Imunodiagnósticos (1)

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Imunodiagnósticos 
Nessa aula, serão mostradas algumas metodologias empregadas em “n” imunodiagnósticos. Como conceito incial, referente à imunodiagnósticos pensamos em formação de imunocomplexos, haja visto que o anticorpo se liga ao antígeno. Então posso, com isso, pesquisar antígenos presentes no ser humano de algum agente infeccioso ou não e também anticorpos produzidos por ele ou não. Portanto, a ideia inicial é sempre essa, formar complexos antígeno-anticorpo na busca de um dos dois. Posso detectar, por exemplo, como objetivo, se a pessoa tem uma doença: verificando se a pessoa tem anticorpos ou se apresenta antígenos em sua amostra. Nem sempre o diagnóstico imunológico é feito para detectar doenças infectocontagiosas, existem outras situações em que podemos utilizar a “imuno” para diagnosticar situações: B-HCG teste de gravidez, grupo sanguíneo (ABO e fator RH), PSA (antígeno-prostático), TSH (hormônio tireoideano), etc. O imunodiagnóstico não é apenas para determinar doenças infectocontagiosas, mas, também, outras condições.
Nós sabemos, quando pensamos em antígeno-anticorpo, remetemos à especificidade. Entretanto, temos que lembrar que pode haver situações onde ocorre uma reatividade cruzada. Se antígenos diferentes possuírem epítopos semelhantes, pode haver reação cruzada. Dessa forma, uma doença que você está detectando pedindo o exame, acaba dando positivo apesar de o indivíduo ser negativo para ela, caracterizando um falso positivo, que só ocorreu decorrente reação cruzada que o indivíduo teve com outra doença. Exemplo: Quero saber se o paciente teve dengue, foi positivo, entretanto o paciente não tinha dengue, era chikungunya. O exame não vai especificar o que ele realmente tem, apenas relatará um falso positivo para dengue. 
Se o antígeno A se liga ao anticorpo A, logicamente, está mostrando que esse anticorpo é específico para determinado antígeno, entretanto esse anticorpo ainda pode se ligar a um antígeno B ou C, fazendo uma reação que gera um valor positivo, mas que, na verdade, não é aquilo que estamos detectando. Exemplo 2: Suspeita de verminose no paciente, não sei qual, peço um parasitológico de fezes, onde pode ser detectado “n” vermes, todos aqueles que liberam ovos nas fezes do indivíduo. Não precisa direcionar, de forma que se pega uma gama de vermes (ovos) na amostra. Entretanto, quando passa para imunodiagnóstico tudo muda, de forma que se eu peço o imunodiagnóstico para toxoplasmose, se o indivíduo estiver com outra doença, vou ter um resultado negativo para toxoplasmose. O exame é específico. Porém, às vezes, mesmo que o indivíduo não tenha determinada doença como a toxoplasmose, o resultado ainda vir positivo, pois os anticorpos que ele produziu para outra doença que ele tinha, às vezes, se ligou ao epítopo do toxoplasma. Então, a situação que melhorou essas condições, em imunobiológicos, foi quando se criou os anticorpos monoclonares para serem utilizados em imunodiagnóstico, de forma que eles são específicos para um epítopo como, por exemplo, do toxoplasma gondii, onde se o indivíduo tiver outros antígenos e não tem aquele epítopo compartilhado com o toxoplasma, aí realmente dará resultado negativo para outras doenças e somente positivo para toxoplasma, não tendo reação cruzada. Os surgimentos dos anticorpos monoclonais reduziram a reação cruzada. 
Para solicitarmos um diagnóstico imunológico, nossa suspeita tem que estar mais embasada, mais certeira. “N” doenças em suas fases agudas, apresentam sintomas inespecíficos como: febre, mal-estar, vermelhidão pelo corpo. O que o paciente tem? Sarampo? Rubéola? Toxoplasmose? Não sei. Ou pede todas os testes para todas as suspeitas ou depois de um tempo que os sintomas já ficam mais característicos do doença, que vai ser onde teremos um melhor direcionamento diagnóstico laboratorial. Existem alguns sintomas que são comuns a várias doenças e isso, para diagnóstico diferencial, só na clínica, fica, às vezes, dificultoso. Quando já está mais aparente já tenho uma suspeita que realmente pode ser, de forma que concluo o diangóstico com o imunodiagnóstico condizente. 
Temos dois conceitos que são de fundamental entendimento - Afinidade e avidez: 
Os anticorpos se ligam aos antígenos através de ligações não-covalentes, de forma que não compartilham elétrons (ponte de hidrogênio, van der waals) de forma que proporcionam estabilidade (não 100%, de forma que o complexo antígeno-anticorpo pode se ligar e desligar). Em determinada região, se emitirmos uma força de somente 1 fragmento FAB com a ligação do antígeno, essa força indica que quanto mais forte, mais afinidade o anticorpo tem pelo antígeno e vice-versa. Então analisando um único fragmento FAB conseguimos determinar a afinidade que o anticorpo tem pelo antígeno e vice-versa. Avidez: Olha-se como um todo, comparando-se, por exemplo: IgG e IgM, IgG é um monômero e IgG é um pentâmero. Dessa forma, pelo IgM conseguir ter uma força total de ligação (devido sua estrutura) maior que o IgG, podemos afirmar que sempre o IgM terá maior avidez com os antígenos. 
Costuma-se, às vezes, o médico solicitar ao paciente um teste de avidez contra determinada doença. Exemplo: Rubéola e toxoplasmose são doenças que podem ser transmitidas da mãe para o feto através da placenta. Considere, então, que, ao pegar o resultado deu IgG e IgM positivo (produção aumentada), ou seja, a gestante está com a doença, mas, às vezes, será interessante descobrir se a infecção acabou de ser adquirida ou se já passou um pouco mais. Só tem como saber isso testando a avidez. Quanto maior a avidez, deduz-se que tem maior tempo de contato com o antígeno, mostrando que a infecção é antiga. Ela, então, pode estar com sintomas da doença em curso, mas ela já tem a doença há mais tempo. Se o resultado que tivermos em mãos for IgM e IgG positivos, ela está com a doença (a gestante, no caso). Se a avidez for baixa, é um antígeno novo. Dessa forma, pensando em uma transmissão congênita, talvez exisitia um pior caso, de maneira que a infecção recente já pode passar para o feto. 
Os métodos de imunodiagnósticos basicamente são divididos em dois grandes grupos, onde um grupo utiliza anticorpos ou antígenos sem marcações (o principal grupo de diagnósticos desse é a aglutinação) e o outro onde as moléculas são marcadas com substâncias fluorescentes, radioativas, enzimas. Nesse primeiro grupo, onde os antígenos/anticorpos não estão marcados temos o primeiro caso, o da aglutinação.
Aglutinação: Um dos componentes antígeno ou anticorpo é apresentado na forma insolúvel em suspensão, de forma natural em células, ou adsorvido artificialmente a micropartículas ou células. Se eu tenho uma substância líquida onde há antígenos ou anticorpos livres, no momento em que eu adicionar o par dele para formar um imunocomplexo, tenho, como consequência, a formação de um precipitado (grumo), de forma que essa aglutinação agora se torna visível a olho nu, estamos utilizando esse princípio. O exemplo mais comum é para verificação de fator ABO e RH, determinando o tipo sanguíneo. Sei que as hemácias do indivíduo possuem antígenos ao redor de suas membranas. Nesse caso, eles passam a ser chamados de aglutinogênios. Portanto, se eu coloco um anticorpo contra aquele antígeno, esses anticorpos vão fazer com que essas hemácias se aglutinem, formando grumos. Esses grumos, agora, se tornam visíveis a olho nu. As hemácias, com a formação dos grumos, se tornam totalmente insolúveis à parte líquida (não dá nem para homogeneizar). Esse é o princípio de aglutinação. 
As vantagens desses métodos incluem: 
· Elevada sensibilidade
· Baixo custo
· Fácil execução 
· Leitura visual (não requer microscópios ou qualquer outro tipo de maquinaria sofisticada).
A aglutinação se subdivide em aglutinação direta e indireta. 
No caso das hemácias, os antígenos estão ligados às células, a própria célula está se aglutinando em contato com o anticorpo, de forma que a chamamos de aglutinação direta. De forma que os anticorpos são ligados aos antígenos que, por sua vez, pertencem àquelacélula que está sendo aglutinada. 
Se fosse, por exemplo, uma bactéria (apresenta antígeno em sua superfície), colocando uma bactéria do lado da outra, na amostra do paciente, eu utilizo um reagente que tem um anticorpo contra ela que promoverá a aglutinação da própria célula bacteriana (aglutinação direta). 
Algutinação direta: Antígeno faz parte naturalmente da célula. Haverá aglutinação caso os anticorpos se liguem.
Aglutinação indireta/passiva: Utiliza-se uma micropartícula, geralmente o látex, de forma que se consegue adsorver essa antígenos ou anticorpos. Anticorpos. Quem aglutina é o látex. Exemplo: Quero detectar a proteína C reativa (PCR – proteína de fase aguda em processo inflamatório). Tem como a proteína se unir, aglutinar a proteína? Não, ela não é uma célula, de forma que se torna necessário a adsorver em uma partícula de látex. Quando eu utilizar o anticorpo contra esse reagente montado, na verdade o anticorpo se liga ao PCR, mas quem aglutina é a partícula de látex (mediante formação de imunocomplexo). Uma aglutinação indireta. Sem o látex continuaria impossível de ser observado, continuaria solúvel no líquido (ausência de formação de grumo). 
*Se eu quero pesquisar um antígeno, o anticorpo que está preso no látex. Se eu quero pesquisar o anticorpo, o antígeno que está preso no látex. Dependendo do que estamos pesquisando.
Foto: o resultado negativo dá para ver uma mancha branca homogênea. 
Negativo, Negativo: indicando que o soro do paciente entrou em contato com o látex que tem o antígeno em volta sem reação. Se não reagiu, o látex não se aglutinou, formando uma substância branca leitosa homogênea a olho nu. Nos dois primeiros casos da foto ao lado, aglutinou, de forma que as partículas de látex se aglomeraram mediante formação do imunocomplexo (antígeno-anticorpo). Reação de aglutinação indireta. 
Esses exames de aglutinações podem ser exames semiquantitativos, tem a possibilidade de semiquantificar a amostra, não tem como determinar, por exemplo, o quanto de PCR tem na amostra do indivíduo, mas através de diluições das amostras é possível fazer um semiquantitativo onde, logicamente, vou diluindo a amostra (soro do paciente) cada vez mais, de forma que quanto mais eu diluir e continuar dando positivo, é sinal que ele tem muito anticorpo ou muito antígeno, caracterizando uma titulação muito alta. Exemplo: Tive que diluir o PCR 1/16 e continuou dando positivo, assim como em 1/32 e 1/64, de forma que quanto mais aumenta a diluição e continua dando positivo, mais PCR o indivíduo tem na sua amostra. Ao iniciar p tratamento de um paciente, espero que a PCR diminua: Antes do tratamento a amostra deu positiva 1/64, depois do tratamento apenas em 1/8, mostrando quadro de melhora do paciente. Para sífilis, se faz a mesma coisa.
Microaglutinação: existe, ainda, a microaglutinação. É feita em plaquinhas (96 fossinhos, que permitem a análise de amostras mínimas), normalmente se utiliza hemácias de aves ou mamíferos adsorvidas com antígenos ou anticorpos. A microaglutinação também é chamada de hemaglutinação indireta. A hemácia aglutina não por eu estar buscando grupo sanguíneo (não é porque são antígenos próprios das hemácias) é porque adsorvemos as hemácias a outros antígenos.
Foto ao lado: Presença de 96 fossos, foi diluído até 1/1024, colocamos uma região onde tem controle positivo e uma região onde tem controle negativo. O paciente número 8, por exemplo, reação deu positiva até 1/32, logo, o título dele é 32. Se eu quero saber, por exemplo, se o indivíduo tem doenças de Chagas, com esse exame eu sei se ele tem ou não e, além disso, consigo ver a titulação (vejo se tem muito antígeno/anticorpo). Comparativamente o paciente 4 tem maior número de anticorpos, mesmo diluindo sua amostra várias vezes, até chegar na proporção 1/512, a amostra continuou reagindo, sendo positiva, indicando que ainda assim tem quantidade suficiente de anticorpo que consiga reagir com os antígenos presentes nas hemácias que colocamos nessa mcroaglutinação como reagente.
Se o anticorpo reage com essas hemácias, indiretamente porque reagiram com o antígeno, as hemácias vão formar grumos (uma rede) que as impedem de sedimentar. Vemos, então, “tudo vermelhinho”. Agora, se não teve anticorpo ligando aos antígenos presentes nas hemácias, as hemácias irão para o fundo do fosso, onde não irão se aglomerar, mas irão sedimentar. Se eu vir apenas “um botãozinho”, negativo. Se eu vir “tudo espalhado, vermelhão”, positivo.
Outra variante de aglutinação: Inibição da aglutinação. Agora, se der um resultado positivo, é porque não houve aglutinação, ela foi inibida, esse método é utilizado em maior número para vírus que conseguem produzir hemaglutinantes, ou seja, o próprio vírus consegue liberar antígenos que apresentam capacidade de aglutinar as hemácias. Nesse contexto, se colocamos um soro em um paciente, que contém anticorpo contra aquele vírus, onde o anticorpo pode neutralizar esse vírus e quando o faz, o vírus não consegue mais aglutinar as hemácias: Inibição da aglutinação. As hemácias não sofreram aglutinação mediante presença do antígeno ligado ao anticorpo. Se inibiu, positivo. Se aglutinou, negativo (ausência do anticorpo na amostra do paciente, permitindo que os vírus consigam, por si só, gerarem antígenos hemoaglutinantes.
Teste de Coombs: Direto e indireto
Função de pesquisar anticorpos contra antígenos eritrocitários capazes de sensibilizar as hemácias, mas incapazes de aglutiná-las. Em algumas situações naturais do ser humano, ele é capaz de gerar anticorpos contra hemácias mas que, in vivo, não causa aglutinação. Pode causar uma opsonização, proporcionando que um leucócito chegue e fagocite aquele complexo, pode ativar o sistema complemento, mas não consegue aglutinar as hemácias. Esses anticorpos são do Coombs. Quando solicitar? Indivíduo com suspeita de doença hemolítica autoimune, quando há suspeita que a mãe está produzindo anticorpos anti-RH do filho (eritoblastose fetal) são exemplos de situações em que solicitamos o Coombs. No direto desejamos saber se o indivíduo já tem ao redor de suas hemácias, anticorpos ligados. Se ele já tem os anticorpos ligados, basta eu coletar o sangue total dele (com anticoagulante), adiciono o soro de Coombs (anticorpo anti-anticorpo do homem*), onde se houver ligação as hemácias se aglutinam. 
Exemplo 1: Paciente com anemia autohemolítica - O Coombs é provável vir positivo, de maneira que ele está gerando anticorpos contra suas próprias hemácias, bastando um leucócito vir a destruir essa hemácia (hemólise). Basta o sistema complemento ser ativado pela via clássica que formará o MEC (complexo de ataque à membrana) e a hemácia também irá lesar. 
Em relação ao Coombs indireto, queremos saber se o paciente tem anticorpos contra hemácias livres no seu soro, o que eu uso para aglutinar não são hemácias do próprio indivíduo, o que uso são hemáciais O+ de outro paciente (tiramos os aglutinogênios do ABO, mas mantemos o RH). Por quê? Anticorpos contra RH são aqueles que atravessam placenta, são anticorpos da classe IgG (não conseguem aglutinar). Se fosse, por exemplo, IgM (contra ABO), levando à aglutinação. No diagnóstico que for fazer nessa questão, vai ter o RH, mas são anticorpos feitos industrialmente.
Exemplo 2: A gestante é RH negativo. Como sei se ela produziu anticorpos contra RH ou não? Como ela é RH negativo, não tem como fazer Coombs direto para ela, de forma que nas hemácias dela não terá anticorpos ligados, seus anticorpos poderão estar livres na parte sanguínea do sangue dela, mas que poderão afetar o seu feto (nesse caso, RH positivo). O que fazemos? Pega as hemácias de um indivíduo O+ para a realização do teste. Pegamos, então, a parte líquida do sangue dela e misturamos com essas hemácias, se as hemácias se ligarem (aos anticorpos livres no sangue), ainda assim não conseguimos ver nada mediante o fato desse anticorpo não ter a capacidade de aglutinação. Entretanto adicionando outro reagente, no caso o soro de Coombs, o anticorpo (“de Coombs”) agora adicionadose liga naquele anticorpo (que antes estava livre no sangue) que se ligou nas hemácias e aglutina. Coombs indireto. Não estou pesquisando diretamente se as hemácias estão com anticorpos ligados. 
Floculação: Uma variante (vertente) da aglutinação direta, só que a interação direta de anticorpos específicos com o antígeno leva à formação de imunocomplexos (MICELAS) em meio líquido, detectáveis em microscopia. Exemplo: Leite. Leite é uma solução homogênea somente a olho nu, sabemos que é coloidal. No microscópio, por exemplo, percebe-se micelas de gordura, que não estão misturados ao restante da água presente no leite. Nesse caso de floculação é a mesma coisa, quando o anticorpo se liga ao antígeno, não chega ao ponto de se tornar extremamente solúvel para vermos a olho nu, como na aglutinação. Forma-se micelas, de forma que essas só são observadas na microscopia óptica para a leitura. O principal exame para ser realizado por esse método é o método VDLR para sífilis – Antígeno não treponêmico, mas que a bactéria da sífilis induz a pessoa a produzir anticorpos anticardiolipina. Portanto, se eu utilizar cardiolipina para realizar esse exame, meço indiretamente se a pessoa pode ter sífilis ou não através do exame de floculação. 
Ensaios líticos: Aqueles que são pedidos para saber se a pessoa tem sistema complemento ou não. Quero saber, por exemplo, se o sistema complemento da pessoa está funcionando, ao passo de gerar todas aquelas vias de ativação, para saber se ela tem a capacidade de excluir um agente através do complemento. Até porque se a pessoa não tiver sistema complemento, vai estar sujeita a “n” infecções. 
No reagente, coloca-se hemácia com anticorpo que, por si só, não causa nada a ela. Adiciono o soro do paciente, se o soro tiver as proteínas do complemento: pela via clássica, o complemento vai gerar sua cascata e, consequentemente, realizando a hemólise e indicando a presença do sistema complemento. Se as hemácias ficarem íntegras, não tem complemento. 
· Dosagem de CH50
IMUNOENSAIOS UTILIZANDO CONJUGADOS:
Identifica a presença de antígenos ou anticorpos, empregando moléculas marcadas com compostos detectáveis (conjugados).
· Imunofluorescência: Onde se conjuga moléculas florescentes;
· Radioimunoensaio: Se houver ligação emite radiação;
· ELISA: Um dos mais famosos, utiliza conjugado antígeno-anticorpo conjugado com uma enzima capaz de degradar um substrato gerando um cromóogeno;
· Western Bloting: Exame que utilzia eletroforese;
· Imunocromatografia: Famoso, teste de gravidez da farmácia é um exemplo. 
Imunofluorescência direta: 
Exemplo: Quero saber se a pessoa tem doença de Chagas (trypanosoma cruzi), posso preparar uma lâmina cheia de trypanosoma cruzi e jogar, sobre essa lâmina, a amostra do paciente com anticorpo conjugado a uma molécula fluorescente. Se ele se ligar, gera uma fluorescência ao redor demarcando toda a morfologia do parasita, no caso, trypanosoma cruzi. 
Imunofluorescência indireta: 
Primeiro promove a ligação antígeno-anticorpo. Indiretamente é que eu adicionar um anticorpo contra aquele anticorpo e esse segundo está conjugado com uma molécula que emite fluorescência. Indiretamente detectamos uma fluorescência decorrente ligação com o imunocomplexo previamente formado no exame.
Radioimunoensaio: 
É necessário equipamentos que detectam a radioatividade para ver se é positivo ou negativo, mas a ideia é a mesma: Anticorpo marcado por moléculas radioativas.
Elisa: 
Modo de Preparo: colocar adsorvidos no fundo antígenos; jogar a amostra e lavar (se tiver anticorpos contra o antígeno ira se ligar ao antígeno e ficará no fundo mesmo pós lavagem); jogar anticorpos conjugados com enzimas (contra os anticorpos antipatógeno) e lavar (só permanecerão os ligados aos anticorpos); jogar o substrato da enzima (irá gerar a coloração); começar a “titulação” por diluição.
Western Blotting: Exame que detecta presença de proteínas nos antígenos. Muito utilizado para HIV. De forma que, para HIV, às vezes, é necessário não apenas o método diagnóstico, mas o confirmatório. O exame inicial para HIV é pesquisar se ele tem antígeno ou anticorpo. Se ele tem anticorpo para HIV, suspeita que ele tenha o vírus no corpo dele. A confirmação é feita pela verificação da amostra biológica dele onde se procura as proteínas do HIV. Para isso, faz o WB. De forma que se faz uma eletroforese, separando as partículas proteicas do sangue desse indivíduo onde se o paciente tiver HIV, também terá as proteínas virais sendo espalhadas ali. Depois que fez a eletroforese, essas proteínas são transferidas por um papel de nitrocelulose e nesse papel adicionam-se anticorpos específicos conta aquela proteína. Dessa forma, só vai aparecer a marcação onde o anticorpo se ligou. Nesse caso, portanto, exclui as proteínas do próprio indivíduo e só marca as proteínas virais. Na foto, ele citou o exemplo da p24 (proteína de HIV), se o indivíduo aparecer como positivo como o caso de muitos indivíduos da foto, estamos confirmando que esses apresentam o HIV. Muito mais específico, evitando a reação cruzada. 
Imunocromatografia: “Da tirinha de papel”.
Colocamos a amostra no papel e, por capilaridade, o próprio papel “suga” a amostra. No local onde a amostra é adicionada, tem um anticorpo marcado com uma substância chamada ouro coloidal que gera um pigmento rosa. 
O antígeno foi colocado na região da amostra, e logicamente já se ligou a esse anticorpo marcado pelo outro coloidal. Por capilaridade essa amostra vai andando e passa por duas regiões: Na região do teste temos o anticorpo contra o mesmo antígeno presente na amostra do paciente. Se ele se liga, vai parar nessa região e o ouro coloidal se concentra naquele local formando uma tirinha rosa. O restante da amostra que passa é um anticorpo contra esse primeiro do próprio teste. Obrigatoriamente, tendo ou não antígeno na amostra do paciente, ele faz com que o outro coloidal se acumule e fique positivo. Falamos que essa segunda tirinha é de controle, de forma que ela tem que aparecer. 
Existem, então, duas situações, a positiva ou a negativa. 
Se por um acaso, ocorrer isso, refaça, de forma que o teste não foi confiável. Se os anticorpos presentes aqui eram para se ligar ao anticorpo que está com o ouro coloidal aqui, independente se tem antígeno ou não, não formou uma “marquinha” indica que o teste não está funcionando.
 
RESUMÃO
É pouco invasivo, de fácil resolução do teste e parte do princípio anticorpo-antígeno (detecta os dois). Se usar no teste o antígeno, o objetivo é verificar se a pessoa tem anticorpo e se usar anticorpo, o objetivo é verificar se a pessoa tem antígeno. Portanto depende do que o teste está procurando. É mais barato e acessível do que os exames moleculares. A primeira metodologia empregada no imunodiagnóstico é a aglutinação (direta, indireta, microaglutinação, teste de Coombs e floculação). A direta/ativa ou indireta/passiva. A direta é quando o antígeno ou anticorpo faz com que a própria célula aglutine. Tem como exemplo a hemoaglutinação, ou seja, aglutinação de hemácias, que possuem hemoaglutininas (antígenos que fazem com que as hemácias aglutinem), como no teste de grupo sanguíneo. Na indireta ou passiva, usa-se partículas tratadas com antígeno ou anticorpo, como o látex, que em contato com o soro do paciente, o látex pode aglutinar (ex: látex tratado com anticorpos anti-PCR. A PCR é uma glicoproteína indicativa de processos inflamatórios. Ao adicionar o látex adsorvido com esses anticorpos à amostra do paciente com PCR, o látex irá aglutinar). Não é contra o látex, mas quem aglutina é ele, por isso é de maneira indireta. Além da PCR, o teste de aglutinação indireta pode ser feito em pesquisa de antígeno no LCR e agentes virais em fezes.
Um único Ac consegue se ligar a duas células/partículas, por isso aglutina, se torna insolúvel. É um teste muito sensível e pouco específico. Pode acontecer reação cruzada (quando um Ac reage de maneira cruzada por outro antígeno diferente). As vantagens são baixo custo, facilidade de execução, elevada sensibilidadee a leitura visual.
A rubéola, o sarampo, a influenza e o enterovírus tem antígenos hemoaglutinante, ou seja, fazem aglutinação de hemácias. Se uma pessoa tiver anticorpos contra esse vírus, o anticorpo vai impedir a aglutinação, isso é a inibição da aglutinação direta. Então se colocar antígeno na amostra e não aglutinar, o teste é positivo (no teste de aglutinação direta, quando aglutina é positivo. É o contrário). TITULAÇÃO
A microaglutinação é um tipo de hemaglutinação indireta. É feito em placas de plástico, que tem 96 pocinhos e é usada para pesquisar anticorpos. Nos poços tem hemácias com antígenos para determinada doença, ao colocar a amostra do paciente, se ele tiver anticorpos, vai aglutinar, formando um “tapete” no poço. Se não houver reação, as hemácias se depositam no fundo, sendo negativo (não tem Ac).
O teste de Coombs é a pesquisa de anticorpos contra antígenos eritrocitários capazes de sensibilizar as hemácias. Existe o teste de Coombs direto e o indireto. O direto é utilizado para anticorpos nas hemácias e o indireto para anticorpos presentes no plasma. No direto, testa, por exemplo, doenças auto-hemolíticas, em que o corpo da pessoa produz certos tipos de anticorpos (autoanticorpos) que aderem aos antígenos das suas hemácias. Para verificar o teste (tanto direto quanto indireto), retira uma amostra de sangue do indivíduo, e injeta o plasma em um animal. Esse animal produzirá anticorpos contra o anticorpo humano, que será o reagente de Coombs (anti-autoanticorpos). A pessoa que possui anemia auto-hemolítica tem em seu sangue os autoanticorpos. Ao retirar esse sangue com autoanticorpos e adicionar anti-autoanticorpos, o reagente, haverá aglutinação, indicando Coombs positivo, então a pessoa possui doença auto-hemolítica. O teste de Coombs indireto analisa os anticorpos livres. Testa, por exemplo, em gestante Rh negativo para saber se ela está produzindo anticorpos contra o Rh positivo (anticorpos anti-Rh), podendo causar eritroblastose fetal. Nesse caso, retira uma amostra de sangue da gestante e adiciona o sangue Rh positivo, caso a mulher tenha anticorpos anti-Rh, eles irão se juntar às hemácias. Após adicionar o reagente de Coombs, que é o anticorpo contra anticorpo humano, haverá aglutinação, então a mulher produziu anticorpos anti-Rh.
Outro método é a floculação, que diferentemente da aglutinação, precisa de microscópio para fazer a leitura. O teste de floculação mais realizado é o VDRL, para sífilis, em que a interação de antígeno com anticorpo diretamente formará imunocomplexos, os flocos. Se flocular é positivo. Sempre que der positivo, deve-se fazer a titulação para ver em qual fase da doença o indivíduo se encontra. A titulação consiste em dividir a amostra na metade, depois na metade de novo, se continuar dando positivo, o resultado é 1 pra 4. Vai diluindo a amostra e vê até quando dá positivo, e mesmo com o tempo, quando a amostra foi sendo diluída e ainda assim tiver antígeno suficiente para gerar positividade, significa que tem muito antígeno. A titulação é boa para indicar a evolução do tratamento, mostrando se a quantidade de antígenos diminuiu.
Além da aglutinação, existe o ensaio lítico, em que verifica positividade na lise das hemácias. Verifica basicamente o sistema complemento. A dosagem de CH50 verifica o funcionamento de dos complementos por qualquer via. Se tiver complemento no sangue do indivíduo, ele vai se ligar nas hemácias e pode haver formação do complexo de ataque à membrana, então tem hemólise. O ensaio lítico verifica se tem ou não tem complemento, se não tiver, não tem hemólise. 
Outro método de ensaio lítico é a fixação do complemento, em que verifica a presença ou ausência de anticorpo ou antígeno, não o complemento. Coloca o antígeno em um tubo, se na amostra adicionada o indivíduo possuir anticorpo, haverá formação de imunocomplexos, ou seja, a cascata do complemento pela via clássica será ativada. Depois, adiciona ao plasma um sistema indicador (hemácia ligada ao Ac ou ao Ag) para fazer reação, se a pessoa for positiva, o sistema complemento já atuou sobre o antígeno e as hemácias ficarão livres da reação. Se for negativo, haverá hemólise, sendo possível identificar a presença e a quantidade de antígeno ou anticorpo. Então se não houver hemólise é porque o paciente tem anticorpos contra aquele antígeno.
Os imunoensaios utilizando conjugados identificam a presença de antígenos ou anticorpos impregnando moléculas marcadas com compostos detectáveis (conjugados), podendo ser imunofluorescência, radioimunoensaio (RIA), ELISA, Western Bloting e imunocromatografia. Na imunofluorescência direta administra-se um anticorpo com a porção Fb emitindo fluorescência. Se a pessoa tiver o antígeno, o anticorpo vai se ligar e será possível ver no microscópio a fluorescência do anticorpo se o resultado for positivo. Após lavar, se não tiver fluorescência é porque não teve antígeno para o anticorpo se ligar. Isso também é feito no teste de pacientes soropositivos, para saber se o TCD4 foi o linfócito afetado. Usa-se um anti-CD4, que deixa fluorescente apenas esses linfócitos. Na indireta é quando fica fluorescente o segundo anticorpo, ou seja, o anticorpo que se ligou ao anticorpo que está ligado ao antígeno causador da doença. RIA é o mesmo princípio, mas além de avaliar a fluorescência, avalia o quanto de radiação a amostra emite. 
 O ELISA faz quantificação do anticorpo, vê o quanto de Ac tem. Nos pocinhos tem antígeno, por exemplo, (pode ter anticorpo se o objetivo é procurar antígeno) contra o que se deseja pesquisar, coloca soro do paciente e se tiver Ac vai ter reação, depois coloca outro Ac contra o Ac humano conjugado a uma enzima, por último coloca um substrato dessa enzima, que ao ser quebrado gera uma coloração. De acordo com a intensidade da cor, a pessoa tem mais ou menos anticorpos. 
O Western blotting é feito para detectar proteínas. Cria-se um campo elétrico com pólos negativo e positivo e as moléculas negativas vão transitando para positivo e vice-versa, ou seja, faz eletroforese do sangue do paciente, separando as proteínas dele. É muito utilizado no teste de HIV, procurando pela proteína p24. Depois de separar as proteínas, coloca Ac contra a proteína pesquisada. O Ac só vai se ligar na fração protéica que interessa, resolvendo o problema da reatividade cruzada do Ac.
A Imunocromatografia é por exemplo o beta-HCG. É uma fita impregnada de Ac, no caso de tentar pesquisar os Ag. Pinga a amostra no local, se a amostra tiver antígeno, ela vai se ligar ao Ac que já está lá correspondente ao antígeno junto com uma substância que gera uma cor. Na listra vai ter acúmulo de Ac e Ag e a cor fica forte. Tem a parte do controle, que sempre dá positividade, é só para ver se está funcionando. Se fixar na linha, fica colorida e é positivo, se fixar só em uma, que é o controle, indica que o teste é negativo.