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Prof. Dr. Flávio Buratti UNIDADE I Microbiologia e Micologia Clínica Conceitos: Infecção hospitalar: Qualquer infecção adquirida após a internação do paciente, que se manifeste durante a internação ou, mesmo, após a alta, quando puder ser relacionada com a internação ou os procedimentos hospitalares; Toda manifestação clínica de infecção que se apresentar a partir de 72 (setenta e duas) horas após a admissão; MS – Portaria n. 2616/1998. CCIH e infecção hospitalar Infecção hospitalar: É a mais frequente e grave complicação que acontece em pacientes hospitalizados; Uma infecção hospitalar (IH) acrescenta, em média, 5 a 10 dias ao período de internação; Eleva os custos; Importante causa de morte durante a hospitalização; 1,7 milhão de IH/anos nos EUA; 4,5 IH para cada 100 altas; 99.000 mortes/ano; Custo anual de US$ 5-10 bilhões. CCIH e infecção hospitalar CCIH e infecção hospitalar Existe taxa de infecção ZERO? Não existe taxa de infecção ZERO. Existem infecções que não podem ser evitadas porque dependem do estado de saúde do paciente. Existem infecções que podem ser evitadas por medidas de prevenção e controle, e do trabalho da CCIH. CCIH e infecção hospitalar Um breve histórico no mundo Inserção dos médicos, segregação de doentes por patologia – primeiras medidas básicas para a prevenção da IH330 a.C. Construção do primeiro hospital urbano – possuía caráter social, não curativa. Para os doentes pobres, peregrinos e inválidos Século XIX Ações de prevenção de IH lgnaz Semmelweis e Florence Nightingale Final do século XVIII Mudança do paradigma caritativo-assistencial para curativo A IH surge devido à precária condição de assistência Fonte: acervo pessoal. CCIH e infecção hospitalar Um breve histórico no Brasil 1998 Substituição da Portaria MS 930/1992 pela 2616/1998 – obriga a implantação do SCIH e estabelece as normas para a prevenção e o controle de IH 1997 Lei n. 9431 – obriga a manutenção do PCIH 1985 Morte do presidente Tancredo Neves – sepse secundária infecção pós-cirúrgica (diverticulite) Criação de associações de profissionais (ABIH, APECIH, AMECIH) 1983 Divulgação de IH pela imprensa Publicação da Portaria MS 196 – recomenda a criação de CCIH 1992 Substituição da Portaria MS 196/1983 pela 930 – obriga a implantação do PCIH Fonte: acervo pessoal. Automação no Laboratório de Microbiologia Aparelho Meios de cultura O BD BACTEC é um sistema automatizado desenvolvido para detectar o crescimento de microrganismos em amostras de sangue. O aparelho não é invasivo e monitora, agita e incuba os frascos, simultânea e continuamente; A metodologia é baseada na detecção da fluorescência emitida por um sensor nos frascos com os meios de cultura. O sistema é de ultrassensibilidade e monitora, em intervalos de 10 minutos, as amostras de hemocultura, acelerando o tempo de detecção e fornecendo os alarmes tanto visuais quanto sonoros, no caso de amostras positivas. Hemocultura: Fonte: https://www.bd.com/pt-br Automação no Laboratório de Microbiologia Crescimento de micobactérias: O sistema BD BACTEC MGIT é um método automatizado para o isolamento primário de micobactérias a partir de amostras clínicas pulmonares e extrapulmonares (exceto sangue), e teste de sensibilidade a antibióticos para Mycobacterium tuberculosis; Os tubos de cultura contêm um composto fluorescente, embebido em silicone, que é sensível à presença do oxigênio dissolvido no meio. Inicialmente, grande quantidade do oxigênio dissolvido extingue as emissões do composto e pouca fluorescência pode ser detectada. Posteriormente, microrganismos respirando ativamente no meio consomem o oxigênio, o que ocasiona a emissão da fluorescência e a sua detecção pelo equipamento. Fonte: https://www.bd.com/pt-br Automação no Laboratório de Microbiologia O equipamento WalkAway é completo e flexível, totalmente automatizado para a microbiologia clínica: Incuba, automaticamente, a suspensão bacteriana pelo tempo apropriado, adiciona reagentes e executa a leitura dos painéis; Especifica com segurança e a suscetibilidade antimicrobiana, com a concentração Inibitória Mínima ou Breakpoint com uma ampla variedade de antibióticos; Dupla metodologia: Colorimétrica e Fluorogênica; Tem capacidade de processar, simultaneamente, 40 painéis (WalkAway® 40) ou 96 painéis (WalkAway® 96). Fonte: https://www.bd.com/pt-br Automação no Laboratório de Microbiologia O AutoScan-4 é um equipamento semiautomatizado para microbiologia clínica: Realiza, automaticamente, a leitura de um painel inoculado com uma suspensão bacteriana padronizada; Utiliza a tecnologia de fibras óticas que permite a leitura espectrofotométrica de todo o painel simultaneamente, garantindo a mais absoluta precisão nos resultados; Resultado em 5 segundos; Identificação e antibiograma com Concentração Inibitória Mínima ou Breakpoint com uma ampla variedade de antibióticos. Fonte: https://www.bd.com/pt-br Sistema Maldi-Tof Automação no Laboratório de Microbiologia Fonte: acervo pessoal. Laser beam to Mass analyzer Desolvation & ionizationDesorption Proton Transfer Analyte spots Matrix spots H+ T a rg e t p la te Bacteria Culture Clinical Specimen MALDI TOF MS Antibiotic Susceptibility Testing Microorganism Identification Sublyping Níveis de Biossegurança: Níveis de biossegurança em laboratório NB 1 NB 2 NB 3 NB 4 Nível adequado à manipulação de agentes biológicos conhecidos por não causarem doenças em adultos sadios. Nível adequado à manipulação de agentes biológicos cujo risco individual é moderado e baixo para a comunidade. Pode provocar infecções, porém se dispõe de medidas terapêuticas e profiláticas eficientes. Risco de propagação limitado. Nível adequado à manipulação de agentes biológicos com potencial para a transmissão por via e para causarem patologias potencialmente letais, para as quais existem, usualmente, medidas de tratamento e/ou de imunização. Nível adequado à manipulação de agentes biológicos exóticos ou perigosos, com alto poder de transmissibilidade por via respiratória, ou transmissão desconhecida e de alta letalidade. Não há medida profilática ou terapêutica eficaz contra infecções ocasionadas por aqueles. Tabela 2: Níveis de Biossegurança. Fonte: Adaptado de: Ministério de Saúde (2006). Qual é o nível de biossegurança em que é adequada a manipulação de agentes biológicos de risco individual moderado e baixo para a comunidade? a) NB1. b) NB2. c) NB3. d) NB4. e) Não existe nível seguro para a manipulação de agentes infecciosos. Interatividade Qual é o nível de biossegurança em que é adequada a manipulação de agentes biológicos de risco individual moderado e baixo para a comunidade? a) NB1. b) NB2. c) NB3. d) NB4. e) Não existe nível seguro para a manipulação de agentes infecciosos. Resposta Os estafilococos são as bactérias inquestionavelmente mais resistentes no meio ambiente. Podem sobreviver por meses em amostras clínicas secas, são relativamente resistentes ao calor e podem tolerar uma concentração aumentada de sal. Indivíduos sadios são colonizados intermitentemente por staphylococcus aureus desde a amamentação e podem albergar o microrganismo na nasofaringe, ocasionalmente, na pele e, raramente, na vagina. Staphylococcus aureus: pode contaminar a pele e as membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pacientes, por contato direto ou por aerossol, ocasionando as infecções letais por conta dos fatores de virulência ou pela resistência aos antimicrobianos, atualmente, utilizados. Staphylococcus spp. Existem cerca de 31 espécies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas e as mais frequentes são: Staphylococcus epidermidis: causadorde infecções de cateteres e próteses, e o mais frequente microrganismo encontrado em hemoculturas. Também associado às bacteremias e endocardites; Staphylococcus saprophyticus: causador de infecção urinária em mulheres jovens; Staphylococcus haemolyticus: importante devido à resistência aumentada aos antimicrobianos e por ser comumente confundido com o S. Aureus, pois apresenta hemólise na placa de ágar sangue de carneiro. Staphylococcus spp. Fonte: acervo pessoal. Bacterioscopia – presuntiva para Staphylococcus spp. Com a alça bacteriológica, retira-se uma colônia suspeita e esfrega em uma lâmina de vidro. Despejar sobre esse esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar a formação de bolhas. Para a família Microccocaceae (estafilococos), a prova é, geralmente, positiva, enquanto que, para a família Streptococcaceae (estreptococos), é negativa. Dessa forma, pode-se utilizar essa prova como um teste diferencial entre as duas famílias de bactérias. Uma observação importante na realização dessa técnica: deve-se tomar o cuidado de não carregar meio de cultura (ágar sangue), o que pode acarretar resultados falso positivos. Prova da catalase – presuntiva para Staphylococcus spp. Fonte: acervo pessoal. Para realizar o teste, é muito simples: deve-se, inicialmente, colocar duas gotas de salina em uma lâmina. Depois, homogeneizar com uma colônia isolada a ser testada, acrescentar uma gota de plasma e misturar. Deve-se observar se há a aglutinação visível num prazo estabelecido. Prova da coagulase – confirmatória para Staphylococcus spp. Fonte: acervo pessoal. Esse teste consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA (DNase test agar) obtido comercialmente. Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentração de 0,1%. Incubar a 35 ºC, por 24 horas, e, depois desse período, verificar se há a presença de uma coloração rósea ao redor das colônias produtoras de DNase, indicando a positividade da prova. Prova de DNase Fonte: acervo pessoal. O Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 7,5% de NaCl, denominado ágar manitol salgado. O indicador de pH é o vermelho de fenol, que indica uma reação positiva, quando o meio ao redor das colônias se torna amarelo, e negativa, quando permanece avermelhado. Prova do manitol Fonte: acervo pessoal. A bactéria é semeada seguindo os cuidados da técnica de disco-difusão de Kirby-Bauer, acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5 μg. As amostras resistentes mostram zonas de inibição de 6 a 12 mm, enquanto as suscetíveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus são resistentes. Prova da novobiocina Fonte: acervo pessoal. Qual o nome do teste utilizado para diferenciar bactérias da família dos Staphylococcus spp. dos Streptococcus spp.? a) Catalase. b) Coagulase. c) DNase. d) Manitol. e) Novobiocina. Interatividade Qual o nome do teste utilizado para diferenciar bactérias da família dos Staphylococcus spp. dos Streptococcus spp.? a) Catalase. b) Coagulase. c) DNase. d) Manitol. e) Novobiocina. Resposta Streptococcus spp. Características gerais: Anaeróbios facultativos, mesófilos, demandam meio rico (ágar chocolate ou sangue); Cocos Gram-positivos em cordões, cadeias ou aos pares; A hemólise em meio de ágar sangue é um fator muito importante para a classificação das bactérias nesse grupo; Sabe-se que bactérias podem produzir diferentes graus de hemólise, a julgar pela concentração de hemolisina que cada uma pode produzir; O diagnóstico presuntivo de infecção por estreptococos se inicia, obviamente, pela microscopia, revelando a presença de bactérias arredondadas, Gram-positivas, dispostas em cadeias curtas ou longas, catalase negativa e observando o padrão de hemólise evidenciado. Fonte: Adaptado de: https://www.ibb.unesp.br/ Streptococcus – classificação de Lancefield. LANCEFIELD, R. C. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J. Exp. Med., 57:571, 1933. Rebecca C. Lancefield (1895-1981). Streptococcus spp. Classificação Sorológica Classificação Bioquímica Padrões Hemolíticos A Streptococcus pyogenes β B Streptococcus agalactiae β, ocasionalmente, α ou y C Streptococcus anginosus Streptococcus equisimilis α ou y D Streptococcus bovis α ou y, ocasionalmente, β F Streptococcus anguinosus β G Streptococcus anguinosus β - Streptococcus pneumoniae α Grupo viridans Streptococcus do grupo mutans Streptococcus do grupo salivarius Streptococcus do grupo sanguis Streptococcus do grupo mitis Streptococcus do grupo milleri α,y Streptococcus – classificação-hemólise. Padrão de hemólise: , e . Streptococcus spp. Fonte: https://bv.fapesp.br/en/instituicao/2046/instituto-paulista-de-doencas-infecciosas-e- parasitarias-idipa/ Fonte: acervo pessoal. Bacterioscopia – presuntiva para Streptococcus spp. Com a alça bacteriológica, retira-se uma colônia suspeita e esfrega em uma lâmina de vidro. Despejar sobre esse esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar a formação de bolhas. Para a família Microccocaceae (estafilococos), a prova é, geralmente, positiva, enquanto que para a família Streptococcaceae (estreptococos) é negativa. Dessa forma, pode-se utilizar essa prova como um teste diferencial entre as duas famílias de bactérias. Uma observação importante na realização dessa técnica: deve-se tomar o cuidado de não carregar meio de cultura (ágar sangue), que pode acarretar resultados falso positivos. Prova da catalase – Streptococcus spp. Fonte: acervo pessoal. Teste da bacitracina: Esse teste é semelhante ao teste da novobiocina em termos de metodologia utilizada, porém deve-se estar bastante atento, pois depende da utilização de meio de ágar sangue, cujos resultados podem gerar conflitos; Para a sua realização, deve-se semear a placa de ágar sangue com o estreptococo a ser identificado, colocar o disco de bacitracina 0,004 u como indicado; incubar por 24 horas a 35 ºC sem CO2 e verificar a presença de qualquer halo ou zona de inibição como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyogenes (grupo A) é, assim, rapidamente identificado. Provas de identificação Fonte: acervo pessoal. Teste do sulfametoxazol trimetoprim (SXT): Adicionar, na mesma placa de ágar sangue, onde foi realizado o teste da bacitracina, o disco de SXT; para tal, pode-se dividir a placa ao meio. Deve-se incubar; por 24 horas; a 35 ºC; sem CO2. A sensibilidade a essa droga significa, em conjunto com as outras leituras, que o estreptococo não pertence ao grupo A, B ou D de Lancefield; Em adição, como dito, pode ser feito na mesma placa o teste de bacitracina 0,004 UI e o de Camp, conforme a seguir. Provas de identificação Fonte: acervo pessoal. Teste da optoquina: Teste semelhante aos demais que utilizam, como princípio, a técnica de disco-difusão. Para tal, deve-se semear um quarto de uma placa de ágar sangue (isso como opção, caso queira utilizar a mesma placa para demais testes) com a cepa alfa-hemolítica a ser testada; Em sequência, deve-se aplicar um disco de optoquina, incubar a 35 ºC em tensão aumentada de CO2, sugere-se uso do sistema de anaerobiose, com gerador apropriado; Após período de incubação, notar se há presença de uma zona de inibição de 14 mm ou indicando a sensibilidade ao teste e identificando, de forma assertiva, uma infecção por Streptococcus pneumoniae. Provas de identificação Fonte: acervo pessoal. Teste de CAMP: Inocular uma estria única de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta-lisina (ATCC25923) no centro de uma placa de ágar sangue preparada, obrigatoriamente, com sangue de carneiro; Na sequência, deve-se inocular as amostras a serem testadas em estrias, formando um ângulo reto com a linha de inoculação da amostra testede estafilococo; As estrias não devem se tocar, ficando entre 1 e, no máximo, 2 mm de distância. Desse modo, várias amostras podem ser testadas em uma mesma placa de ágar sangue. Provas de identificação Teste de CAMP: As placas devem ser incubadas em temperatura entre 35-37 ºC durante um período de 18-24 horas. A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), é evidenciada pelo alargamento da zona de análise, que adquire a forma de ponta de flecha, característica na área de intersecção entre as duas estrias. Fonte: https://bv.fapesp.br/en/instituicao/2046/instituto- paulista-de-doencas-infecciosas-e-parasitarias- idipa/ Provas de identificação Teste da bile esculina: A prova da bile esculina avalia a capacidade de determinadas bactérias de hidrolisarem a esculina em esculetina em um meio contendo sais minerais e ferro; A esculetina hidrolisada reage com os íons ferro, gerando a formação de um induto preto no interior do tubo. Para realizar a prova, deve-se semear a bactéria em tubo contendo meio de bile esculina, incubar em temperatura entre 35-37 ºC, durante um período de 18-24 horas; se houver formação de induto preto, o teste é positivo; mantendo-se a cor marrom do meio, o teste é negativo. Provas de identificação Fonte: acervo pessoal. Teste do NaCl 6,5%: No teste do NaCl 6,5%, utiliza-se um meio líquido, também chamado de caldo, em que se adiciona uma solução de NaCl a 6,5%. É sabido que muitas bactérias não resistem à tamanha concentração de sal; Nesse caso, as bactérias que conseguem sobreviver se multiplicam no meio graças aos nutrientes presentes, turvando-o; As bactérias que não resistem morrem e acabam por se depositar no fundo do tubo, mantendo o meio translúcido. Provas de identificação Fonte: acervo pessoal. LÍMPIDO TURVO Fonte: Adaptado de: https://bv.fapesp.br/en/instituicao/2046/instituto-paulista-de-doencas- infecciosas-e-parasitarias-idipa/ Fluxograma de identificação de Streptococcus alfa hemolítico spp. Identificação Optoquina Bile esculina Tolerância NaCI 6,5% Pneumococo Sensível Negativo Negativo Enterococos Resistente Positivo Positivo Grupo viridans Resistente Negativo Negativo Streptococcus bovis Resistente Positivo Negativo Fonte: https://bv.fapesp.br/en/instituicao/2046/instituto-paulista-de-doencas-infecciosas-e-parasitarias- idipa/ Fluxograma de identificação de Streptococcus beta hemolítico spp. Identificação Bacitracina Camp Test Sensibilidade SXT Bile-esculina e tolerância NaCI 6,5% S. pyogenes Sensível Negativo Resistente Negativo S. agalactiae Resistente Positivo Resistente Positivo Enterococcus sp. Resistente Negativo Resistente Negativo Estreptococcus não A, B ou D Resistente Negativo Sensível Negativo Fluxograma de identificação de Streptococcus gama hemolítico spp. Fonte: Adaptado de: https://bv.fapesp.br/en/instituicao/2046/instituto-paulista-de-doencas- infecciosas-e-parasitarias-idipa/ Identificação Camp Test Bile-Esculina Tolerância NaCI 6,5% S. agalactiae Positivo Negativo Negativo Enterococcus sp. Negativo Positivo Positivo Streptococcus bovis Negativo Positivo Negativo Qual bactéria do grupo do Streptococcus corresponde a esta descrição: beta hemolítica, bacitracina resistente, camp test positivo, sensível ao SXT, bile-esculina positiva e crescimento em NaCl positivo? a) Streptococcus pyogenes. b) Streptococcus bovis. c) Enterococcus faecalis. d) Grupo viridans. e) Streptococcus agalactiae. Interatividade Qual bactéria do grupo do Streptococcus corresponde a esta descrição: beta hemolítica, bacitracina resistente, camp test positivo, sensível ao SXT, bile-esculina positiva e crescimento em NaCl positivo? a) Streptococcus pyogenes. b) Streptococcus bovis. c) Enterococcus faecalis. d) Grupo viridans. e) Streptococcus agalactiae. Resposta Imóvel, não formador de esporos e a maioria das espécies cresce bem entre 35-37 ºC. Microrganismos capnofílicos (crescem melhor em 5% de CO2) crescem melhor em ambientes úmidos. Todas as espécies do gênero são oxidases positivas e catalases positivas. A maioria das espécies humanas de Neisseria é habitante normal das vias respiratórias superiores e não é considerada patógena, embora, ocasionalmente, esses microrganismos sejam isolados de processos infecciosos. As espécies de N. meningitidis e N. gonhorrhoeae são fastidiosas e requerem a presença de aminoácidos como suplemento, ágar chocolate ou outros meios enriquecidos. Neisseria spp. As várias espécies de Neisseria se apresentam morfologicamente como diplococos Gram- negativos lateralmente achatadas, de aspecto riniforme (lembram rins) ou dois grãos de feijão unidos por uma ponte. Apenas a espécie N. elongata difere dessa morfologia, sendo diplobacilos ou diplococo-bacilo. As N. Gonorrhoeae crescem em ágar chocolate formando colônias pequenas. As colônias de N. Meningitidis A e C capsuladas se apresentam com consistência mucoide. Testes imunológicos não substituem a cultura e a bacterioscopia e, para o diagnóstico da gonorreia, existem kits de Elisa comerciais, sondas genéticas de ácido nucleico, PCR e as suas variantes, que se mostram altamente eficientes apesar de seu elevado custo. Neisseria spp. Os seres humanos são os únicos hospedeiros naturais dos meningococos, que podem ser transmitidos por gotículas disseminadas pelo ar. Colonizam as membranas da nasofaringe e se tornam parte da microbiota transitória do trato respiratório superior. Os portadores são assintomáticos (8-40%). A maior incidência da doença é em crianças menores de 5 anos. Aglomerações favorecem a disseminação respiratória dos meningococos. Da nasofaringe, penetram a corrente sanguínea e se disseminam para os sítios específicos, como as meninges ou para todo o corpo. Na meningite, os sintomas típicos são: febre, dor de cabeça, pescoço duro e um aumento nos níveis de PMNs no liquor. Outras síndromes causadas por N. meningitidis são pneumonia, artrite, uretrite. Neisseria meningitidis No exame de um líquido cefalorraquidiano (LCR) com suspeita de infecção por Neisseria meningitidis, pode ser feita a técnica de aglutinação com partículas de látex, que é rápida, com uma boa sensibilidade, especificidade e permite a tipagem dos principais tipos prevalentes em meningites. Coloração de Gram é muito sensível e específica. Cultura (meios não seletivos – ágar chocolate ou seletivos – ágar Thayer-Martin). Testes para a detecção de antígenos (N. meningitidis). Testes baseados em ácidos nucleicos. Diagnóstico de meningite Neisseria gonorrhoeae Fonte: Adaptado de: https://www.ufjf.br/ Gonorreia – Manifestações da doença Recém-nascidos e crianças de, até, 1 ano de idade Crianças acima de 1 ano Jovens e adultos Oftalmia neonatal Síndrome da infecção neonatal do líquido amniótico Infecção disseminada Uretrite Vaginite Conjuntivite Faringite Proctite Infecção disseminada MULHERES Cervicite DIP Uretrite Peri-hepatite Bartholinite HOMENS Uretrite Epididimite AMBOS OS SEXOS Conjuntivite Faringite Proctite Infecção disseminada: artrite, dermatite, endocardite, meningite Coloração de Gram é muito sensível e específica (exceto em pacientes assintomáticos para a gonorreia, em que deve ser feita a cultura). Cultura (meios não seletivos – ágar chocolate ou seletivos – ágar Thayer-Martin). Testes para a detecção de antígenos (N. meningitidis). Testes baseados em ácidos nucleicos. Diagnóstico de gonorreia Bacterioscopia de Neisseria Fonte: acervo pessoal. Utilizar tiras com reativo para a oxidase, adquiridas comercialmente. Pingar uma gota de solução salina 0,85% estéril na tira de oxidase. Com o auxílio de uma alça bacteriológica, transferir assepticamente uma ou duas colônias da bactéria em análise, e distribuir, uniformemente, sobre a superfície da área reagente da tira; notarse, em 2 minutos, ocorre o desenvolvimento de uma coloração violeta caracterizando um teste de oxidase positiva. Prova da oxidase Oxidase neg. Oxidase pos. Fonte: acervo pessoal. Além da Neisseria meningitidis, qual outra bactéria do grupo do Streprococcus também está fortemente associada com meningite bacteriana? a) Streptococcus pyogenes. b) Streptococcus pneumoniae. c) Streptococcus faecalis. d) Streptococcus agalactiae. e) Streptococcus mutans. Interatividade Além da Neisseria meningitidis, qual outra bactéria do grupo do Streprococcus também está fortemente associada com meningite bacteriana? a) Streptococcus pyogenes. b) Streptococcus pneumoniae. c) Streptococcus faecalis. d) Streptococcus agalactiae. e) Streptococcus mutans. Resposta ATÉ A PRÓXIMA!