Lista ciclo do ácido cítrico

Prévia do material em texto

Exercícios sobre Ciclo do Ácido Cítrico - Letícia F Nanami 
 
1. Indicar a localização celular do ciclo do ácido cítrico. 
O ciclo do ácido cítrico ocorre na matriz mitocondrial, a enzima succinato 
desidrogenase está fixada na membrana interna da mitocôndria. 
 
2. Quais as funções desta via? 
O objetivo do ciclo é oxidar o Acetil CoA advindo dos combustíveis gerando 
ATP (energia) e também produzir intermediários/precursores para a 
biossíntese de outras moléculas (aminoácidos, porfirinas, glicose). 
 
3. O ciclo do ácido cítrico possui 8 enzimas. Sobre as reações catalisadas por 
elas, responda: 
 
a. Escreva uma equação equilibrada para a reação catalisada por cada 
enzima. 
1- Acetil coA + oxalacetato → citrato + coASH, enzima citrato sintase 
(condensação); 
2a- Citrato → cis-Aconitato, enzima aconitase (desidratação); 
2b- cis-Aconitato → Isocitrato, eznima aconitase (reidratação); 
3- Isocitrato → alfa-cetoglutarato, enzima isocitrato desidrogenase 
(descarboxilação oxidativa); 
4- alfa-cetoglutarato → Succinil coA + CO2, enzima complexo 
alfa-cetoglutarato desidrogenase (descarboxilação oxidativa); 
5- Succinil coA → Succinato, enzima succinil coA sintetase (fosforilação ao 
nível do substrato); 
6- Succinato → ​Fumarato, enzima succinato desidrogenase 
(desidrogenação); 
7- Fumarato → L-malato, enzima fumarase (hidratação) 
8- Malato → Oxaloacetato, enzima L-malato desidrogenase 
(desidrogenação). 
 
b. Nomeie o(s) cofator(es) necessário(s) para cada reação enzimática 
(quando houver). 
1- TPP 
2- Ácido lipóico 
3- coASH 
4- FAD 
5- NAD+ 
 
4. Indicar o composto rico em energia intermediário do ciclo de Krebs e a reação 
que o produz. 
O Succinil coA é o composto, este é produzido na 4º reação catalisada pela 
alfa-cetoglutarato desidrogenase, a partir de alfa-cetoglutarato em uma 
descarboxilação oxidativa. 
 
5. Citar os compostos que devem ser fornecidos ao ciclo de Krebs para: 
a. Iniciá-lo (repor o oxalacetato usado na primeira reação) 
O Acetil coA pode ser reposto por reações anapleróticas e o oxalacetato 
pode advir de malato. 
b. Mantê-lo em funcionamento. 
Para manter o funcionamento do próprio ciclo, são necessárias o Acetil 
coA, as coenzimas oxidadas (NAD+, FAD) e a coASH. 
 
6. Descreva a função de cada cofator envolvido na reação catalisada pelo 
complexo da piruvato desidrogenase. 
1º TPP (tiamina pirofosfato atua na estabilização de carbânions gerados na 
etapa de descarboxilação do piruvato. 
2º Ácido lipóico ( atua na oxidação do grupo hidroxietil, e na transferência do 
grupo acetil para a coenzima A) 
3º coASH (atua na ligação e no transporte do grupo acetil) 
4º FAD (trabalha na regeneração do ácido lipóico oxidado) 
5º NAD+ (age na oxidação do FADH2 em diidrolipoil desidrogenase) 
 
7. Duas das etapas da descarboxilação oxidativa do piruvato (etapas 4 e 5) não 
envolvem nenhum dos três carbonos do piruvato, ainda que elas sejam 
essenciais para o funcionamento do complexo da PDH. Explique. 
Essas reações não envolvem nenhum dos 3 carbonos do piruvato, mas são 
importantes pois são essas que possibilitam regenerar a forma oxidada do 
lipoato e na manutenção do ácido lipóico. 
 
8. Quais as vitaminas participam do ciclo de Krebs? 
A TPP é derivada da vitamina B1; A Niacina que faz parte da estrutura do NAD, 
é advinda da vitamina B3; Riboflavina forma o anel de flavina que compõe o 
FAD, presente na vitamina B2; o ácido pantotênico presente na vitamina B5, 
forma a estrutura da coenzima A. 
 
9. Indivíduos com uma dieta deficitária de tiamina possuem níveis relativamente 
altos de piruvato na corrente sanguínea. Explique este fenômeno em termos 
bioquímicos. 
A deficiência em tiamina, afeta a reação de descarboxilação do piruvato, 
consequente a enzima piruvato desidrogenase, fazendo com que a reação seja 
inibida, e aconteça o acúmulo de piruvato. 
 
10. Suponha que você tenha preparado um extrato mitocondrial que contém todas 
as enzimas solúveis da matriz, mas que perdeu (por diálise) todos os cofatores 
de baixa massa molecular. O que você deve adicionar ao extrato para que a 
preparação oxide acetil-CoA a CO​2​? 
Para que a preparação oxide o Acetil coA à CO2, devemos adicionar 
substratos (molécula de acetil coA, piruvato), oxalacetato ou uma molécula 
precursora de oxalacetato (malato) e os cofatores solúveis (NAD+, coASH, 
GDP, Pi e TPP) 
 
11. Como uma deficiência de riboflavina afetaria o funcionamento do ciclo do ácido 
cítrico? Explique sua resposta. 
A riboflavina é uma vitamina usada para síntese do FAD, e sua deficiência 
afetaria a oxidação do succinato em fumarato, catalisada pela succinato 
desidrogenase. 
 
 
12. Que fatores poderiam diminuir a quantidade de oxalacetato disponível para a 
atividade do ciclo do ácido cítrico? Como o oxalacetato pode ser reposto? 
 
O oxalacetato poderia ser diminuído pela remoção de intermediários com 4 ou 
5 carbonos, visto que como não há uma produção líquida deste, ele precisa ser 
regenerado. Para a sua reposição as reações anapleróticas, dariam conta. 
 
 
13. A respiração celular pode ser estudada em mitocôndrias isoladas pela medida 
do consumo de oxigênio sob diferentes condições. Se 0,01M de malonato de 
sódio é adicionado a mitocôndrias respirando ativamente e utilizando piruvato 
como fonte de combustível, a respiração rapidamente para e um intermediário 
metabólico se acumula. 
a. Qual é a estrutura deste intermediário? 
O intermediário que se acumula é o Succinato 
 
b. Explique por que ele se acumula. 
Ele se acumula porque é um inibidor competitivo da succinato 
desidrogenase. 
 
c. Explique por que o consumo de oxigênio para. 
A succinato desidrogenase age também no complexo II da cadeia 
transportadora de elétrons, assim se ela é inibida o transporte de elétrons 
na cadeia para o O2 é inibida, diminuindo então a respiração celular. 
 
d. Além da remoção do malonato, como esta inibição da respiração pode ser 
superada? Explique. 
Ela pode ser superada aumentando a concentração de Succinato, pois 
quanto mais substrato tem, a inibição é superada. 
 
14. As vias metabólicas dos compostos orgânicos têm sido frequentemente 
delineadas pelo uso de um substrato marcado radioativamente com o 
subsequente acompanhamento do destino deste marcador. 
a. Como você poderia determinar se a glicose adicionada a uma suspensão 
de mitocôndrias isoladas é metabolizada a CO​2​ e H​2​O? 
Nos dias de hoje, para determinar isso, utilizam de radioisótopos como o 
C14 e o H3 (trício) para marcar os carbonos e hidrogênios das moléculas 
de glicose, para no final o C ou H que foi demarcado ser quantificado no 
CO2 e água, resultante. 
 
b. Suponha que você adicione um breve pulso de [3-​14​C]piruvato (marcado na 
posição metil) às mitocôndrias. Após uma rodada do ciclo do ácido cítrico, 
qual é a posição do ​14​C no oxalacetato? Explique seguindo o marcado ​14​C 
ao longo da via. Quantas rodadas do ciclo são necessárias para que todo o 
[3-​14​C]piruvato seja liberado na forma de CO​2​? 
A descarboxilação oxidativa do piruvato, oxida o C1 (COO-) e o acetil coA 
resultante será marcado no C14 do metil, e ao final do primeiro ciclo, 
continua na porção do oxalacetato, na 2º volta o C14 estará marcado no C3 
do oxalacetato, e na volta 3 no C4 e por fim, na volta 4 o carbono que 
estava marcadocom o radioisótopo será descarboxilado, e o CO2 liberado. 
 
15. Na primeira etapa da gliconeogênese, a conversão de piruvato a 
fosfoenolpiruvato (PEP), o piruvato é carboxilado pela piruvato carboxilase a 
oxalacetato, que é subsequentemente descarboxilado a PEP pela 
PEP-carboxiquinase. Como a adição de CO​2 é seguida de descarboxilação, 
você poderia esperar que, em experimentos com marcadores, o ​14​C do ​14​CO​2 
não fosse incorporado ao PEP, glicose, ou qualquer outro intermediário da 
gliconeogênese. Entretanto, pesquisadores observaram que, quando uma 
preparação de fígado de rato sintetiza glicose na presença de ​14​CO​2​, o ​
14​C 
lentamente aparece no PEP e, no devido tempo, aparece no C-3 e no C-4 da 
glicose. Como o marcador ​14​C é incorporado ao PEP e à glicose? 
 
A resposta se dá devido ao fato de que o oxalacetato também é um 
intermediário do ciclo do ácido cítrico tanto quanto da gliconeogênese, dessa 
forma na via do ácido, ao invés dele sofrer descarboxilação, ele será convertido 
em succinato, e como o succinato é uma molécula simétrica, pode-se ter 2 
porções marcadas, uma no C4 e outra no C1, assim os que têm marcação no 
C1 gerariam o PEP marcado, que poderia formar a glicose com o C3 ou C4 
marcado. 
 
16. O fígado de mamíferos pode efetuar gliconeogênese utilizando oxalacetato 
como material de partida. A operação do ciclo do ácido cítrico seria afetada 
pela intensa utilização de oxalacetato para a gliconeogênese? Explique sua 
resposta. 
Sim, seria, por exemplo se tivesse 10 moléculas de oxalacetato, todas seriam 
oxidadas ao mesmo tempo, logo a velocidade da via seria muito mais rápida, 
da mesma maneira se daria pelo contrário, se houvesse poucas moléculas de 
oxalacetato, diminuiria a velocidade de oxidação do acetil coA, e a operação do 
ácido cítrico seria afetada. 
 
17. Nos tecido animais, a taxa de conversão de piruvato a acetil-CoA é regulada 
pela razão entre o complexo da PDH ativo desfosforilado, e inativo e 
fosforilado. Determine o que acontece com a velocidade desta reação quando 
uma preparação mitocondrial de músculo contendo o complexo da PDH é 
tratada com: a) piruvato-desidrogenase quinase, NADH e ATP; b) 
piruvato-desidrogenase fosfatase e Ca​+2​; c) malonato. 
 
a​. Quando é tratada por piruvato, NADH e ATP, indicam alta taxa energética, 
na presença de NADH e ATP, a piruvato desidrogenase quinase está mais 
ativa e fosforila o complexo da piruvato desidrogenase, inativando-a. 
b. Na ocasião em que o cálcio age como um modulador alostérico positivo da 
forma fosforilada da piruvato desidrogenase, dessa forma, então o complexo 
piruvato desidrogenase estaria ativo. 
c. O malonato é inibidor alostérico da succinato desidrogenase, assim 
acumularia succinato, inibindo a via, e levando ao acúmulo também de acetil 
coA (modulador alostérico negativo da piruvato desidrogenase) e inibe a 
regulação. 
 
18. O ácido cítrico é utilizado como agente flavorizante em refrigerantes, sucos de 
frutas e muitos outros alimentos. Ao redor do mundo, o mercado do ácido 
cítrico está estimado em centenas de milhões de dólares por ano. A produção 
comercial utiliza o fungo ​Aspergillus niger​, que metaboliza sacarose sob 
condições cuidadosamente controladas. Responda: 
 
 
a. O rendimento de ácido cítrico depende muito da concentração de FeCl​3 no 
meio de cultura, como indicado no gráfico. Por que o rendimento decresce 
quando a concentração de Fe​+3 está acima ou abaixo do valor ótimo de 
0,5mg/L? 
A aconitase apresenta centro Fe-S, então ela depende de íon Fe3+. A 
produção de citrato depende do seu acúmulo e o não consumo do mesmo 
por outras enzimas da via, então quanto mais Fe, maior será a atividade da 
aconitase, consumindo o citrato. E se o nível de Fe for bem baixo, a 
aconitase trabalha menos e assim, o citrato pode não ser degradado. 
 
 
 
b. Escreva a sequências de reações pelas quais ​A. niger sintetiza ácido cítrico 
a partir de sacarose. 
Sacarose + H2O → Glicose + Frutose (glicólise- citosol) 
Glicose + 2Pi + 2ADP → Piruvato + 2ATP + 2NADH (complexo da piruvato 
quinase) 
2 Piruvato + 2NAD+ + coASH → 2Acetil coA + 2NADH + 2 CO2 (complexo 
da piruvato desidrogenase) 
2 Piruvato + 2 CO2 + 2ATP + 2H2O → Oxalacetato + 2ADP + 2Pi + 4H+ 
(piruvato carboxilase) 
2 Acetil coA + 2 oxalacetato + 2H2O → 2 citrato + 2 coA (citrato sintase) 
 
 
c. O processo comercial requer que o meio de cultura seja aerado – isto é, o 
processo é uma fermentação ou um processo aeróbico? Explique. 
 
O processo é aeróbico, pois o meio consome NADH e produz NAD+, então 
é preciso reoxidação de NADH em NAD+ e na ausência de O2, a reação da 
piruvato desidrogenase e o ciclo do ácido ficam inibidos, aumentando a 
razão NADH/NAD+. 
 
19. Como você espera que a operação do ciclo do ácido cítrico responda a um 
rápido aumento da razão NADH/NAD​+​ na matriz mitocondrial? Explique. 
A redução da atividade da citrato sintase que é alostericamente regulada pela 
NADH, e uma diminuição da atividade das desidrogenases, consequentemente 
uma redução na velocidade do ciclo. 
 
20. A piruvato carboxilase é uma enzima regulatória que é ativada pelo efetor 
alostérico Acetil-CoA. Explique por que este controle é vantajoso para o 
organismo. 
A velocidade da oxidação do Acetil coA depende da quantidade de moléculas 
de oxalacetato disponível, quanto mais oxalacetato, maior é a capacidade 
oxidativa do ciclo, ou seja, maior a velocidade. Sempre que existe excesso de 
acetil coA, a piruvato carboxilase é regulada de maneira positiva, produzindo 
mais oxalacetato, fazendo com que aumente a capacidade de oxidação do 
acetil coA no ciclo do ácido cítrico.