TESTE DE ESTERILIDADE 2020

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TESTE DE 
ESTERILIDADE
HISTÓRICO
• Terapêutica parenteral iniciou no Século XVIII;
• Primeiro teste de esterilidade foi publicado no British Pharmacopoeia
(1932);
• Teste em amostras líquidas em caldo peptonado a 37º C por 5 dias;
• USP XI adotou o mesmo procedimento em 1936;
• Inovações posteriores, como a inclusão da pesquisa de fungos e 
leveduras e a inclusão do método indireto;
CONDIÇÕES DE TRABALHO
• Ambiente de fácil limpeza e desinfecção;
• Parede sem irregularidades na superfície;
• Alimentação de ar filtrado;
• Pressão positiva;
• Lâmpadas germicidas;
• Necessidade da realização do teste de contaminação 
acidental;
• Consiste na exposição de placas de petri contendo meios de 
cultura no ambiente;
• A filtração direta do ar, em membrana esterilizante e 
semeadura do filtro é um processo alternativo;
• Avaliação da contaminação de superfícies com esfregaços 
com swabs;
• A utilização de filtros absolutos tipo HEPA ou câmaras de fluxo 
laminar permite condições seguras e eficazes para a 
realização do teste.
CONDIÇÕES DE TRABALHO
Teste de Esterilidade
Verificar a presença de micro-organismos viáveis em produtos que 
tenham sido submetidos a algum processo esterilizante, pela inoculação 
em meio de cultura nutriente, que permite a detecção de bactérias, 
bolores e leveduras, incubado por temperatura e tempos adequados
Oficializado:
em 1932 na British Pharmacopeia e 
em 1936 USP XI
• É um teste de controle de qualidade utilizado como parte de 
liberação do produto 
• Tem limitações estatísticas significativas – detecta apenas 
contaminação grosseira
• Testar amostras do início, meio e fim de produto fabricado de 
forma asséptica, além de amostras pós intervenções e paradas
• Amostras de produtos esterilizados devem ser tomadas de acordo 
com plano de amostragem.
• A amostragem deve ser suficiente para permitir, se necessário 
refazer testes
AMOSTRAGEM
• O teste de esterilidade é um ensaio limite;
• Deve ser representativo do lote;
• Quanto maior for a quantidade de amostras ensaiadas, 
maior será a segurança do resultado;
• O conceito de lote neste caso deve ser avaliado sob 
diferentes critérios:
• Total de unidades produzidas com igual risco de 
contaminação;
AMOSTRAGEM
• Se matéria-prima, cada embalagem deve ser analisada 
(nem sempre possível);
• Se utilizado processo de esterilização após a produção 
do produto, o lote será aquele relacionado a cada ciclo 
de esterilização e não o número total de unidades 
produzidas;
• Se produto a granel, cada recipiente deverá ser 
amostrado;
• Para ampolas o teste de esterilidade deve ser realizado 
após o teste de vazamento.
• Deve ser realizado sob as mesmas condições de fabrico asséptico
• Utilizar câmara de fluxo laminar de grau A câmara de ar de fundo Grau 
B
• Fornecimento de ar através de filtros HEPA, as pressões devem ser 
monitorados e alarmados
• O acesso à área deve ser através de despressurização
• Os operadores devem ser adequadamente vestidos com roupas estéreis 
e devidamente treinados e validados
• Procedimentos de limpeza, higienização e desinfecção adequados 
devem estar no local
• Monitoramento ambiental deve ser realizado
PREPARO DA AMOSTRA
• Deve ser cuidadoso para evitar resultados falsos;
• Consiste em desinfetar a superfície externa dos frascos, ampolas ou 
outros materiais de acondicionamento, com soluções antissépticas 
voláteis;
• Álcool a 70% é o mais utilizado, pode-se utilizar ainda o fenol 5%, 
álcool iodado, formaldeído 5% e álcool isopropílico;
• O tempo de contato é dependente da solução antisséptica utilizada;
• O contato por imersão é o método de escolha;
• A identificação da amostra é outro fator crítico do teste;
• O uso de dispositivos para auxiliar na abertura das amostras 
pode ser uma boa opção para evitar contaminação;
• No caso dos materiais médicos hospitalares, são necessários 
o uso de swabs, posteriormente lavados ou a lavagem direta 
com água peptonada com a posterior filtração e inoculação da 
membrana para a realização do teste.
PREPARO DA AMOSTRA
METODO DE INOCULAÇÃO
São utilizadas duas metodologias de inoculação;
Necessidade de comprovação da interferência 
de um falso-negativo.
https://www.youtube.com/watch?v=PqPKFF4OOsU
https://www.youtube.com/watch?v=y-Kq161PbY8
https://www.youtube.com/watch?v=AaxyOv8b8Os
INOCULAÇÃO DIRETA
Primeiro método desenvolvido para o teste de esterilidade até 
hoje sendo utilizado;
• Método direto, simples e de fácil execução, requer pouco treinamento 
e caracteriza-se por baixo nível de contaminação acidental;
• Porém, apresentam baixa representatividade da amostra, consumo 
elevado de meios de cultura e de vidraria, possibilidade de resíduos 
de agentes inibitórios, tempo de incubação, restrição para volumes a 
partir de 100 mL e interferência da turbidez do produto;
• Inoculação de quantidades ou volume pré-estabelecidos da amostra 
em volumes pré-estabelecidos de meios de cultura, na forma líquida 
ou mediante a semeadura em meio sólido;
INOCULAÇÃO DIRETA
INOCULAÇÃO DIRETA
• Uso de tubos de ensaio contendo o meio de cultura líquido previamente 
esterilizado;
• A transferência é realizada com auxílio de pipetas, seringas ou vertida 
diretamente sobre o meio;
• Para substâncias oleosas se faz necessário o uso de um tensoativo, a fim 
de dispersar a tomada do ensaio no meio;
• Para pomadas oftálmicas, sugere-se que a base seja fundida e a seguir 
adicionada o tensoativo;
• Os produtos com ação antimicrobiana devem ser testados com critérios 
corretos, a fim de impedir a interferência desta atividade intrínseca.
INOCULAÇÃO INDIRETA
•Técnica introduzida somente em 1957;
•Caracteriza-se por tratamento prévio da
amostra com a sua solubilização ou lavagem
em líquidos fisiológicos, seguida de filtração
esterilizante, inoculação da membrana
filtrante em meio de cultura apropriado;
•O produto não entra em contato com o meio
de cultura;
•Método utilizado inicialmente para teste de antimicrobianos difíceis de 
serem inativados;
• Membrana filtrante utilizada constituída de
ésteres de celulose, com diâmetro de 47
mm, de borda hidrófoba e tamanho de poro
de 0,22 ou 0,45 ± 0,02 m;
• Antes de ser utilizado o sistema deve ser
montado e esterilizado em autoclave;
INOCULAÇÃO INDIRETA
INOCULAÇÃO INDIRETA
• O método é capaz de testar grandes volumes e ocasionalmente todo o 
conteúdo de injetáveis de grande volume;
• Proporciona a economia do uso de meios de cultura (cerca de 100 
mL/lote;)
• Método mais susceptível de contaminação acidental;
• Maior necessidade de treinamento técnico;
• Não pode ser aplicado para suspensões, óleos, cremes e pomadas 
insolúveis.
MEIO DE CULTURA
• Desconhecimento pelo analista do contaminante viável residual no
produto;
• Meios que promovam o crescimento de bactérias mesófilas e psicrófilas e
fungos;
• Uso de pelo menos dois tipos de meio de cultura;
MEIO DE CULTURA
• Os mais utilizados são:
• Soybean Casein Digest (SCD), (também 
conhecido como Trypticase Soy Broth (TSB) 
e Fluido Tioglicolato médio (FTM) usado para 
detectar organismos aeróbios e anaeróbios
https://www.youtube.com/watch?v=y-Kq161PbY8
https://www.youtube.com/watch?v=cneascR3OEc
TEMPO E TEMPERATURA DE 
INCUBAÇÃO
• Muitas variações sobre estes parâmetros foram
efetuadas;
• São aceitos o uso de 7 a 14 dias em uma
temperatura de 30 a 37ºC para bactérias;
• 20 a 25º C para fungos e leveduras.
CONTROLE DA EFICIÊNCIA
• Um teste de contaminação acidental deve ser realizado em paralelo ao
teste.
• Necessidade de inclusão de um controle positivo e outro negativo;
• O método deve ser validado;
• A qualificação da instalação é outro pré-requisito normalmente
requerido.
• Não deve ter crescimento microbiológico
• Um teste só pode ser repetido quando puder ser demonstrado que 
o teste era inválido por causas não relacionadas ao produto que 
está sendo examinado
▪Critérios da Farmacopeia Europeia para Reteste:
▪ (a) os dados do monitoramento mostrar uma falha
▪ (b) o procedimento de teste utilizado durante o ensaio em 
questão revela uma falha
▪ (c) crescimento microbiano encontrado em controles negativos
• (d) falhas no que diz respeito ao material que prejudicam a 
identificação dos microrganismos isolados e que tenham crescido 
nas placas.
• Procedimentos de pré-esterilização de carga microbiana, 
utilizado para controle em processo e testes de matérias-
primas 
• O método deve ser validado para a recuperação de baixos 
números de organismos
• Baseia-se no uso de meio anaeróbio para detecção de 
microrganismos no ambiente
• Devem ser determinados limites de aceite, de alerta e de 
ação e medidas tomadas se os limites forem excedidos
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https://www.youtube.com/watch?v=1rCuoEAMVT8
https://www.youtube.com/watch?v=7z96761vMXY
• Teste de capacidade do meio de cultura em suportar o 
crescimento microbiano
• Os meios de cultura devem ser capaz de suportar o 
crescimento de uma vasta gama de microrganismos 
(bactérias e fungos)
• Geralmente se usa o meio Caseína de soja digerido (Soybean 
Casein Digest). Um meio anaeróbio que também pode ser 
substituído, ocasionalmente, para indicação de presença de 
microrganismo na monitorização ambiental
• Após o preenchimento das placas de petri com meios de 
cultura, é importante demonstrar que sejam capazes de 
suportar o crescimento 
• Os recipientes com meios devem ser inoculados com 10-100 
UFC de cepas de organimos como Bacillus subtilis, 
Staphylococcus aureus, Candida albicans, Aspergillus niger. 
• As cepas utilizadas devem ter 
pureza e qualidade 
comprovada. 
• Devem ser cepas padrão ATCC 
- (American Type Culture 
Collection)
• Os meios inoculados devem ser capaz de mostrar o 
crescimento dentro de 3 dias de incubação para bactérias e 5 
dias para fungos
• Meios utilizados no monitoramento ambiental também deve 
ser testado quanto a sua fertilidade.
• Deve ser realizada Validação de recuperação para demonstrar a 
neutralização de resíduos de desinfetante (meio deve conter 
neutralizadores).
• Meios adquirido externamente devem igualmente ser testados
• Meios utilizados para monitoramento ambiental deve ser pré-
incubado para demonstrar "esterilidade" antes de usar
• Meios de cultura devem ter uma vida útil validada, ou seja, 
determinar a validade destes.