Citometria de fluxo

Prévia do material em texto

Prof Me Alisson T. Buchi
Práticas de Biomedicina II
FMU
o DEFINIÇÃO:
• É uma técnica utilizada para: 
• contar, examinar e classificar partículas microscópicas
suspensas em meio líquido em fluxo.
• Permite a análise de vários parâmetros
simultaneamente, sendo conhecida também por
citometria de fluxo multiparamétrica.
• Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são
possíveis análises de características físicas e/ou químicas de 
uma simples célula. 
• O citômetro de fluxo é um aparelho utilizado para avaliação
da emissão de fluorescência das células (FACS –
Fluorescence Activated Cell Sorter). 
• O citômetro de fluxo mede as propriedades de dispersão de 
luz pelas as células e a emissão de luz de anticorpos
monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície
de uma célula covalentemente.
• Os anticorpos monoclonais são os reagentes de escolha
devido à sua especificidade, reação cruzada mínima e 
reprodutibilidade. 
• VANTAGENS
• Mede múltiplos parâmetros em células individuais;
• Grande número de células analisadas com rapidez;
• Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos
específicos;
• Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos
e intranucleares;
o APLICAÇÕES
• Fenotipagem dos leucócitos
• Fenotipagem de células tumorais
- Diagnóstico e classificação das leucemias e dos 
linfomas
• Análise de DNA
• Análise da função dos neutrófilos
• Contagem de reticulócitos
• As células, uma vez em suspensão, são orientadas em um 
fluxo laminar e interceptadas uma a uma por um feixe de luz 
(LASER).
• Um número de detectores são apontados ao local onde o 
fluxo passa através do feixe de luz; 
• um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC)
• vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) 
• além de um ou mais detectores fluorescentes. 
• Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa
a luz de uma forma diferente.
• Fluorocromos fluorescentes encontrados na partícula
podem ser excitados emitindo luz de menor frequência do 
que o da fonte de luz. 
• Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada
pelos dectetores, e analisando as flutuações de brilho de 
cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente)
• Possível explorar vários tipos de informação sobre a 
estrutura física e química de cada partícula. 
ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
CÉLULA
Detector de dispersão de 
luz em ângulo de 90º 
Complexidade celular
SSC (Side Scatter)
Detector de dispersão de 
luz frontal 
Tamanho celular
FSC (Forward Scatter)
Fonte de Luz Incidente: Laser 
de Argon a 488 nm 
4) Dispersão
lateral de luz
1) Suspensão de células
Laser
3) Dispersão de luz 
para a frente
4)Filtro 
6) Análise
de dados
5) A luz refletida passa
através de filtros e é 
detectada por tubos
fotomultiplicadores que 
convertem o sinal luminoso
em sinal eletrônico
2) Anticorpos monoclonais associados a 
fluorocromos e ligados à superfície de uma
célula
Linfócito TCD4
Anticorpos monoclonais
marcados
Linfócito TCD8
Citometria de fluxo
Luz fluorescente
Contagem das 
células
Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal) 
Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro.
Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente
E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente
Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos
Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência) 
Neste quadrante estão as 
células CD4+ e CD3-
Neste quadrante estão as 
células CD4- e CD3-
(células que não linfócitos)
Neste quadrante estão as 
células CD4- e CD3+
(outros linfócitos que não Th)
Neste quadrante estão as 
células CD4+ e CD3+
(linfócitos Th)