificado. O princípio da técnica se baseia na 
hibridização por complementaridade das moléculas de ácido nucleico, que ocorre entre a son-
da depositada na lâmina e o seu RNAm correspondente, transformado em cDNA, extraído das 
amostras a serem analisadas e comparadas.
Os microarranjos de DNA evoluíram, a partir da técnica de dot blot, partindo da análise de 
poucos genes e utilizando, como suporte, membranasporosas (nylon, nitrocelulose), progre-
dindo pela miniaturização e automatização, o que permitiu que a hibridização pudesse ser 
usada em larga escala na exploração dos dados gerados pelos projetos genoma. O desenvol-
vimento de duas áreas foi fundamental para a evolução da técnica: o surgimento de sistemas 
robotizados que permitiram a elaboração de lâminas com alta densidade de spots e a otimiza-
ção de métodos de detecção da fluorescência, que atingiram a sensibilidade necessária para 
as medidas de intensidade geradas pelos fluoróforos.
Basicamente, são três as etapas envolvidas em um experimento com microarranjos:
(a) preparo das amostras,
(b) hibridização e
(c) detecção, visualização e interpretação dos dados.
No caso da hibridização comparativa (ou competitiva), que envolve a utilização de duas 
amostras simultaneamente, a população de RNA total ou RNAm é isolada do tecido ou célula 
alvo da amostra teste (amostra a ser investigada) e da amostra referência (amostra usada para 
comparação). Em seguida, o RNA das amostras é convertido a cDNA, por meio de transcrição 
reversa (pela ação da transcriptase reversa), e marcado com dois corantes fluorescentes dife-
rentes. Embora haja vários tipos de corantes fluorescentes disponíveis comercialmente, os nu-
cleotídeos (dUTP ou dCTP) marcados com as cianinas 3 e 5 (conhecidos como Cy3 e Cy5) têm 
sido os mais utilizados para esse propósito. Esses corantes, incorporados aos cDNAs durante 
a transcrição reversa, possuem espectros de emissão e excitação diferentes, o que permite 
que as amostras teste e referência sejam individualmente quantificadas após a hibridização. 
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Após esse processo, as lâminas são lavadas para a remoção dos cDNAs que não se ligaram 
às sondas e, em seguida, expostas à ação de raios laser que excitam os corantes, fazendo com 
que estes emitam luz (fluorescência).
Cada spot de uma lâmina de microarranjo representa o valor da atividade transcricional 
de um determinado gene em uma situação biológica de interesse. Esses valores de atividade 
gênica são codificados em forma de sinais de intensidade, gerados pelos fluoróforos incorpo-
rados ao cDNA.
Existem variações na técnica, relacionadas, principalmente, à fabricação das lâminas e ao 
modo de detecção do sinal gerado. As lâminas podem ter as sondas depositadas sobre sua 
superfície (spotted array), por meio de um robô de alta precisão, ou podem ser diretamente 
sintetizadas sobre ela (oligo arrays), por meio do processo de fotolitografia. No primeiro caso, 
as amostras utilizadas podem ser cDNAs obtidos a partir de clones de bibliotecas de cDNA, 
produtos da amplificação por meio de PCR ou oligonucleotídeos pré-sintetizados. No processo 
de fotolitografia, são sintetizados oligonucleotídeos com tamanhos variando em torno de 25pb 
(curtos) a 80pb (longos).
Microarranjos de uma cor ou um canal utilizam somente um fluoróforo para marcação 
e requerem hibridizações separadas das amostras controle e referência. Os dados originais 
obtidos como resultado de um experimento com microarranjos são imagens, as quais repre-
sentam os níveis de expressão dos genes presentes no suporte sólido e devem ser analisa-
das por um programa específico de análise de imagens. Esse programa gera uma tabela de 
dados numéricos contendo os valores de intensidade dos spots e seus respectivos valores 
de intensidade do background local (ruído). A etapa de aquisição de imagem é extremamente 
importante, uma vez que toda a análise posterior depende desse processo. Em seguida, es-
ses dados devem ser processados e uma análise exploratória deve ser empregada visando à 
identificação de efeitos sistemáticos que devem ser removidos por meio de métodos de nor-
malização adequados. A normalização ajusta as diferenças nas eficiências de marcação e de 
detecção dos corantes, bem como na quantidade inicial de RNA das amostras em estudo. Uma 
vez feito isso, tem-se um conjunto de dados que pode ser denotado por uma matriz de valores 
numéricos que representam os níveis de expressão dos diferentes genes da lâmina em uma 
variedade de condições biológicas.
Os métodos mais comumente empregados na análise dos dados de microarranjos são 
a construção de agrupamentos (para genes e amostras), a busca de genes diferencialmente 
expressos e a busca por grupos de genes capazes de discriminar tipos biológicos diferentes 
(análise de classificação ou discriminatória). Na análise de dados de expressão gênica, o agru-
pamento é considerado um passo chave, pois viabiliza a detecção de grupos de genes que 
exibem padrões de expressão similares (coexpressos ou corregulados). Como vimos na aula 
anterior, genes contidos em uma via particular ou que respondem a estímulos externos co-
muns podem ser corregulados, e, consequentemente, mostrar padrões similares de expressão.
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Um dos principais objetivos da análise de dados de microarranjos é a identificação de ge-
nes com diferenças significativas de expressão entre as amostras biológicas estudadas. His-
toricamente, a identificação de genes diferencialmente expressos era feita com base na razão 
entre os valores de intensidade normalizada para as 2 amostras biológicas estudadas, usan-
do-se um ponto de corte arbitrário para classificar o gene como diferencialmente expresso ou 
não. Com a utilização de réplicas biológicas, o mesmo tipo de análise era feito, utilizando-se a 
razão entre as médias das réplicas biológicas estudadas.
Atualmente, modelos estatísticos têm sido usados para este tipo de análise diferencial. A 
ideia principal é descobrir quais genes do conjunto de dados apresentam diferenças significa-
tivas de expressão entre as condições biológicas estudadas. Quando a avaliação é feita entre 
apenas duas condições biológicas diferentes, utilizam-se modelos estatísticos mais simples 
que buscam diferenças significativas entre medidas de posição central dos dois grupos, como 
o teste t. Quando mais de duas amostras biológicas são estudadas, modelos mais elaborados 
são utilizados, como modelos de análise de variância (Anova).
Agora vamos para a mais moderna técnica de Biologia Molecular, atualmente?
sequenciAMento
O sequenciamento genômico é uma técnica que permite identificar, na ordem correta, a 
sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA ou RNA, visando conhecer a informação 
genética contida nesta estrutura.
EXEMPLO
Utilizando um exemplo prático bem atual... temos o sequenciamento sendo executado para 
elucidar segmentos genéticos do SARS-COV2 e identificar variantes ao longo da pandemia de 
coronavírus. Essa aplicação foi útil no sentido de análise epidemiológica e seus resultados 
foram sendo utilizados como verdadeiros intrumentos práticos para as políticas públicas no 
enfrentamento da pandemia. Inclusive, esse seria um tema de discursiva bem razoável!
Pense nisso...
Mas vamos voltar ao histórico sobre essa técnica...
Desde o desenvolvimento das primeiras metodologias de sequenciamento (no final da dé-
cada de 1970) até as tecnologias atuais, denominadas “Sequenciamento de Nova Geração” 
(New Generation Sequencing – NGS), passamos da escala de sequenciamento manual de pou-
cos kilobasespara o sequenciamento maciço e paralelo de genomas inteiros e em curto perío-
do de tempo. Mais adiante, estudaremos algumas das metodologias de sequenciamento mais 
utilizadas, focando em seus princípios, peculiaridades, aplicações, vantagens e desvantagens. 
Além disto, serão apresentadas, sucintamente, tecnologias ainda em desenvolvimento, classi-
ficadas como de terceira geração.
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De forma geral, o sequenciamento é feito a partir de moléculas de DNA advindas dire-
tamente do DNA genômico (aquele que contém a maior parte da informação genética dos 
organismos) ou de outras moléculas de DNA celular, tais como: DNA mitocondrial, DNA cloro-
plastídico, DNA plasmidial, entre outros. O sequenciamento, seguido de uma boa montagem 
das sequências obtidas, permite obter informações referentes à expressão gênica diferencial, 
estrutura e função dos genes, diversidade genética, presença de elementos móveis no geno-
ma, presença de genes adquiridos por transferência lateral, relações evolutivas, bem como 
permite a construção de mapas metabólicos, entre outras. Não é possível obter, por meio do 
sequenciamento do DNA genômico, informação referente a quais genes estão sendo expres-
sos no momento do ensaio e em que nível de expressão estes genes se encontram. Esse tipo 
de informação é importante para saber se um determinado gene é relevante numa situação 
específica ou se ele sofre algum tipo de regulação da expressão ao nível transcricional. Para 
conseguir tais informações, seria necessário sequenciar os RNA mensageiros (RNAm), que 
são RNAs que podem ou não ser traduzidos em proteínas funcionais nas células. Como não é 
possível sequenciar diretamente fragmentos de RNA, torna-se necessário isolar os mesmos e 
transcrevê-los de forma reversa, utilizando a enzima transcriptase reversa em cDNA, que cor-
responde a uma parte codificante dos RNAs mensageiros. A retrotranscrição também é válida 
para situações em que se queira sequenciar outros tipos de RNAs.
As metodologias de sequenciamento podem ser utilizadas para sequenciar fragmentos de 
cDNA, ou de DNA genômico. Uma característica comum à maioria das tecnologias de sequen-
ciamento atuais é a limitação do tamanho dos fragmentos de DNA sequenciados, ou seja, de 
forma geral os sequenciadores ainda são incapazes de sequenciar fragmentos de DNA longos. 
Desta forma, é necessário fragmentar moléculas grandes de DNA, como DNA genômico, ou, 
em outros casos, isolar apenas alguns fragmentos de interesse para serem sequenciados.
As tecnologias de sequenciamento mais utilizadas são separadas em dois grandes gru-
pos: as tecnologias de pequena escala, que proporcionaram os primeiros sequenciamentos de 
DNAs; e, as novas tecnologias de sequenciamento em larga escala.
Até o começo da década de 1970, era muito difícil obter a sequência de nucleotídeos de 
um fragmento de DNA, por menor que fosse. Este problema foi resolvido em 1977, com o sur-
gimento de duas tecnologias: uma desenvolvida por Alan Maxam e Walter Gilbert (baseada em 
hidrólise química) e outra por Frederick Sanger e colaboradores (baseada em reações enzimá-
ticas), as quais permitiram determinar a sequência de nucleotídeos de fragmentos maiores de 
DNA. Essas metodologias revolucionaram as pesquisas científicas e se difundiram rapidamen-
te pelo mundo, tornando-se a base da genômica.
Sequenciamento Químico de Maxam-Gilbert
Após divulgada, esta metodologia foi amplamente utilizada por proporcionar a obtenção 
da sequência de nucleotídeos de fragmentos maiores de DNA.
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Essa técnica utiliza marcação do DNA alvo a ser sequenciado com fósforo radioativo (P32). 
O P32 é inicialmente ligado ao dATP formando P32-dATP que é incorporado, pela enzima poli-
nucleotídeo kinase, ao DNA a ser sequenciado. Esta incorporação pode ser tanto na extremida-
de 5’ quanto na extremidade 3’. Neste método, o rompimento das pontes de hidrogênio da fita 
dupla de DNA ocorre pela adição de dimetil sulfato e aquecimento a 90ºC.
O princípio básico desta técnica consiste na clivagem do DNA alvo marcado, por meio de 
compostos químicos, em posições específicas (antes dos “G”s, antes de “A” ou “G”, antes de 
“C” ou “T” e antes dos “C”s). A posição a ser quebrada depende do composto químico que é 
adicionado, num só tipo, a um dos quatro tubos contendo o DNA molde a ser sequenciado. 
Como resultado, após a fragmentação, tem-se um conjunto de fragmentos de diferentes tama-
nhos em cada um dos quatro tubos. As bandas geradas no fim da “corrida” desses fragmentos 
em gel de poliacrilamida podem ser visualizadas após a impressão de uma chapa radiográfica. 
A determinação da sequência de nucleotídeos é obtida “lendo-se” de baixo para cima, um a um, 
os nucleotídeos representados pelas bandas do gel.
Método de Sanger
Assim como a metodologia proposta por Maxam e Gilbert, a técnica de sequenciamento 
desenvolvida por Sanger, em 1977, também utiliza marcação radioativa. A diferença é que a 
primeira marcava diretamente o DNA a ser sequenciado, enquanto a de Sanger marcava os 
fragmentos de DNA sintetizados a partir da fita molde. A síntese de novos fragmentos de DNA 
a partir da fita molde só foi possível após o desenvolvimento da técnica de PCR.
O princípio da técnica consiste em marcar radioativamente alguns dos desoxinucleotídeos 
livres em solução ou o primeiro desoxinucleotídeo do primer com P32 ou S35. Após a incorpo-
ração na cadeia de DNA nascente, esses átomos marcados emitem radiação, a qual é utilizada 
para impressão de uma chapa radiográfica, permitido, desta forma, visualizar os fragmentos 
resultantes da amplificação.
A técnica se desenvolve da seguinte maneira: primeiro, o DNA fita dupla é desnaturado e 
utilizado para montar quatro reações independentes contendo os mesmos reagentes, com ex-
ceção dos didesoxinucleotídeos, que são adicionados separadamente (um para cada reação). 
Após um determinado tempo de reação, considerando que nada dirige a entrada de desoxi 
ou didesoxinucleotídeos na cadeia de DNA nascente e que eles são colocados em excesso 
na reação, será produzido um conjunto de fragmentos complementares ao DNA molde com 
tamanhos variados. Sendo o tamanho de cada fragmento dependente da posição onde o di-
desoxinucleotídeo terminador foi adicionado. Se pensarmos que existem na mistura muitas 
moléculas do mesmo DNA molde, compreenderemos que todas as posições do DNA molde, 
em algum momento, terá um dNTP e um ddNTP complementar de forma intercalada. Assim, 
teremos amplicons (produto da PCR) terminando em diferentes posições do DNA molde. O 
produto heterogêneo de cada uma das quatro reações é aplicado em poços diferentes do gel, 
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que, frequentemente, tem a poliacrilamida como matriz. Porcausa do alto poder de resolução 
(separação dos fragmentos) deste gel, é possível separar e visualizar fragmentos que diferem 
entre si por apenas um nucleotídeo. As bandas produzidas são visualizadas numa chapa radio-
gráfica após sua impressão. Assim como no método anterior, a análise da ordem das bandas 
na chapa radiográfica começa pelo final do gel, permitindo determinar a sequência de nucleo-
tídeos da fita de DNA recém-sintetizada.
Esta técnica permitiu inicialmente separar de 200 a 300 nucleotídeos por corrida, sendo 
considerada uma revolução na época em que foi descoberta. Esta metodologia foi aprimorada 
originando o método semiautomatizado, que é a base de muitas metodologias de sequencia-
mento atuais. A principal modificação foi a adição de corantes aos didesoxinucleotídeos, os 
quais são capazes de emitir fluorescência quando excitados em comprimento de onda es-
pecífico. A detecção da fluorescência foi possibilitada pela utilização de corantes especiais, 
que emitem luz ao serem atravessados por feixe de raios laser. O método aprimorado usa 
fluoróforos diferentes para cada um dos quatro tipos de didesoxinucleotídeos, os quais, ao se-
rem excitados, emitem luz característica do didesoxinucleotídeo incorporado. Como na reação 
existem muitas moléculas do mesmo DNA molde, todas as posições do DNA terão em algum 
momento, ora um dNTP, ora um ddNTP incorporado pela DNA polimerase durante a PCR. Desta 
forma, serão obtidos amplicons terminando em diferentes posições do DNA molde. Como con-
sequência da incorporação dos didesoxinucleotídeos marcados com fluorescência, as quatro 
reações passaram a ocorrer num tubo único e seu conteúdo pode ser aplicado num único 
poço do gel. Este fato fez com que o número de amostras analisadas por corrida fosse quatro 
vezes maior.
Estratégias de Sequenciamento de DNA
A técnica de sequenciamento automatizada, descrita anteriormente, permite sequenciar 
com qualidade aproximadamente 700 nucleotídeos consecutivos de um fragmento. Assim, 
quando o objetivo é o sequenciamento de genomas, seja de organismos simples, como as 
bactérias, ou organismos complexos, como o humano, torna-se necessário: cortar o DNA em 
fragmentos menores, sequenciar os fragmentos obtidos e, depois, sobrepô-los em busca do 
genoma completo. As técnicas de fragmentação são várias, dentre elas destacam-se: uso de 
enzimas de restrição de corte frequente; e quebra aleatória por fragmentação mecânica do ge-
noma a ser sequenciado (shotgun). Shotgun consiste em bombardear aleatoriamente o geno-
ma a ser sequenciado com partículas que promovem sua fragmentação. Após este passo, ob-
têm-se a biblioteca genômica pela inserção de cada fragmento (inserto) num vetor apropriado 
(clonagem). Fragmentos clonados pequenos (no máximo 1400 pb) podem ser completamente 
sequenciados somente com o uso de primers que anelam no vetor. Neste ponto, vocês devem 
estar se perguntando: e para montar estes milhares de fragmentos sequenciados?
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Para que isto fosse possível foi necessário criar programas de bioinformática que têm 
como objetivo montar a maior sequência possível, utilizando pequenas regiões de sobreposi-
ção entre os fragmentos sequenciados, como se fosse um quebra-cabeça. O Primer Walking 
(“movimento” do primer) consiste em sequenciar o DNA clonado maior em várias etapas, já 
que a limitação de cerca de 700pb por sequenciamento não permite o sequenciamento com-
pleto de fragmentos maiores do que aproximadamente 1400pb com alta confiança. Assim, 
emprega-se a estratégia de sequenciar o início das extremidades usando primers que se ane-
lam no vetor e dão continuidade ao sequenciamento a partir de novos primers desenhados 
para o fim das sequências primariamente obtidas. Desta maneira, primers que anelam ao vetor 
são utilizados permitindo o sequenciamento de uma das extremidades do fragmento de inte-
resse. Um novo primer capaz de anelar ao fragmento sequenciado é desenhado iniciando o 
sequenciamento de uma região mais distante da extremidade do fragmento. Esse processo é 
repetido várias vezes até que toda a extensão dos fragmentos seja sequenciada. Os primers 
devem ser cuidadosamente desenhados, pois a última região sequenciada deve se sobrepor 
aos fragmentos sequenciados anteriormente em aproximadamente 100 pb.
Estratégias de Sequenciamento de RNA
Outras abordagens surgiram para sequenciar somente os genes expressos. Quando fala-
mos em genes expressos, devemos logo pensar nos RNAs que estão sendo expressos em um 
determinado momento do desenvolvimento celular.
O transcriptoma é o conjunto de transcritos e suas quantidades num estágio específico do 
desenvolvimento ou condição fisiológica. O sequenciamento do RNA tem permitido mensu-
rações mais precisas do nível destes transcritos. Como vimos anteriormente, não é possível 
sequenciar diretamente o RNA. Este problema é resolvido com a abordagem na qual temos 
inicialmente três mRNAs processados (sem íntrons e com a cauda poli-A), servindo de molde 
para síntese, pela transcriptase reversa, de uma fita de cDNA complementar, utilizando primers 
apropriados e a degradação das fitas de mRNAs inicial e síntese de uma segunda fita de DNA, 
que, em conjunto com a primeira fita, origina o DNA fita dupla referente à parte codificadora.
Mas por que não existe nenhuma técnica que permite sequenciar o RNA? A principal razão 
se deve à sua instabilidade fora da célula. É necessário para uma perfeita execução destas téc-
nicas que não haja contaminação do material a ser sequenciado com DNA genômico e que os 
mRNAs estejam em boa qualidade. Essas metodologias permitem estudar todo o transcripto-
ma de uma determinada espécie sem precisar sequenciar completamente todos os genes que 
estão sendo expressos. Assim, estas tecnologias têm como vantagem rapidez na obtenção 
dos dados e redução de custos.
Técnicas que utilizam estas abordagens são de grande importância por permitir: descobrir 
genes novos, identificar polimorfismos (SNPs), descobrir mutações, construir mapas genômi-
cos e estudar a expressão gênica em condições distintas.
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Os diversos projetos de sequenciamento de transcriptomas têm evidenciado, com altís-
sima frequência, o mecanismo de splicing, que é responsável pelo processamento (retirada 
dos íntrons e seleção de éxons) dos transcritos primários para obtenção do mRNA maduro. 
Consequentemente, é possível obter diferentes tipos de mRNAs maduros a partir de um mes-
mo pré-mRNA e estes mRNA maduros podem ter diferentes funções em virtude dos éxons 
selecionados.
Sequenciamento de ESTs (Expressed Sequence Tags)
O próximo passo após a retrotranscrição consiste em clonar os cDNA em vetores apropria-
dos e sequenciar suas extremidades, obtendo fragmentos que geralmente variam de 200 a 500 
nucleotídeos.
Sequências curtas correspondendo à parte dos cDNAs são conhecidas como EST (Expres-
sed Sequence Tags – “Etiquetas de Sequências Expressas”). Se for sequenciada apenas uma 
das extremidades do inserto (cDNA), são obtidas as 5’ EST que, geralmente, correspondem à 
região codificadora da proteína. Esta região tende a ser conservada entre espécies próximas 
evolutivamente,facilitando a identificação do gene por homologia. O sequenciamento da re-
gião final do inserto produz as 3’ EST, que comumente correspondem à região não codificadora 
3’ UTR (regiões não traduzidas) dos mRNAs. Normalmente, esta região não é conservada entre 
espécies. Apesar do pequeno tamanho, as ESTs permitem, na maioria das vezes, identificar 
os genes que as originaram e consequentemente as suas funções, utilizando programas que 
efetuam busca por identidade/similaridade, tal como o programa denominado BLAST (Basic 
Local Alignment Tool).
O conjunto de ESTs de um mesmo transcrito pode se sobrepor em regiões com alta identi-
dade, gerando uma sequência maior representativa do cDNA que as originaram. Esta aborda-
gem é muito interessante para estudar diversos fenômenos biológicos por meio da compara-
ção de bibliotecas de ESTs de duas condições distintas. Este tipo de abordagem permite inferir 
sobre adaptações biológicas que se correlacionam com diferenças na expressão dos genes.
EXEMPLO
Se um dado transcrito de cDNA aparece múltiplas vezes numa biblioteca de ESTs é porque o 
mesmo se acumulou naquela determinada situação, sendo provavelmente importante para 
o organismo naquele momento celular. O contrário pode ser pensado para transcritos pouco 
expressos, ou seja, esses devem ser menos importantes para a mesma situação celular. Como 
aplicação, tem-se, por exemplo, a busca por marcadores de condições celulares ou biológi-
cas específicas, estudo da diferença de expressão gênica entre um tecido normal e um tecido 
tumoral em busca de marcadores de tumorigênese que possam ser utilizados no diagnóstico 
de um determinado tumor.
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Bibliotecas de ESTs podem ser utilizadas ainda para comparar tecidos tumorais com graus 
diferenciados de um determinado tumor e procurar, assim, por marcadores de prognóstico 
de câncer.
Orestes (Open Reading Frame ESTs)
Esta técnica foi desenvolvida no Brasil e tem como objetivo o sequenciamento de regiões 
internas dos genes, onde se concentra a informação referente à região codificadora das prote-
ínas. Surgiu por causa da limitação do tamanho das ESTs e do fato destas conterem, em sua 
maioria, sequência relativa às extremidades não codificadoras dos RNAm, regiões estas que 
não trazem informações que possam ser relacionadas às possíveis funções dos transcritos. 
A eficiência em conseguir a função do gene por esta técnica é devido à maior identidade em 
regiões internas de genes homólogos.
Nesta técnica, após a produção dos cDNAs, usam-se primers degenerados aleatórios (mis-
turas de variados oligonucleotídeos) num passo de amplificação por PCR antes da clonagem e 
sequenciamento desses. A utilização de primers é necessária no caso de RNAm de bactérias, 
pois estes organismos não possuem poliA na porção 3’. Esta metodologia tem como vanta-
gem a normalização da população de genes expressos, permitindo que genes raros ou poucos 
expressos sejam identificados.
Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing – NGS)
Atualmente existem diversas tecnologias voltadas para o sequenciamento do DNA em lar-
ga escala, sendo a Roche a primeira empresa a desenvolver essa estratégia, que se baseia na 
tecnologia de pirosequenciamento. A partir deste período, outros métodos foram desenvolvi-
dos, sendo os mais importantes: o método Polony utilizado no sequenciador SOLID (Applied 
Biosystems) e o método de amplificação em ponte utilizado no sequenciador Genome Analy-
ser (Illumina). Com isso, a ênfase passou do sequenciamento de pequenos fragmentos de 
DNA ao estudo de genomas inteiros.
Plataforma 454: este método pode ser dividido em três etapas:
a) preparo da amostra;
b) PCR em emulsão; e,
c) sequenciamento.
Na primeira etapa, o DNA é fragmentado aleatoriamente por nebulização, sendo selecio-
nados os fragmentos com tamanho adequado. Em seguida, liga-se dois adaptadores (A e B) 
às extremidades dos fragmentos selecionados. Em “b”, os fragmentos obtidos são ligados às 
microesferas magnéticas por meio do pareamento do adaptador B com sequências curtas 
complementares presentes na superfície da microesfera, onde ocorrerá a amplificação deste 
fragmento. O adaptador A, por sua vez, servirá de molde para o anelamento do primer respon-
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sável pelo início da amplificação. Desta forma, estas microesferas agem como reatores de am-
plificação individual produzindo milhares de cópias de um único molde. Na última etapa, essas 
microesferas são adicionadas a uma placa, de modo que cada orifício da placa receba uma 
única microesfera. Posteriormente, são adicionados os reagentes necessários para amplifica-
ção do DNA. Pirofosfato inorgânico (PPi) é liberado a cada incorporação de um nucleotídeo 
complementar à fita molde. Esse PPi livre é convertido, pela enzima ATP sulfurilase, em ATP, 
que por sua vez fornece energia para oxidar a luciferina à oxiluciferina. Como consequência 
desta reação, temos a emissão de luz. Desta forma, cada incorporação de nucleotídeo à cadeia 
de DNA nascente emitirá luz, imediatamente convertida em pirogramas. A interpretação des-
tes “pirogramas” permite identificar a sequências de nucleotídeos do DNA molde.
Resumidamente, podemos dizer que esta técnica se baseia na detecção de fótons de luz 
produzidos em quantidade proporcional ao número de nucleotídeos incorporados à cadeia de 
DNA nascente. No entanto, a quantidade de luz emitida após a incorporação do quarto homo-
polímero não é mais linear ao número de nucleotídeos incorporados, sendo este um problema 
desta técnica. Outra limitação consiste na geração de quimeras que são sequências de DNA 
provenientes da ligação de dois fragmentos distintos.
Plataforma Illumina®: o princípio desta metodologia é similar ao método proposto por 
Sanger, pois temos em ambas a síntese de uma fita complementar ao DNA alvo utilizando DNA 
polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos. A fluorescên-
cia emitida após a incorporação de cada nucleotídeo é registrada como imagem e no final, por 
meio de uma decodificação destas imagens, tem-se a sequência de interesse. Como toda téc-
nica de sequenciamento de segunda geração, é preciso primeiro preparar as bibliotecas con-
tendo o DNA a ser sequenciado. Assim, o DNA é clivado, os fragmentos de tamanho apropria-
do são selecionados e ligados a adaptadores em ambas as extremidades. Estas bibliotecas 
podem ser de dois tipos: paired-end, que proporciona o sequenciamento nas duas extremida-
des de reads com tamanho entre 200 e 500 nucleotídeos; e, mate-pair, que também sequencia 
as duas extremidades de reads maiores (de 2.000 a 5.000 nucleotídeos). Adaptadores são 
ligados às extremidades dos fragmentos de tamanho apropriado (obtidos pela fragmentação 
randômica do DNA a ser sequenciado) durante a preparação da biblioteca. Estes fragmentos 
são fixados na placa distantes o suficiente para que, após a amplificação, exista somente um 
tipo de fragmento dentro do cluster, que geralmente é formado por mais de um milhão de 
cópias do mesmo fragmento. Os adaptadores têm a função de imobilizar os fragmentos fita 
simples, pela hibridização a primers complementares,numa placa de vidro onde acontecerá 
todo o processo. Após a fixação, o adaptador da extremidade livre liga-se ao primer comple-
mentar adjacente na placa de vidro. A alta densidade de primers ligados a flowcell facilita esta 
ligação que tem a função de iniciar a extensão da fita de DNA nascente, pela DNA polimerase, 
ao encontrar um OH livre na extremidade do primer livre.
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Na primeira etapa são fornecidos apenas nucleotídeos não marcados que proporcionará 
a extensão de uma fita de DNA complementar ao DNA molde fixado na placa. A extremidade 
desta fita recém-sintetizada se anela ao primer na extremidade da fita molde formando uma 
estrutura em ponte que dá nome ao processo de amplificação (amplificação em ponte). Poste-
riormente, ocorre uma elevação de temperatura no suporte sólido desnaturando e linearizando 
as duas fitas que encontram outros dois primers reiniciando o processo (segundo ciclo). A 
clonagem in vitro é finalizada após 35 ciclos, resultando em milhares de clusters (cada um 
representando um fragmento a ser sequenciado).
Na segunda etapa, após os 35 ciclos de sequenciamento, é adicionada, ao longo de toda 
a extensão da placa, uma solução contendo os quatro tipos de nucleotídeos terminadores 
marcados com fluorescência. Quando necessário estes nucleotídeos, contendo os fluoróforos, 
são adicionados às respectivas cadeias de DNA nascente em cada um dos clusters. Posterior-
mente, ocorre a excitação do fluoróforo por feixes de raios laser, fazendo com que os nucleotí-
deos emitam uma fluorescência que tem sua intensidade proporcional ao número de represen-
tantes (fragmentos) dos clusters. O número elevado de fragmentos no clusters (acima de um 
milhão) é necessário para produzir intensidade suficiente que permita detectar com exatidão 
uma determinada base no sequenciamento. Uma imagem, contendo a cor da fluorescência, é 
capturada para cada posição dos clusters na placa de vidro. Cada corrida pode conter até 400 
milhões de clusters. Em seguida, a extremidade 3’ é desbloqueada com consequente remo-
ção dos reagentes em excesso e do fluoróforo do nucleotídeo incorporado no ciclo anterior, 
permitindo o início de um novo ciclo. Este processo se repete até que todas as bases de um 
determinado fragmento sejam determinadas.
O aperfeiçoamento desta tecnologia tem possibilitado sua utilização para “sequenciamen-
to de novo” de genomas e ressequenciamento de genomas.
Plataforma SOLiD®:O primeiro sequenciador foi liberado comercialmente no final de 2007 
pela empresa Applied Biosystems. Este sequenciador pode ser utilizado para sequenciamento 
de genoma, ressequenciamento de regiões de interesse, experimentos envolvendo imunopreci-
pitação de cromatina, análise de expressão gênica e análise de pequenos RNAs, sendo as duas 
últimas aplicações muito utilizadas em virtude do tamanho dos fragmentos sequenciados.
Inicialmente, é preciso preparar a biblioteca a ser sequenciada, que pode ser de tags únicas 
ou de tags duplas (mate-pair). Na primeira, os fragmentos são ligados diretamente aos adapta-
dores universais P1e P2. O segundo tipo de bibliotecas (mate-pair) gera fragmentos maiores, 
que variam de 1 a 10 kb, e também tem os adaptadores P1 e P2 ligados nas extremidades. A 
diferença é que a segunda possui um adaptador interno cuja função é unir os dois fragmentos 
a serem sequenciados. As bibliotecas mate-pair são ideais para sequenciamento de regiões 
mais longínquas do genoma. Os fragmentos contendo os adaptadores são ligados, por meio 
do pareamento do adaptador P1, a uma sequência curta complementar presente na superfície 
da bead. Apenas um tipo de fragmento se liga a uma determinada bead que, posteriormente, é 
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“capturada” individualmente em gotículas onde a PCR em emulsão ocorre. Milhares de cópias 
do mesmo fragmento são produzidas nessa fase.
A plataforma SOLiD® emprega um método de sequenciamento diferente das outras duas 
metodologias descritas anteriormente, sendo utilizada a enzima DNA ligase, e não a DNA poli-
merase. O princípio desta técnica consiste na utilização de uma sonda com oito nucleotídeos, 
dos quais apenas os dois iniciais são informativos. Os três nucleotídeos seguintes podem ser 
qualquer dos quatro tipos de nucleotídeos (degenerados em todas as posições). E os três úl-
timos são iguais (universais) capazes de parear com qualquer outro nucleotídeo (geralmente 
são inosina ou algum análogo da inosina). No total, são utilizados 1.024 tipos de sondas duran-
te a etapa de sequenciamento por esta plataforma. Os primeiros kits de sequenciamento usam 
sondas contendo nucleotídeos informativos na posição central.
O sequenciamento do DNA alvo ocorre em função da hibridização de sondas fluorescentes 
em cinco etapas distintas. Na primeira etapa, a ligação de um primer de tamanho n (oligo n) ao 
adaptador P1 cria a condição necessária para ligação da primeira sonda ao complexo formato 
por: DNA alvo a ser sequenciado, adaptador P1 e bead. O tamanho do primer é importantís-
simo para o processo, pois determina a posição onde a primeira sonda deve se ligar ao DNA 
alvo. A DNA ligase é responsável pela ligação covalente do último nucleotídeo do primer com 
o primeiro nucleotídeo informativo da sonda. Em seguida, tem-se a excitação do fluoróforo da 
primeira sonda incorporada e detecção da fluorescência emitida, que é convertida em cor por 
meio de softwares específicos. Posteriormente, ocorre a clivagem num ponto específico da 
sonda liberando as três bases universais e o fluoróforo. Esta clivagem finaliza o primeiro ciclo 
e permite a inserção de uma nova sonda por deixar um fosfato livre na extremidade 5’. No se-
gundo ciclo, uma segunda sonda é ligada ao DNA molde com posterior excitação do fluoróforo 
e clivagem no ponto específico, liberando as bases universais e o fluoróforo. Este ciclo é re-
petido inúmeras vezes (lembrando que o pool de sondas contém dinucleotídeos informativos 
aptos a hibridizar com qualquer sequência encontrada no DNA alvo), até que o DNA molde seja 
todo coberto por sondas. Os passos descritos até este ponto constituem a primeira etapa do 
sequenciamento e, como resultado, tem-se todo o DNA molde coberto por dinucleotídeos in-
formativos separados por três nucleotídeos não informativos. A segunda etapa é iniciada com 
a desnaturação da sequência de DNA dupla fita originada e hibridização de um segundo primer 
de tamanho n-1. Todos os passos referentes à primeira etapa são repetidos e, no final, temos 
um DNA molde todo coberto por dinucleotídeos informativos. O segundo primer é um nucleo-
tídeo menor que o primeiro, e este fato faz com que os dinucleotídeos informativos sejam in-
corporados uma posição anterior ao dos dinucleotídeos informativos incorporados na primeira 
etapa. Assim, teremos na segunda etapa um dos nucleotídeos do dinucleotídeo informativo 
incorporado numa nova posição e o outro incorporado numa posição que já era conhecida da 
primeira etapa. Desta forma, cada nucleotídeo é sequenciado duas vezes, sendo essa uma das 
vantagens deste método. Esse processo é repetido para as etapas três, quatro e cinco que uti-
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lizam, respectivamente, primers de tamanho (n – 2), (n – 3) e (n – 4). Após estas cinco etapas, 
temos como resultado um sistema de cores que representa a informação contida ao longo de 
toda extensão do DNA alvo. O próximo passo consiste em decodificar as cores obtidas nas 
cinco etapas descritas anteriormente em sequências de nucleotídeos. Para aprender como 
este processo é feito, deve-se, inicialmente, entender que a combinação dos quatro nucleotí-
deos resulta em 16 dinucleotídeos possíveis. No entanto, o método utiliza apenas quatro tipos 
de fluoróforos (quatro cores). Assim, teremos uma cor representando quatro dinucleotídeos.
Como saber então qual dinucleotídeo uma determinada cor representa?
A resposta vem do conhecimento do nucleotídeo pertencente à posição zero (último nucle-
otídeo do primer de tamanho n – 1), que geralmente é uma adenina. Sabendo que a primeira 
base é uma adenina e considerando que cada base é sequenciada duas vezes, temos que a 
segunda base deste nucleotídeo deve ser igual à primeira base do dinucleotídeo seguinte. Con-
tinuando neste raciocínio é possível seguir um caminho e chegar na sequência de nucleotídeos 
final do DNA molde. Desta forma, é possível conhecer qual dinucleotídeo uma determinada cor 
representa. Esta é a tecnologia de segunda geração que proporciona maior acurácia, devido 
ao fato de cada base ser sequenciada duas vezes. Como o erro é, na maioria das vezes, alea-
tório, a probabilidade de ocorrer dois erros na mesma posição, durante o sequenciamento, é 
quase zero. Por esse motivo, esta plataforma é a mais indicada para estudos de polimorfismos 
(SNPs), os quais são confundidos com erro de sequenciamento em outras plataformas. O ta-
manho dos fragmentos gerados são de, no máximo, 75pb, podendo ser gerado até 1 bilhão de 
reads por corrida.
Montagem de Genomas
O ideal seria sequenciar o genoma inteiro ou o maior tamanho de fragmento possível. No 
entanto, a maioria das técnicas de sequenciamento apresentadas anteriormente utiliza a en-
zima DNA polimerase para incorporação de nucleotídeos à cadeia de DNA nascente, sendo o 
tamanho dos fragmentos gerados uma limitação destas técnicas, uma vez que a velocidade de 
processamento desta enzima é limitada. Como consequência são gerados fragmentos peque-
nos, se comparados ao tamanho do genoma, medindo no máximo 800 pares de bases.
Como montar então genomas com milhões ou até mesmo bilhões de pares de bases?
Este processo é efetuado a partir do desenvolvimento de vários programas de montagem 
(assemblers) que alinham os fragmentos gerados baseando-se em regiões de sobreposição 
entre eles para produzir sequências únicas denominadas contigs. Um passo anterior à mon-
tagem consiste na retirada de regiões que não fazem parte do genoma do organismo sequen-
ciado, tais como vetores e adaptadores. O ideal é que após a ordenação destes fragmentos, 
obtenhamos uma sequência única para genomas circulares, ou várias sequências contíguas, 
representando o número total de cromossomos da espécie. Um problema que persiste, mesmo 
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com o crescente investimento no refinamento dos programas de montagem, é a montagem de 
regiões repetidas do genoma, devido à dificuldade de ordenar corretamente estas regiões.
Outro problema inerente aos sequenciadores atuais é a incorporação errônea de nucleotí-
deos pela DNA polimerase à cadeia de DNA nascente. Como resultado, temos, entre os milha-
res de fragmentos amplificados, alguns contendo determinados nucleotídeos incorporados de 
forma equivocada pela polimerase. Para contornar o problema referente à incorporação errô-
nea de nucleotídeos à cadeia de DNA, torna-se necessário que cada posição de base do cro-
mossomo seja representada várias vezes, fazendo com que o número de bases sequenciadas 
seja 10 vezes ou mais o tamanho do genoma original. Outra forma de resolver os problemas 
de montagem apresentados anteriormente foi associar um valor de qualidade (Base-Calling) 
a cada nucleotídeo sequenciado, fato este que permite eliminar ou mascarar sequências (ou 
nucleotídeos) com baixo valor de qualidade.
Predição Gênica
Após sequenciar e “montar” o genoma de um determinado organismo é preciso efetuar 
uma varredura em busca das sequências de nucleotídeos correspondentes a cada um de seus 
genes (predição gênica) ou de outras regiões de interesse. Existem, para esta finalidade, diver-
sos programas de bioinformática, cada um com suas peculiaridades metodológicas. O princí-
pio básico desta metodologia consiste em fazer com que o programa reconheça nucleotídeos 
que são característicos de um determinado tipo de elemento gênico. Desta forma, é possível 
identificar: regiões promotoras, junção do éxons com os íntrons, os códons de início e parada 
da tradução e consequentemente onde começam as regiões 5’ e 3’ UTR (regiões não traduzi-
das “Untranslated Regions”). Desta forma, os programas são capazes de predizer a sequência 
do gene, identificando o conjunto gênico de um organismo após seu sequenciamento. Progra-
mas específicos podem ser utilizados para identificação de outras regiões do genoma, tais 
como: marcadores moleculares, regiões repetitivas, elementos transponíveis etc.
Anotação Gênica
O processo de anotação consiste em descobrir os diversos elementos presentes no geno-
ma e atribuir a eles o máximo de informações biológicas possível. Na maioria das vezes, es-
tamos interessados em descobrir os genes e suas respectivas funções (ou seja, seu provável 
produto), a fim de entender os fenômenos biológicos que acontecem nos organismos.
A anotação pode ser automática ou manual. A primeira é efetuada através de programas 
de bioinformática capazes de anotar o conjunto gênico de um organismo de uma só vez. A se-
gunda é muito mais demorada, pois é efetuada, pelo anotador, para cada gene separadamente. 
É evidente que a segunda forma é a mais indicada por ser mais confiável. Na prática, ocorrem 
os dois tipos de anotação, sendo a anotação automática mais comum devido à grande quan-
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tidade de dados biológicos gerados e devido ao tempo gasto para efetuar a anotação manual. 
UniProtKB/Swiss-Prot (http://www.uniprot.org/uniprot/) é o principal banco de dados biológico 
destinado ao armazenamento de sequências proteicas revisadas (anotadas manualmente). 
Diversos programas de bioinformática destinados a este propósito surgiram em consequência 
da grande quantidade de dados genômicos gerados diariamente.
O princípio básico destes programas baseia-se em comparar a sequência de cada ORF 
(Open reading frame) ou transcrito, através de programas de alinhamento, com os diversos 
tipos de bancos de dados disponíveis. Desta forma, é possível identificar em genomas recém-
-sequenciados: os genes, as regiõespromotoras, as sequências repetitivas, os RNAs estáveis, 
os RNAs não codificantes (tRNA, rRNA, snRNA), além de inúmeros outros elementos. Grande 
parte das sequências depositadas nos bancos de dados públicos estão erroneamente anota-
das e, mesmo assim, estas sequências servem de base para a anotação de ORFs e transcritos. 
A propagação do erro constitui no maior problema que a anotação enfrenta hoje.
Mapas Genômicos
As informações genéticas contidas no genoma podem ser representadas por diversos ti-
pos de mapas genômicos, dentre os quais estão: mapas genéticos, físicos, de restrição, de 
bandeamento cromossômico, de ligação genética, entre inúmeros outros. Estes podem ser 
utilizados para representar as informações genéticas contidas em mitocôndrias, cloroplastos 
e plasmídeos. Os mapas físicos que consistem na representação da ordem dos genes no cro-
mossomo, levando em consideração a distância relativa entre eles, permitem conhecer a loca-
lização de um gene no cromossomo assim como suas regiões adjacentes, permitindo estudar 
as relações entre espécies. Este tipo de mapa nos permite ainda identificar regiões do genoma 
com maior probabilidade de ocorrer recombinação, construção de linhagens genéticas e des-
coberta de funções de genes.
Os mapas físicos utilizam o número de pares de bases (pb) como unidade para mensurar a 
distância entre os genes e podem trazer inúmeras informações, como número de genes, suas 
respectivas posições, orientações, nomenclatura e função.
Meu Deus, que aula!!!!
Foi pesada, mas tene absorver, demore o tempo que for, o MÁXIMO possível desse pre-
cioso conteúdo... porque não é fácil compreender e pode, sim, ser o diferencial para a sua 
aprovação...
Espero que tenha aproveitado bem todo o conteúdo.
Vamos praticar algumas questões e boa sorte nas suas próximas provas!
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QUESTÕES DE CONCURSO
001. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) A clonagem de moléculas 
de DNA envolve a utilização de uma série de enzimas. Sobre essas enzimas e suas respectivas 
funções, assinale a alternativa incorreta.
a) Exonucleases podem remover nucleotídeos um a um das pontas de moléculas de DNA.
b) Endonucleases podem clivar pontes fosfodiéster internas de moléculas de DNA.
c) DNA Ligases podem unir dois fragmentos dupla fita de DNA.
d) DNA polimerase podem sintetizar uma nova molécula de DNA complementar a uma fita de 
DNA já existente.
e) Fosfatases alcalinas podem remover um grupamento fosfato presente na ponta 3’ de uma 
molécula de DNA.
002. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) As enzimas utilizadas 
para manipular o DNA podem ser divididas em grupos, dependendo do tipo da reação que elas 
catalisam. Um grupo de enzimas praticamente não utilizado para manipulação do DNA é o das:
a) Nucleases.
b) Ligases.
c) Isomerases.
d) Polimerases.
e) Enzimas modificadoras.
003. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Plasmídeos são molécu-
las circulares de DNA encontrados em bactérias. Elas são utilizadas como vetores para a clo-
nagem de genes e, portanto, fundamentais para o estudo de genes. Sobre as características 
típicas encontradas em plasmídeos utilizados para clonagem, assinale a alternativa incorreta.
a) O plasmídeo precisa ter um marcador de seleção que confere resistência a bactéria a um 
antibiótico específico.
b) O plasmídeo precisa ter uma origem de replicação, que permite a multiplicação independen-
te do DNA bacteriano.
c) O plasmídeo usualmente tem sítio múltiplo de clonagem que permite a utilização de várias 
enzimas de restrição durante a clonagem.
d) O plasmídeo precisa ter mais de 10.000 pb de forma que seja estável na bactéria.
e) O plasmídeo usualmente tem um sítio para anelamento de iniciadores de PCR para sequen-
ciamento M13 próximos ao sítio de inserção.
004. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Uma série de técnicas 
são usualmente utilizadas para estudo da expressão de genes. Sobre técnicas de análise da 
expressão gênica, assinale a alternativa incorreta.
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a) O Northernblot é uma técnica de avaliação da expressão gênica que apresenta tipicamente 
uma alta sensibilidade e necessita de pequenas quantidades de material biológico, quando 
comparada a outras técnicas como o RT-PCR.
b) O RT-PCR é uma técnica para avaliação da expressão gênica que depende de uma etapa de 
síntese de cDNA.
c) A técnica de RT-PCR em tempo real é mais acurada para a avaliação da expressão gênica 
quando comparada a outras técnicas como o RT-PCR.
d) A hibridização in situ de mRNA permite identificar a localização espacial da expressão gêni-
ca em um determinado tecido ou órgão.
e) Para a realização da hibridização in situ, a preparação do tecido ou órgão do organismo em 
questão deve proteger o mRNA da degradação e também preservar as estruturas celulares.
005. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Uma forma de amplificar 
um fragmento de DNA é a clonagem em plasmídeo e a transformação de uma cepa bacteriana 
para posterior extração do DNA plasmidial. A classificação mais utilizada para plasmídeos é a 
baseada em características do DNA. Sobre os cinco principais tipos de plasmídeos, assinale a 
alternativa incorreta.
a) Plasmídeos de resistência – Carregam genes que conferem à bactéria hospedeira resistên-
cia a um ou mais agentes antibacteriano como, por exemplo, o da ampicilina.
b) Plasmídeos de virulência – Conferem patogenicidade à bactéria hospedeira.
c) Plasmídeos de fertilidade (F) – Possuem a característica de promover a transferência de 
plasmídeos.
d) Plasmídeos degradativos – Carregam genes que permitem a bactéria hospedeira a metabo-
lizar moléculas não usualmente metabolizadas.
e) Plasmídeos Col – Carregam genes para as colicinas, proteínas que promovem o crescimen-
to bacteriano.
006. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Dentre as técnicas a se-
guir, assinale a que não é considerada uma técnica de genômica funcional.
a) Microarranjos de DNA.
b) Hibridização in situ.
c) Estudo da interação gênica por análise supressor em larga escala.
d) Perturbação gênica ou nocaute gênico em larga escala.
e) Estudo da interação gênica pelo sistema duplo híbrido em larga escala.
007. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Um dos pontos mais im-
portantes na reação de PCR é a razão ótima entre iniciadores e DNA molde. Sobre esse tema, 
assinale a afirmativa incorreta.
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a) Caso a razão oligo/DNA molde seja alta, ocorrerá a formação de dímeros de oligos.
b) A complexidade do DNA molde usado na reação não é um fator que interfere na razão oligo/
DNA molde.
c) Caso a razão oligo/DNA molde seja baixa, o produto do PCR não será acumulado expo-
nencialmente.
d) Uma razão oligo/DNAmolde baixa resulta na renaturação da fitas recém sintetizadas, após 
a desnaturação, levando a baixa eficiência da reação.
e) Para a maioria dos casos, a concentração de iniciador não deve ser muito maior que 0,5 M.
008. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Dentre as sentenças abai-
xo, selecione aquela que descreve uma etapa não presente no procedimento de uma reação 
de PCR padrão.
a) Resfriamento da amostra a 16ºC por 30 segundos a cada ciclo.
b) Anelamento dos iniciadores no DNA alvo a 55ºC por um minuto a cada ciclo.
c) Desnaturação da amostra a 95ºC por 40 segundos a cada ciclo.
d) Alongamento/Polimerização a 72ºC por um minuto a cada ciclo.
e) Desnaturação inicial da amostra a 95ºC por cinco minutos.
009. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Para o desenho dos ini-
ciadores ou oligonucleotídeos para reação de PCR, algumas orientações precisam ser segui-
das de forma a garantir o sucesso da amplificação. Selecione dentre as sentenças abaixo 
aquela que corresponde a uma orientação errada.
a) Os iniciadores devem ter entre 18 e 22 nucleotídeos.
b) A temperatura de desnaturação dos iniciadores deve estar entre 52 e 58ºC salvo em reações 
de PCR não usuais.
c) O conteúdo de CG (número total de Guaninas e Citosinas no iniciador em relação ao número 
total de bases) deve estar entre 40 e 60%.
d) Mais de três guaninas ou citosinas devem ser preferencialmente colocadas nos últimos 
cinco nucleotídeos da ponta 3’ dos iniciadores.
e) Regiões de complementaridade entre os dois iniciadores de uma reação de PCR devem 
ser evitadas.
010. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) A alternativa que melhor 
define um gene de referência ou gene normalizador em um PCR quantitativo para avaliação da 
expressão é um gene:
a) muito expresso.
b) pouco expresso.
c) com expressão conspícua em todas as células.
d) com expressão em uma situação particular fisiológica.
e) não expresso.
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011. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Para a extração de RNA/
DNA, uma das etapas mais importante é a eliminação das proteínas durante o processo de 
purificação. Para a eliminação de proteínas na extração de RNA/DNA, assinale a afirmativa 
inadequada.
a) Digestão das amostras com a enzima proteinase K.
b) Extrações com misturas de solventes orgânicos como fenol e clorofórmio por repetidas vezes.
c) Solubilização em tampões de guanidina.
d) Precipitação salina.
e) Solubilização em tampões ácidos (pH menor que 3,5).
012. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Recentemente, a tecno-
logia do RNA-sequencing (RNA-seq) vem sendo considerada como uma alternativa ao micro-
arranjo de DNA para estudo da expressão gênica. Sobre as vantagens do RNA-seq quando 
comparado ao microarranjo de DNA, assinale a afirmativa incorreta.
a) A única tecnologia de sequenciamento high-throughput habilitada para realizar RNA-seq é a 
Roche 454 life Science.
b) O RNA-seq não é restrito ao estudo de organismos que possuem o genoma sequenciado 
como microarranjo de DNA.
c) O RNA-seq é mais atraente do que o microarranjo de DNA para organismos não-modelo.
d) O RNA-seq pode revelar informações como junção exon exon, o que não ocorre no microar-
ranjo de DNA.
e) O RNA-seq pode revelar variações (como SNPs) em regiões transcritas o que não ocorre no 
microarranjo de DNA.
013. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) A tecnologia de sequen-
ciamento da Illumina® é considera uma das principais formas de sequenciamento de última 
geração. Sobre a tecnologia Illumina®, assinale a afirmativa incorreta.
a) Na preparação do DNA para o sequenciamento, é desnecessária a ligação de adaptado-
res de DNA.
b) Na etapa inicial, as fitas simples de DNA se ligam randomicamente a superfície.
c) Para a amplificação, a enzima incorpora nucleotídeos para produzir uma dupla fita em ponte 
que realizada em um substrato sólido.
d) A etapa de desnaturação da dupla fita produzida deixa as fitas simples ancoradas no 
substrato.
e) A etapa de amplificação termina quando são formados milhões de agrupamentos de fita 
duplas de DNA com alta densidade no substrato sólido.
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014. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/OPERAÇÃO DE LABORATÓRIO DE NÍVEL 
DE SEGURANÇA/FIOCRUZ/2010) Sobre a utilização da técnica de PCR com a finalidade de 
diagnóstico molecular, analise as afirmativas a seguir.
I – Uma vez que na reação de PCR se utiliza uma DNA Polimerase dependente de DNA, somen-
te os vírus cujo genoma é constituído por DNA podem ser detectados pela técnica de PCR.
II – É possível detectar microorganismos diferentes em uma mesma reação de PCR, desde 
que se utilize na reação pares de iniciadores específicos para cada microorganismo que se 
queira detectar.
III – A utilização da técnica de PCR para diagnóstico molecular terá sempre e somente caráter 
qualitativo.
Assinale:
a) se somente a afirmativa I estiver correta.
b) se somente a afirmativa II estiver correta.
c) se somente a afirmativa III estiver correta.
d) se somente as afirmativas I e II estiverem corretas.
e) se todas as afirmativas estiverem corretas.
015. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/OPERAÇÃO DE LABORATÓRIO DE NÍVEL 
DE SEGURANÇA/FIOCRUZ/2010) O estabelecimento de uma reação de PCR para o diagnós-
tico molecular de agentes infecciosos a partir de amostras biológicas muitas vezes apresenta 
como maior dificuldade a amplificação específica do fragmento genômico do patógeno de 
interesse. As afirmativas a seguir enumeram possibilidades para aumentar a especificidade 
da reação.
I – Aumento da concentração de deoxinucleotídeo na reação de PCR.
II – Aumento da concentração da DNA polimerase na reação de PCR.
III – Realização de reações de PCR aninhadas (PCR-nested), utilizando par de iniciadores mais 
externos à região de interesse na primeira reação, seguido da utilização de par de iniciadores 
mais internos.
Assinale:
a) se somente a afirmativa I estiver correta.
b) se somente a afirmativa II estiver correta.
c) se somente a afirmativa III estiver correta.
d) se somente as afirmativas I e II estiverem corretas.
e) se todas as afirmativas estiverem corretas.
016. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/OPERAÇÃO DE LABORATÓRIO DE NÍVEL 
DE SEGURANÇA/FIOCRUZ/2010) Os seguintes componentes essenciais são requeridos em 
uma reação de PCR, exceto:
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a) Um par de oligonucleotídeos.
b) DNA polimerase termoestável.
c) DNA molde e cátion divalente.
d) Tampão para manter o pH e cátions monovalentes.
e) Dideoxinucleotídeostrifosfatados.
017. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/OPERAÇÃO DE LABORATÓRIO DE NÍVEL 
DE SEGURANÇA/FIOCRUZ/2010) Sobre as boas práticas laboratoriais relacionadas à rotina 
de diagnóstico molecular por PCR, analise as afirmativas a seguir.
I – A única áreaque deve ser separada fisicamente das demais, no laboratório que realiza diag-
nóstico molecular por PCR, é a área onde é realizada a extração de ácidos nucleicosa partir das 
amostras clínicas.
II – O fluxo de trabalho, no laboratório que realiza diagnóstico molecular por PCR, deve ser 
sempre a partir da área livre de DNA para a área onde os tubos das reações finais de PCR são 
abertos ou manipulados (área que contém amplicons).
III – Para a pipetagem das misturas de PCR, diluição de oligonucleotídeos etc. não é necessá-
ria a utilização de ponteiras com barreira.
Assinale:
a) se somente a afirmativa I estiver correta.
b) se somente a afirmativa II estiver correta.
c) se somente a afirmativa III estiver correta.
d) se somente as afirmativas I e II estiverem corretas.
e) se todas as afirmativas estiverem corretas.
018. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Logo após a amplificação do material genético por PCR, o sequen-
ciamento de um isolado viral extraído de plasma, a partir de um paciente com suspeita de 
infecção por HIV-1, pode servir para:
a) medir a carga viral no plasma do paciente.
b) detectar a quantidade de provírus nos macrófagos do paciente.
c) confirmar que o diagnóstico por PCR não é um falsopositivo.
d) detectar a presença de anticorpos neutralizantes contra HIV-1.
e) confirmar a presença de glicoproteínas do envelope viral.
019. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) A técnica de RT-PCR utiliza como enzima de reação:
a) uma RNA polimerase II humana.
b) uma DNA polimerase I de E. coli.
c) uma RNA polimerase III de levedura.
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d) uma protease viral.
e) uma transcriptase reversa viral.
020. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Northern blot é uma técnica molecular capaz de detectar:
a) DNA.
b) RNA.
c) proteínas.
d) anticorpos.
e) células.
021. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) A técnica de Southern blot permite a detecção de:
a) RNA mensageiro viral específico presente no citoplasma da célula hospedeira.
b) DNA genômico viral integrado à célula hospedeira.
c) RNA genômico viral em partículas livres.
d) glicoproteínas de envelope em partículas virais livres.
e) anticorpos antivirais específicos no soro do paciente.
022. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Dentre as técnicas moleculares para diagnóstico viral, as listadas a 
seguir fazem uso de gel de agarose ou poliacrilamida para revelar a presença de material ge-
nético, exceto:
a) PCR.
b) RFLP.
c) PCR em tempo real.
d) Northern blot.
e) Southern blot.
023. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Para a realização da técnica de PCR não é necessário:
a) enzima DNA polimerase.
b) iniciadores.
c) os quatro nucleosídeos trifosfatados.
d) magnésio.
e) anticorpos fusionados com peroxidase.
024. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) O grupo de vírus que devem passar obrigatoriamente pela técnica 
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de RT-PCR para terem seu material genético detectados, na forma de partículas virais livres, é 
composto pelos vírus:
a) HIV, HCV e influenza.
b) HIV, herpes e HBV.
c) HBV, HCV e herpes.
d) HIV, influenza e HBV.
e) influenza, herpes e HCV.
025. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Dentre as vantagens do uso da técnica de PCR para diagnóstico viral 
não se inclui:
a) detecção de vírus que não podem ser cultivados in vitro.
b) detecção de vírus que crescem lentamente em cultura.
c) detecção de antígenos virais expostos pelo sistema MHC na superfície celular de macrófagos.
d) uso de pequena quantidade de material biológico humano, como sangue ou fluido ocular, 
para detecção de ácido nucléico viral.
e) permite a detecção de vírus para o qual a detecção de antígenos não é possível.
026. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Sobre o uso da técnica de PCR na clínica para diagnosticar infecções 
virais, analise as afirmativas a seguir.
I – A técnica tem a vantagem de fornecer um diagnóstico viral específico.
II – O risco de falsos positivos é inexistente.
III – A técnica é restrita ao diagnóstico de poucos vírus.
IV – O PCR apresenta risco inexistente de contaminação de material genético.
Assinale:
a) se apenas a afirmativa I estiver correta.
b) se apenas as afirmativas I e IV estiverem corretas.
c) se apenas as afirmativas II e III estiverem corretas.
d) se apenas as afirmativas I, II e IV estiverem corretas.
e) se todas as afirmativas estiverem corretas.
027. (PR-4 UFRJ/BIOMÉDICO/UFRJ/2012) Para uma reação de PCR ocorrer corretamente, 
são necessários os seguintes componentes:
a) uma polimerase de DNA termolábil, desoxirribonucleotídeostrifosfatados, um par de inicia-
dores e um molde de ácido nucleico.
b) uma polimerase de DNA termoestável, desoxirribonucleosídeos, um par de iniciadores e um 
molde de DNA.
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c) uma polimerase de DNA termoestável, desoxirribonucleotídeostrifosfatados, dois pares de 
iniciadores e um molde de ácido nucleico.
d) uma polimerase de DNA termolábil, desoxirribo-nucleotídeos trifosfatados, um iniciador e 
um molde de RNA.
e) uma polimerase de DNA termoestável, desoxirribonucleotídeostrifosfatados, um par de ini-
ciadores e um molde de DNA.
028. (PR-4 UFRJ/BIOMÉDICO/UFRJ/2012) As enzimas de restrição são ferramentas bási-
cas muito utilizadas na Engenharia Genética, desempenhando funções específicas na molé-
cula de DNA.
A esse respeito, avalie o que se afirma sobre as enzimas de restrição.
I – Têm a capacidade de clivar tanto DNA como RNA.
II – São capazes de inibir a síntese de RNA a partir do DNA.
III – Podem ser utilizadas para cortar várias sequências diferentes de DNA.
IV – São capazes de reconhecer sequências de bases específicas em moléculas de DNA, cor-
tando-as nesses pontos específicos.
Está correto apenas o que se afirma em Alternativas
a) IV.
b) II e III.
c) I, III, IV.
d) I, II e IV.
029. (FGV/ANALISTA DE PATOLOGIA CLÍNICA/FUNSAÚDE-CE/2021) Em relação à reação 
de PCR, analise as afirmativas a seguir e assinale (V) par a verdadeira e (F) para a falsa.
(  )	� As etapas fundamentais de uma reação de PCR são a desnaturação térmica do DNA 
molde, o anelamento do oligonucleotídeo iniciador às fitas moldes e a extensão ou po-
limerização das novas fitas de DNA que utilizam os dNTPs como substrato da reação 
de polimerização.
(  )	� O magnésio é um cofator da enzima DNA polimerase, sendo sua concentração funda-
mental para a correta realização da reaçãode PCR. O ajuste incorreto da quantidade 
deste íon pode gerar artefatos na reação, uma vez que concentrações baixas de Mg 
podem impedir a desnaturação completa do molde de DNA, além de diminuir a especi-
ficidade da reação; já concentrações altas de Mg não permitem a realização da reação.
(  )	� A concentração de dNTPs (dATP, dCTP, dGDP e dTTP) deve ser calculada de modo que 
dCTP e dGDP tenham o dobro da concentração dos demais desoxirribonucleotídeos.
As afirmativas são, na ordem apresentada, respectivamente:
a) F – V – F.
b) F – V – V.
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Biologia Molecular – Parte IV
BIOLOGIA MOLECULAR
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c) V – F – F.
d) V – V – F.
e) F – F – V.
030. (UFMG/TÉCNICO/BIOLOGIA/LABORATÓRIO/UFMG/2016) Em relação às ferramentas 
da tecnologia do DNA e seus usos, todas as associações abaixo estão corretas, EXCETO:
a) DNA Ligase – RFLPs.
b) Trasncriptase reversa – produção de cDNA a partir de mRNA.
c) Plamídeos–clonagem de DNA recombinante.
d) Taq DNA Polimerase – PCR.
031. (UFMG/TÉCNICO/BIOLOGIA/LABORATÓRIO/UFMG/2016) O método de Southern blot-
ting foi assim batizado devido ao nome de seu inventor, o biólogo britânico Edwin Southern.
Em relação a esse método, é correto afirmar, EXCETO:
a) fragmentos de DNA radioativos são utilizados como sondas para a detecção das sequ-
ências alvo.
b) fragmentos de DNA obtidos pela digestão com enzimas de restrição são separados em gel 
de eletroforese de acordo com o tamanho.
c) enzimas de restrição são utilizadas para digerir longas moléculas DNA de fitas simples em 
fragmentos menores.
d) os fragmentos de DNA presentes no gel são desnaturados, transferidos para uma membra-
na de nitrocelulose (blotting) e hibridizados com uma sonda.
032. (UNOESC/FARMACÊUTICO/PREFEITURA DE TREZE TÍLIAS-SC/2020) A reação da ca-
deia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular que permite o desenvolvimento 
do estudo de sequências de ácidos nucleicos, em que três fases são necessárias e são repeti-
das inúmeras vezes. Assinale a alternativa que corresponde à terceira fase dessa metodologia 
molecular.
a) A extensão, ou polimerização, envolve a ativação do Taq Polimerase seguida da síntese de 
novas cadeias.
b) A desnaturalização, na qual ocorre o aumento da temperatura com a finalidade de romper as 
pontes de hidrogênio e, assim, permitir a abertura da dupla fita.
c) O posicionamento, no qual são determinadas frações que são quantificadas por densitome-
tria ou eluição, em que é gerado um gráfico de forma que as bandas podem ser comparadas, 
possibilitando qualquer sinal de desequilíbrio
d) O anelamento, que realiza a ligação dos primes na região particular que se quer amplificar e 
é definido pela redução da temperatura.
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Biologia Molecular – Parte IV
BIOLOGIA MOLECULAR
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033. (IBADE/TÉCNICO EM LABORATÓRIO/PREFEITURA DE MINISTRO ANDERAZZA-
-RO/2020) A reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) possui 
grande aplicabilidade em exames laboratoriais. Sobre essa técnica, pode-se afirmar que estão 
corretas as seguintes afirmativas, EXCETO:
a) Apresenta a vantagem de permitir identificar patógenos, sem a necessidade de realização 
de seu isolamento e cultura de crescimento.
b) Está baseada na multiplicação, e posterior identificação, de sequências de nucleotídeos ou 
de aminoácidos característicos de um organismo.
c) Amplifica quantidades diminutas de material da amostra, exigindo execução cuidadosa para 
evitar comprometimento do diagnóstico devido à contaminação.
d) A modalidade RT-PCR exige que, inicialmente, uma amostra de RNA sofra a ação de uma 
transcriptase reversa para originar o cDNA que será amplificado.
e) Cada ciclo de amplificação da amostra, realizado em termociclador, possui três etapas: des-
naturação, anelamento e extensão (ou polimerização).
034. (VUNESP/TÉCNICO EM ANÁLISES CLÍNICAS/EBSERH/2020) Qual é o método ampla-
mente utilizado como teste confirmatório dos resultados positivos e indeterminados obtidos 
em testes imunoenzimáticos para a síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA ou AIDS)?
a) Imunofluorescência direta.
b) Radioimunoensaio.
c) Aglutinação direta.
d) Western-blot.
e) Fixação do complemento
035. (UFMT/PROFISSIONAL DE NÍVEL SUPERIOR COMPLETO DO SUS/BIÓLOBO/PREFEI-
TURA DE VÁRZEA GRANDE-MT/2018) A PCR em Tempo Real também denominada qPCR, 
foi descrita pela primeira vez em 1993 por Higuchi e seus colaboradores. Sobre esse tema, 
marque V para as afirmativas verdadeiras e F para as falsas.
(  )	� Ela é uma variante da reação de PCR convencional, pois a amplificação e a detecção 
ocorrem simultaneamente, com possibilidade de gerar resultados quantitativos com 
maior precisão.
(  )	� A quantificação na PCR em Tempo Real é mensurada pela quantidade de produto am-
plificado durante cada ciclo (através da fluorescência emitida). Essa metodologia utiliza 
um equipamento com sistema de monitoramento da emissão de fluorescência.
(  )	� Na PCR convencional, é necessária a preparação de gel de agarose para visualização; 
na PCR em tempo real não ocorre manipulação pós- PCR.
Assinale a sequência correta.
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a) V, F, F.
b) F, V, F.
c) F, F, V.
d) V, V, V.
036. (FCC/TÉCNICO EM PATOLOGIA CLÍNICA/PREFEITURA DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO-
-SP/2019) A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem como base a:
a) amplificação de moléculas de DNA.
b) amplificação de moléculas de RNA.
c) identificação de proteínas.
d) degradação do DNA.
e) termorreação para hidratação do DNA.
037. (CESGRANRIO/TÉCNICO DE LABORATÓRIO/ANÁLISES CLÍNICAS/UNIRIO/2019) 
Para o diagnóstico molecular de doenças virais, depara-se tanto com vírus cujo material gené-
tico é constituído de DNA, quanto com vírus constituído de RNA.
Para o diagnóstico de viroses causadas por vírus do tipo RNA, que tipo de método molecular 
deve ser utilizado?
a) RT-PCR.
b) IFI.
c) PCR.
d) Nested PCR.
e) Hibrização in situ.
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GABARITO
1. b
2. c
3. d
4. a
5. e
6. e
7. e
8. a
9. d
10. c
11. e
12. a
13. a
14. b
15. c
16. d
17. b
18. b
19. e
20. b
21. b
22. c
23. e
24. a
25. c
26. a
27. e
28. a
29. d
30. a
31. c
32. a
33. b
34. d
35. d
36. a
37. a
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GABARITO COMENTADO
001. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) A clonagem de moléculas 
de DNA envolve a utilização de uma série de enzimas. Sobre essas enzimas e suas respectivas 
funções, assinale a alternativa incorreta.
a) Exonucleases podem remover nucleotídeos um a um das pontas de moléculas de DNA.
b) Endonucleases podem clivar pontes fosfodiéster internas de moléculas de DNA.
c) DNA Ligases podem unir dois fragmentos dupla fita de DNA.
d) DNA polimerase podem sintetizar uma nova molécula de DNA complementar a uma fita de 
DNA já existente.
e) Fosfatases alcalinas podem remover um grupamento fosfato presente na ponta 3’ de uma 
molécula de DNA.
As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição, são enzimas que cortam a molécula 
de DNA através do reconhecimento de sequências nucleotídicas específicas.
Letra b.
002. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) As enzimas utilizadas 
para manipular o DNA podem ser divididas em grupos, dependendo do tipo da reação que elas 
catalisam. Um grupo de enzimas praticamente não utilizado para manipulação do DNA é o das:
a) Nucleases.
b) Ligases.
c) Isomerases.
d) Polimerases.
e) Enzimas modificadoras.
Isomerases são enzimas que realizam reações de interconversão entre isômeros óticos ou 
geométricos, não são enzimas comumente utilizadas nas técnicas de manipulação do DNA.
Letra c.
003. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Plasmídeos são molécu-
las circulares de DNA encontrados em bactérias. Elas são utilizadas como vetores para a clo-
nagem de genes e, portanto, fundamentais para o estudo de genes. Sobre as características 
típicas encontradas em plasmídeos utilizados para clonagem, assinale a alternativa incorreta.
a) O plasmídeo precisa ter um marcador de seleção que confere resistência a bactéria a um 
antibiótico específico.
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b) O plasmídeo precisa ter uma origem de replicação, que permite a multiplicação independen-
te do DNA bacteriano.
c) O plasmídeo usualmente tem sítio múltiplo de clonagem que permite a utilização de várias 
enzimas de restrição durante a clonagem.
d) O plasmídeo precisa ter mais de 10.000 pb de forma que seja estável na bactéria.
e) O plasmídeo usualmente tem um sítio para anelamento de iniciadores de PCR para sequen-
ciamento M13 próximos ao sítio de inserção.
O tamanho do plasmídeo pode variar entre poucos milhares a mais de cem mil pares de bases.
Letra d.
004. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Uma série de técnicas 
são usualmente utilizadas para estudo da expressão de genes. Sobre técnicas de análise da 
expressão gênica, assinale a alternativa incorreta.
a) O Northernblot é uma técnica de avaliação da expressão gênica que apresenta tipicamente 
uma alta sensibilidade e necessita de pequenas quantidades de material biológico, quando 
comparada a outras técnicas como o RT-PCR.
b) O RT-PCR é uma técnica para avaliação da expressão gênica que depende de uma etapa de 
síntese de cDNA.
c) A técnica de RT-PCR em tempo real é mais acurada para a avaliação da expressão gênica 
quando comparada a outras técnicas como o RT-PCR.
d) A hibridização in situ de mRNA permite identificar a localização espacial da expressão gêni-
ca em um determinado tecido ou órgão.
e) Para a realização da hibridização in situ, a preparação do tecido ou órgão do organismo em 
questão deve proteger o mRNA da degradação e também preservar as estruturas celulares.
A técnica RT-PCR possui uma sensibilidade maior, necessitando de quantidades menores de 
material genético, do que a técnica de NorthernBlot.
Letra a.
005. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Uma forma de amplificar 
um fragmento de DNA é a clonagem em plasmídeo e a transformação de uma cepa bacteriana 
para posterior extração do DNA plasmidial. A classificação mais utilizada para plasmídeos é a 
baseada em características do DNA. Sobre os cinco principais tipos de plasmídeos, assinale a 
alternativa incorreta.
a) Plasmídeos de resistência – Carregam genes que conferem à bactéria hospedeira resistên-
cia a um ou mais agentes antibacteriano como, por exemplo, o da ampicilina.
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b) Plasmídeos de virulência – Conferem patogenicidade à bactéria hospedeira.
c) Plasmídeos de fertilidade (F) – Possuem a característica de promover a transferência de 
plasmídeos.
d) Plasmídeos degradativos – Carregam genes que permitem a bactéria hospedeira a metabo-
lizar moléculas não usualmente metabolizadas.
e) Plasmídeos Col – Carregam genes para as colicinas, proteínas que promovem o crescimen-
to bacteriano.
As colicinas são proteínas que podem matar outras bactérias (toxinas bacterianas).
Letra e.
006. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Dentre as técnicas a se-
guir, assinale a que não é considerada uma técnica de genômica funcional.
a) Microarranjos de DNA.
b) Hibridização in situ.
c) Estudo da interação gênica por análise supressor em larga escala.
d) Perturbação gênica ou nocaute gênico em larga escala.
e) Estudo da interação gênica pelo sistema duplo híbrido em larga escala.
O sistema de duplo-híbrido permite a detecção de interações entre proteínas in vivo.
Letra e.
007. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Um dos pontos mais im-
portantes na reação de PCR é a razão ótima entre iniciadores e DNA molde. Sobre esse tema, 
assinale a afirmativa incorreta.
a) Caso a razão oligo/DNA molde seja alta, ocorrerá a formação de dímeros de oligos.
b) A complexidade do DNA molde usado na reação não é um fator que interfere na razão oligo/
DNA molde.
c) Caso a razão oligo/DNA molde seja baixa, o produto do PCR não será acumulado expo-
nencialmente.
d) Uma razão oligo/DNA molde baixa resulta na renaturação da fitas recém sintetizadas, após 
a desnaturação, levando a baixa eficiência da reação.
e) Para a maioria dos casos, a concentração de iniciador não deve ser muito maior que 0,5 M.
A concentração dos primers varia de 0,5M a 1,0M, dependendo do protocolo utilizado.
Letra e.
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008. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Dentre as sentenças abai-
xo, selecione aquela que descreve uma etapa não presente no procedimento de uma reação 
de PCR padrão.
a) Resfriamento da amostra a 16ºC por 30 segundos a cada ciclo.
b) Anelamento dos iniciadores no DNA alvo a 55ºC por um minuto a cada ciclo.
c) Desnaturação da amostra a 95ºC por 40 segundos a cada ciclo.
d) Alongamento/Polimerização a 72ºC por um minuto a cada ciclo.
e) Desnaturação inicial da amostra a 95ºC por cinco minutos.
Não existe etapas de resfriamento a 16ºC por 30 segundos a cada ciclo, o que existe é uma 
etapa final (após todos os ciclos) de resfriamentoa 4ºC.
Letra a.
009. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Para o desenho dos ini-
ciadores ou oligonucleotídeos para reação de PCR, algumas orientações precisam ser segui-
das de forma a garantir o sucesso da amplificação. Selecione dentre as sentenças abaixo 
aquela que corresponde a uma orientação errada.
a) Os iniciadores devem ter entre 18 e 22 nucleotídeos.
b) A temperatura de desnaturação dos iniciadores deve estar entre 52 e 58ºC salvo em reações 
de PCR não usuais.
c) O conteúdo de CG (número total de Guaninas e Citosinas no iniciador em relação ao número 
total de bases) deve estar entre 40 e 60%.
d) Mais de três guaninas ou citosinas devem ser preferencialmente colocadas nos últimos 
cinco nucleotídeos da ponta 3’ dos iniciadores.
e) Regiões de complementaridade entre os dois iniciadores de uma reação de PCR devem 
ser evitadas.
Três ou mais bases G ou C devem ser evitadas nas extremidades 3’ para não provocar estabi-
lidade em anelamentos inespecíficos.
Letra d.
010. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) A alternativa que melhor 
define um gene de referência ou gene normalizador em um PCR quantitativo para avaliação da 
expressão é um gene:
a) muito expresso.
b) pouco expresso.
c) com expressão conspícua em todas as células.
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BIOLOGIA MOLECULAR
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d) com expressão em uma situação particular fisiológica.
e) não expresso.
Gene normalizador ou de referência deve possuir expressão significativa no tecido de forma 
invariável.
Letra c.
011. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Para a extração de RNA/
DNA, uma das etapas mais importante é a eliminação das proteínas durante o processo de 
purificação. Para a eliminação de proteínas na extração de RNA/DNA, assinale a afirmativa 
inadequada.
a) Digestão das amostras com a enzima proteinase K.
b) Extrações com misturas de solventes orgânicos como fenol e clorofórmio por repetidas vezes.
c) Solubilização em tampões de guanidina.
d) Precipitação salina.
e) Solubilização em tampões ácidos (pH menor que 3,5).
Em pH 7,0 ou acima, o DNA permanece na fase aquosa e em pH abaixo de 7,0, ele é desna-
turado e migra para a fase orgânica. O fenol empregado nas extrações de DNA deve ter o pH 
próximo de 8,0 (fenol tamponado), já que faixas mais baixas de pH deslocam o DNA para a 
interface na hora da centrifugação
Letra e.
012. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) Recentemente, a tecno-
logia do RNA-sequencing (RNA-seq) vem sendo considerada como uma alternativa ao micro-
arranjo de DNA para estudo da expressão gênica. Sobre as vantagens do RNA-seq quando 
comparado ao microarranjo de DNA, assinale a afirmativa incorreta.
a) A única tecnologia de sequenciamento high-throughput habilitada para realizar RNA-seq é a 
Roche 454 life Science.
b) O RNA-seq não é restrito ao estudo de organismos que possuem o genoma sequenciado 
como microarranjo de DNA.
c) O RNA-seq é mais atraente do que o microarranjo de DNA para organismos não-modelo.
d) O RNA-seq pode revelar informações como junção exon exon, o que não ocorre no microar-
ranjo de DNA.
e) O RNA-seq pode revelar variações (como SNPs) em regiões transcritas o que não ocorre no 
microarranjo de DNA.
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Existem outras plataformas como a Illumina, por exemplo, que permite o sequenciamento de 
pequenos RNAs.
Letra a.
013. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/FIOCRUZ/2010) A tecnologia de sequen-
ciamento da Illumina® é considera uma das principais formas de sequenciamento de última 
geração. Sobre a tecnologia Illumina®, assinale a afirmativa incorreta.
a) Na preparação do DNA para o sequenciamento, é desnecessária a ligação de adaptado-
res de DNA.
b) Na etapa inicial, as fitas simples de DNA se ligam randomicamente a superfície.
c) Para a amplificação, a enzima incorpora nucleotídeos para produzir uma dupla fita em ponte 
que realizada em um substrato sólido.
d) A etapa de desnaturação da dupla fita produzida deixa as fitas simples ancoradas no 
substrato.
e) A etapa de amplificação termina quando são formados milhões de agrupamentos de fita 
duplas de DNA com alta densidade no substrato sólido.
Na técnica de sequenciamento da plataforma Illumina, o DNA é clivado, os fragmentos de 
tamanho apropriado são selecionados e ligados à adaptadores em ambas as extremidades.
Letra a.
014. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/OPERAÇÃO DE LABORATÓRIO DE NÍVEL 
DE SEGURANÇA/FIOCRUZ/2010) Sobre a utilização da técnica de PCR com a finalidade de 
diagnóstico molecular, analise as afirmativas a seguir.
I – Uma vez que na reação de PCR se utiliza uma DNA Polimerase dependente de DNA, somen-
te os vírus cujo genoma é constituído por DNA podem ser detectados pela técnica de PCR.
II – É possível detectar microorganismos diferentes em uma mesma reação de PCR, desde 
que se utilize na reação pares de iniciadores específicos para cada microorganismo que se 
queira detectar.
III – A utilização da técnica de PCR para diagnóstico molecular terá sempre e somente caráter 
qualitativo.
Assinale:
a) se somente a afirmativa I estiver correta.
b) se somente a afirmativa II estiver correta.
c) se somente a afirmativa III estiver correta.
d) se somente as afirmativas I e II estiverem corretas.
e) se todas as afirmativas estiverem corretas.
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A PCR é capaz de detectar genomas de vírus que possuem moléculas de RNA, utilizando uma 
transcriptase reversa para construir cDNA. A técnica de qPCR em tempo real é uma técnica 
quantitativa e qualitativa.
Letra b.
015. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/OPERAÇÃO DE LABORATÓRIO DE NÍVEL 
DE SEGURANÇA/FIOCRUZ/2010) O estabelecimento de uma reação de PCR para o diagnós-
tico molecular de agentes infecciosos a partir de amostras biológicas muitas vezes apresenta 
como maior dificuldade a amplificação específica do fragmento genômico do patógeno de 
interesse. As afirmativas a seguir enumeram possibilidades para aumentar a especificidade 
da reação.
I – Aumento da concentração de deoxinucleotídeo na reação de PCR.
II – Aumento da concentração da DNA polimerase na reação de PCR.
III – Realização de reações de PCR aninhadas (PCR-nested), utilizando par de iniciadores mais 
externos à região de interesse na primeira reação, seguido da utilização de par de iniciadores 
mais internos.
Assinale:
a) se somente a afirmativa I estiver correta.
b) se somente a afirmativa II estiver correta.
c) se somente a afirmativa III estiver correta.
d) se somente as afirmativas I e II estiverem corretas.
e) se todas as afirmativas estiverem corretas.
As alternativas I e I levariam ao aumento apenas da eficiência, no entanto na Nested PCR a 
especificidade e a eficiência da reação são aumentadas, pois o segmento genômico é amplifi-
cado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo sequênciaslocalizadas fora dela, e 
depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real sequência-alvo.
Letra c.
016. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/OPERAÇÃO DE LABORATÓRIO DE NÍVEL 
DE SEGURANÇA/FIOCRUZ/2010) Os seguintes componentes essenciais são requeridos em 
uma reação de PCR, exceto:
a) Um par de oligonucleotídeos.
b) DNA polimerase termoestável.
c) DNA molde e cátion divalente.
d) Tampão para manter o pH e cátions monovalentes.
e) Dideoxinucleotídeostrifosfatados.
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Os tampões (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40) servem para inibir a formação de dímeros 
das cadeias enzimáticas.
Letra d.
017. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/OPERAÇÃO DE LABORATÓRIO DE NÍVEL 
DE SEGURANÇA/FIOCRUZ/2010) Sobre as boas práticas laboratoriais relacionadas à rotina 
de diagnóstico molecular por PCR, analise as afirmativas a seguir.
I – A única área que deve ser separada fisicamente das demais, no laboratório que realiza diag-
nóstico molecular por PCR, é a área onde é realizada a extração de ácidos nucleicosa partir das 
amostras clínicas.
II – O fluxo de trabalho, no laboratório que realiza diagnóstico molecular por PCR, deve ser 
sempre a partir da área livre de DNA para a área onde os tubos das reações finais de PCR são 
abertos ou manipulados (área que contém amplicons).
III – Para a pipetagem das misturas de PCR, diluição de oligonucleotídeos etc. não é necessá-
ria a utilização de ponteiras com barreira.
Assinale:
a) se somente a afirmativa I estiver correta.
b) se somente a afirmativa II estiver correta.
c) se somente a afirmativa III estiver correta.
d) se somente as afirmativas I e II estiverem corretas.
e) se todas as afirmativas estiverem corretas.
As áreas de extração e amplificação do DNA devem ser separadas fisicamente das demais. O 
fluxo de trabalho do laboratório deve ser da área livre (não contaminada) para a área de mani-
pulação (com amplicons). Para a pipetagem na PCR deve-se utilizar sempre ponteiras estéreis 
com filtro e livres de DNAses.
Letra b.
018. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Logo após a amplificação do material genético por PCR, o sequen-
ciamento de um isolado viral extraído de plasma, a partir de um paciente com suspeita de 
infecção por HIV-1, pode servir para:
a) medir a carga viral no plasma do paciente.
b) detectar a quantidade de provírus nos macrófagos do paciente.
c) confirmar que o diagnóstico por PCR não é um falsopositivo.
d) detectar a presença de anticorpos neutralizantes contra HIV-1.
e) confirmar a presença de glicoproteínas do envelope viral.
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O teste de detecção pró-viral do HIV é feito por PCR em tempo real.
Letra b.
019. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) A técnica de RT-PCR utiliza como enzima de reação:
a) uma RNA polimerase II humana.
b) uma DNA polimerase I de E. coli.
c) uma RNA polimerase III de levedura.
d) uma protease viral.
e) uma transcriptase reversa viral.
A enzima utilizada na reação de RT-PCR é uma transcriptase reversa viral que codifica um 
cDNA a partir de uma molécula de RNA.
Letra e.
020. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Northern blot é uma técnica molecular capaz de detectar:
a) DNA.
b) RNA.
c) proteínas.
d) anticorpos.
e) células.
Na técnica de Northern blotting, o DNA complementar é usado para sondar RNA. O RNA men-
sageiro é primeiramente separado de acordo com o seu tamanho por eletroforese e, em se-
guida, transferido para o papel antes que as sondas genéticas sejam usadas para localizar a 
mensagem de interesse.
Letra b.
021. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) A técnica de Southern blot permite a detecção de:
a) RNA mensageiro viral específico presente no citoplasma da célula hospedeira.
b) DNA genômico viral integrado à célula hospedeira.
c) RNA genômico viral em partículas livres.
d) glicoproteínas de envelope em partículas virais livres.
e) anticorpos antivirais específicos no soro do paciente.
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Southern blotting é uma técnica de hibridização de DNA que é frequentemente usada para 
identificar, por exemplo, a localização de um único gene no DNA cromossômico.
Letra b.
022. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Dentre as técnicas moleculares para diagnóstico viral, as listadas a 
seguir fazem uso de gel de agarose ou poliacrilamida para revelar a presença de material ge-
nético, exceto:
a) PCR.
b) RFLP.
c) PCR em tempo real.
d) Northern blot.
e) Southern blot.
A PCR em tempo real tem o resultado visualizado imediatamente, dispensando a eletroforese. 
Isto é possível pela adição de sondas fluorescentes às reações de PCR. A amplificação do DNA 
alvo é monitorada durante o processo de qPCR.
Letra c.
023. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Para a realização da técnica de PCR não é necessário:
a) enzima DNA polimerase.
b) iniciadores.
c) os quatro nucleosídeos trifosfatados.
d) magnésio.
e) anticorpos fusionados com peroxidase.
Na reação de PCR não se utilizam anticorpos conjugados com peroxidase.
Letra e.
024. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) O grupo de vírus que devem passar obrigatoriamente pela técnica 
de RT-PCR para terem seu material genético detectados, na forma de partículas virais livres, é 
composto pelos vírus:
a) HIV, HCV e influenza.
b) HIV, herpes e HBV.
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c) HBV, HCV e herpes.
d) HIV, influenza e HBV.
e) influenza, herpes e HCV.
Os vírus HIV, HCV e influenza possuem RNA como material genético e, por isso, devem ser 
detectados por RT-PCR. Herpes vírus e HBV possuem DNA fita dupla como material genético.
Letra a.
025. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Dentre as vantagens do uso da técnica de PCR para diagnóstico viral 
não se inclui:
a) detecção de vírus que não podem ser cultivados in vitro.
b) detecção de vírus que crescem lentamente em cultura.
c) detecção de antígenos virais expostos pelo sistema MHC na superfície celular de macrófagos.
d) uso de pequena quantidade de material biológico humano, como sangue ou fluido ocular,para detecção de ácido nucléico viral.
e) permite a detecção de vírus para o qual a detecção de antígenos não é possível.
A PCR não serve para detecção antigênica, mas, sim, do material genético DNA ou RNA, predi-
tivos da presença dos mais variados tipos de células e microrganismos.
Letra c.
026. (FGV/TECNOLOGISTA EM SAÚDE PÚBLICA/VIROLOGIA APLICADA A IMUNOBIOLÓ-
GICOS/FIOCRUZ/2010) Sobre o uso da técnica de PCR na clínica para diagnosticar infecções 
virais, analise as afirmativas a seguir.
I – A técnica tem a vantagem de fornecer um diagnóstico viral específico.
II – O risco de falsos positivos é inexistente.
III – A técnica é restrita ao diagnóstico de poucos vírus.
IV – O PCR apresenta risco inexistente de contaminação de material genético.
Assinale:
a) se apenas a afirmativa I estiver correta.
b) se apenas as afirmativas I e IV estiverem corretas.
c) se apenas as afirmativas II e III estiverem corretas.
d) se apenas as afirmativas I, II e IV estiverem corretas.
e) se todas as afirmativas estiverem corretas.
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Existe o risco de contaminação das amostras, o que pode levar a resultados falso-positivos 
ou falso-negativos. A técnica pode detectar qualquer vírus desde que existam as condições 
experimentais favoráveis.
Letra a.
027. (PR-4 UFRJ/BIOMÉDICO/UFRJ/2012) Para uma reação de PCR ocorrer corretamente, 
são necessários os seguintes componentes:
a) uma polimerase de DNA termolábil, desoxirribonucleotídeostrifosfatados, um par de inicia-
dores e um molde de ácido nucleico.
b) uma polimerase de DNA termoestável, desoxirribonucleosídeos, um par de iniciadores e um 
molde de DNA.
c) uma polimerase de DNA termoestável, desoxirribonucleotídeostrifosfatados, dois pares de 
iniciadores e um molde de ácido nucleico.
d) uma polimerase de DNA termolábil, desoxirribo-nucleotídeos trifosfatados, um iniciador e 
um molde de RNA.
e) uma polimerase de DNA termoestável, desoxirribonucleotídeostrifosfatados, um par de ini-
ciadores e um molde de DNA.
A DNA polimerase deve ser termoestável para resistir aos ciclos de aumento e diminuição de 
temperatura durante a reação. São também necessários os dNTPs (desoxirribunucleotídeostri-
fosfatados), que são a matéria-prima da reação, um par de primers e apenas um molde de DNA.
Letra e.
028. (PR-4 UFRJ/BIOMÉDICO/UFRJ/2012) As enzimas de restrição são ferramentas bási-
cas muito utilizadas na Engenharia Genética, desempenhando funções específicas na molé-
cula de DNA.
A esse respeito, avalie o que se afirma sobre as enzimas de restrição.
I – Têm a capacidade de clivar tanto DNA como RNA.
II – São capazes de inibir a síntese de RNA a partir do DNA.
III – Podem ser utilizadas para cortar várias sequências diferentes de DNA.
IV – São capazes de reconhecer sequências de bases específicas em moléculas de DNA, cor-
tando-as nesses pontos específicos.
Está correto apenas o que se afirma em Alternativas
a) IV.
b) II e III.
c) I, III, IV.
d) I, II e IV.
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As enzimas de restrição são capazes de clivar apenas a molécula de DNA. Elas cortam a cadeia 
de DNA em sítios específicos de restrição. A enzima de restrição impede a replicação do DNA.
Letra a.
029. (FGV/ANALISTA DE PATOLOGIA CLÍNICA/FUNSAÚDE-CE/2021) Em relação à reação 
de PCR, analise as afirmativas a seguir e assinale (V) par a verdadeira e (F) para a falsa.
(  )	� As etapas fundamentais de uma reação de PCR são a desnaturação térmica do DNA 
molde, o anelamento do oligonucleotídeo iniciador às fitas moldes e a extensão ou po-
limerização das novas fitas de DNA que utilizam os dNTPs como substrato da reação 
de polimerização.
(  )	� O magnésio é um cofator da enzima DNA polimerase, sendo sua concentração funda-
mental para a correta realização da reação de PCR. O ajuste incorreto da quantidade 
deste íon pode gerar artefatos na reação, uma vez que concentrações baixas de Mg 
podem impedir a desnaturação completa do molde de DNA, além de diminuir a especi-
ficidade da reação; já concentrações altas de Mg não permitem a realização da reação.
(  )	� A concentração de dNTPs (dATP, dCTP, dGDP e dTTP) deve ser calculada de modo que 
dCTP e dGDP tenham o dobro da concentração dos demais desoxirribonucleotídeos.
As afirmativas são, na ordem apresentada, respectivamente:
a) F – V – F.
b) F – V – V.
c) V – F – F.
d) V – V – F.
e) F – F – V.
Na reação de PCR utiliza-se todos os dNTPs (ATP, TTP, CTP e GTP) em concentrações iguais 
(salvo em alguns casos específicos).
Letra d.
030. (UFMG/TÉCNICO/BIOLOGIA/LABORATÓRIO/UFMG/2016) Em relação às ferramentas 
da tecnologia do DNA e seus usos, todas as associações abaixo estão corretas, EXCETO:
a) DNA Ligase – RFLPs.
b) Trasncriptase reversa – produção de cDNA a partir de mRNA.
c) Plamídeos–clonagem de DNA recombinante.
d) Taq DNA Polimerase – PCR.
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Na técnica de RFLP é realizada a análise dos polimorfismos de fragmentos de restrição, por-
tanto não é necessário utilizar a DNA ligase.
Letra a.
031. (UFMG/TÉCNICO/BIOLOGIA/LABORATÓRIO/UFMG/2016) O método de Southern blot-
ting foi assim batizado devido ao nome de seu inventor, o biólogo britânico Edwin Southern.
Em relação a esse método, é correto afirmar, EXCETO:
a) fragmentos de DNA radioativos são utilizados como sondas para a detecção das sequ-
ências alvo.
b) fragmentos de DNA obtidos pela digestão com enzimas de restrição são separados em gel 
de eletroforese de acordo com o tamanho.
c) enzimas de restrição são utilizadas para digerir longas moléculas DNA de fitas simples em 
fragmentos menores.
d) os fragmentos de DNA presentes no gel são desnaturados, transferidos para uma membra-
na de nitrocelulose (blotting) e hibridizados com uma sonda.
As enzimas de restrição são utilizadas para digerir DNA de fita dupla.
Letra c.
032. (UNOESC/FARMACÊUTICO/PREFEITURA DE TREZE TÍLIAS-SC/2020) A reação da ca-
deia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular que permite o desenvolvimento 
do estudo de sequências de ácidos nucleicos, em que três fases são necessárias e são repeti-
das inúmeras vezes. Assinale a alternativa que corresponde à terceira fase dessa metodologia 
molecular.
a) A extensão, ou polimerização, envolve a ativação do Taq Polimerase seguida da síntese de 
novas cadeias.
b) A desnaturalização, na qual ocorre o aumento da temperatura com a finalidade de romper as 
pontes de hidrogênio e, assim, permitir a abertura da dupla fita.
c) O posicionamento, no qual são determinadas frações que são quantificadas por densitome-
tria ou eluição, em que é gerado um gráfico de forma que as bandas podem ser comparadas, 
possibilitando qualquer sinal de desequilíbrio
d) O anelamento, que realiza a ligação dos primes na região particular que se quer amplificar e 
é definido pela redução da temperatura.
A terceiraetapa da PCR é o alongamento, extensão ou polimerização, na qual a DNA polimera-
se sintetiza novas fitas de DNA de forma exponencial, a partir de uma fita molde.
Letra a.
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033. (IBADE/TÉCNICO EM LABORATÓRIO/PREFEITURA DE MINISTRO ANDERAZZA-
-RO/2020) A reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) possui 
grande aplicabilidade em exames laboratoriais. Sobre essa técnica, pode-se afirmar que estão 
corretas as seguintes afirmativas, EXCETO:
a) Apresenta a vantagem de permitir identificar patógenos, sem a necessidade de realização 
de seu isolamento e cultura de crescimento.
b) Está baseada na multiplicação, e posterior identificação, de sequências de nucleotídeos ou 
de aminoácidos característicos de um organismo.
c) Amplifica quantidades diminutas de material da amostra, exigindo execução cuidadosa para 
evitar comprometimento do diagnóstico devido à contaminação.
d) A modalidade RT-PCR exige que, inicialmente, uma amostra de RNA sofra a ação de uma 
transcriptase reversa para originar o cDNA que será amplificado.
e) Cada ciclo de amplificação da amostra, realizado em termociclador, possui três etapas: des-
naturação, anelamento e extensão (ou polimerização).
A PCR não permite a identificação de sequências nucleotídicas e de aminoácidos.
Letra b.
034. (VUNESP/TÉCNICO EM ANÁLISES CLÍNICAS/EBSERH/2020) Qual é o método ampla-
mente utilizado como teste confirmatório dos resultados positivos e indeterminados obtidos 
em testes imunoenzimáticos para a síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA ou AIDS)?
a) Imunofluorescência direta.
b) Radioimunoensaio.
c) Aglutinação direta.
d) Western-blot.
e) Fixação do complemento
A técnica de Western blot é utilizada para diferenciar HIV-1 e HIV-2 de HIV, além de ser um teste 
confirmatório para amostras reagentes em teste de triagem.
Letra d.
035. (UFMT/PROFISSIONAL DE NÍVEL SUPERIOR COMPLETO DO SUS/BIÓLOBO/PREFEI-
TURA DE VÁRZEA GRANDE-MT/2018) A PCR em Tempo Real também denominada qPCR, 
foi descrita pela primeira vez em 1993 por Higuchi e seus colaboradores. Sobre esse tema, 
marque V para as afirmativas verdadeiras e F para as falsas.
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(  )	� Ela é uma variante da reação de PCR convencional, pois a amplificação e a detecção 
ocorrem simultaneamente, com possibilidade de gerar resultados quantitativos com 
maior precisão.
(  )	� A quantificação na PCR em Tempo Real é mensurada pela quantidade de produto am-
plificado durante cada ciclo (através da fluorescência emitida). Essa metodologia utiliza 
um equipamento com sistema de monitoramento da emissão de fluorescência.
(  )	� Na PCR convencional, é necessária a preparação de gel de agarose para visualização; 
na PCR em tempo real não ocorre manipulação pós- PCR.
Assinale a sequência correta.
a) V, F, F.
b) F, V, F.
c) F, F, V.
d) V, V, V.
Todas as afirmativas estão corretas.
Letra d.
036. (FCC/TÉCNICO EM PATOLOGIA CLÍNICA/PREFEITURA DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO-
-SP/2019) A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem como base a:
a) amplificação de moléculas de DNA.
b) amplificação de moléculas de RNA.
c) identificação de proteínas.
d) degradação do DNA.
e) termorreação para hidratação do DNA.
A reação em cadeia da polimerase consiste na replicação de sequências específicas de DNA 
utilizando equipamentos termocicladores. Para realizar a reação acrescentam-se às amostras 
de material genético sequências iniciadoras complementares (também conhecidas como pri-
mers), desoxirribonucleotídeos e DNA-polimerase termo resistente.
Letra a.
037. (CESGRANRIO/TÉCNICO DE LABORATÓRIO/ANÁLISES CLÍNICAS/UNIRIO/2019) 
Para o diagnóstico molecular de doenças virais, depara-se tanto com vírus cujo material gené-
tico é constituído de DNA, quanto com vírus constituído de RNA.
Para o diagnóstico de viroses causadas por vírus do tipo RNA, que tipo de método molecular 
deve ser utilizado?
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a) RT-PCR.
b) IFI.
c) PCR.
d) Nested PCR.
e) Hibrização in situ.
A RT-PCR utiliza uma transcriptase reversa que converte a molécula de RNA em cDNA para ser 
utilizada na reação.
Letra a.
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Farmacêutica, Especialista em Farmacologia, Professora Universitária e Analista da Fundação Hemocentro 
de Brasília.
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