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CADERNO DE EXERCÍCIOS Objetos Didáticos para o Ensino da Disciplina de Metodologias Bioanalíticas Programa de Iniciação à Docência | UFCSPA 2ª EDIÇÃO 2018 Organizadores Felipe de Almeida Narciso – Biomedicina 2017 João Pedro Nunes Sagini – Biomedicina 2018/I Thalis De Nadai Carvalho – Biomedicina 2018/II Sheila Bünecker Lecke – Professor Responsável 02 Sumário Atividades Àrea 01 - Métodos Ópticos ............................. 04 Atividades Área 02 - Métodos Eletroquímicos ................ 14 Atividades Área 03/I - Métodos Imunoquímicos .............. 20 Atividades Área 03/II - Testes Rápidos e Remotos .......... 24 Gabarito ............................................................................... 27 Bibliografia .......................................................................... 30 03 Área 01 Métodos Ópticos 01. Paciente de 22 anos, sexo masculino, realizou exames para avaliação de imunogloblulinas G e M para sífilis, em soro, após um mínimo de 4h de jejum, em uma unidade laboratorial de hospital da zona norte de Porto Alegre. Após 24h, o laudo foi liberado pelo laboratório, constando resultado positivo para IgG e negativo para IgM. A partir da pesquisa e da leitura de materiais, identifique: A) Amostra analítica: B) Analito(s): C) Matriz biológica: _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 04 Área 01 Métodos Ópticos 02. Foi realizada a quantificação de vitamina B12 de uma amostra de controle externo da qualidade, por diferentes laboratórios cujas metodologias são comparáveis entre si. Os resultados obtidos foram diferentes quando comparados entre si, mas todos muito próximos do valor real. Isso significa, respectivamente, que os resultados possuem: A) Precisão e exatidão. B) Precisão e inexatidão. C) Imprecisão e inexatidão. D) Imprecisão e exatidão. E) Não é possível avaliar os dados. 03. Em relação ao diagrama interno dos equipamentos, em qual há um monocromador de excitação e um monocromador de emissão dentre os componentes do mesmo? A) Luminômetro B) Espectrofotômetro C) Fluorímetro D) Nefelômetro E) Turbidímetro. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 05 Área 01 Métodos Ópticos 04. Associe as colunas: (A) Branco de reação. (B) Espectrofotometria. (C) Linearidade. (D) Limite de detecção. (E) Nefelometria. ( ) Método bioanalítico de espalhamento da radiação. ( ) Método bioanalítico de absorção da radiação. ( ) Solução com reagentes, exceto a amostra. ( ) Valor máximo detectável. ( ) Valor mínimo detectável. ( ) Solução com reagente e amostra, exceto reagente que dispara a reação. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 06 Área 01 Métodos Ópticos 05. Em relação ao funcionamento do equipamento analítico: A) Conceitue ruído analítico. B) Diferencie ruído químico de ruído instrumental (conceitos e exemplos). _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 07 Área 01 Métodos Ópticos 06. Na figura abaixo, identifique a metodologia e os componentes do sistema: Metodologia: A) B) C) D) E) F) G) _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 08 Área 01 Métodos Ópticos 07. Cite exemplos de exames laboratoriais para cada uma das metodologias abaixo: A) Reflectância: B) Luminometria _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 09 Área 01 Métodos Ópticos 08. Analise as afirmações abaixo sobre turbidimetria e nefelometria, assinalando a opção incorreta: A) Na prática laboratorial, a nefelometria pode ser adaptada ao fluorímetro, assim como a turbidimetria pode ser adaptada ao espectrofotômetro. B) O dispersor óptico é um dos componentes do nefelômetro. C) Amostras ictéricas, hemolisadas e/ou lipêmicas podem interferir no princípio de ambos os métodos bioanalíticos. D) A medida da intensidade luminosa refletida pela amostra, submetida à foto-iluminação durante a análise, é realizada por meio da nefelometria, enquanto que a medida da redução na transmissão luminosa é dada através da turbidimetria. E) Na nefelometria o detector não se encontra na trajetória direta da luz transmitida pela foto- iluminação da amostra. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 10 Área 01 Métodos Ópticos 09. O método de luminometria é conhecido por medir a intensidade luminosa de uma amostra (não submetida à foto-iluminação durante a análise), resultante de um evento excitatório, seja ele uma reação bioquímica, eletroquímica ou química. A) Compare a composição instrumental dos luminômetros de eletroquimioluminescência e de quimioluminescência. B) Cite exemplos de agentes quimioluminescentes e eletroquimioluminescentes. C) Cite aplicações da luminometria na prática laboratorial. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 11 Área 01 Métodos Ópticos 10. Para as afirmações verdadeiras coloque “V” e para as afirmações falsas coloque “F”. Quando falsas, justifique-as. A)___A geometria de ângulo reto de alguns métodos fluorimétricos – onde o posicionamento do monocromador de emissão está a 90º em relação ao monocromador de excitação – melhora a linearidade dos mesmos. B)___Na reflectância, a intensidade de luz refletida pela amostra submetida à foto-iluminação é inversamente proporcional à concentração desta amostra. C)___Na chamada “química seca” por cassetes ou microslides, existem camadas internas no dispositivo que filtram interferentes de baixo peso molecular; logo há mais interferentes neste método de reflectância em relação à leitura automatizada de tiras reativas de urinálise por reflectância. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 12 Área 01 Métodos Ópticos 11. O histograma abaixo representa a análiseda progressão do ciclo celular pela quantificação de DNA presente na amostra em três tempos distintos: 0h, 1h e 2h. A emissão de fluorescência está relacionada ao conteúdo de DNA amostral de cada fase do ciclo celular. Assim sendo, o ponto 0h corresponde à fase G1 do ciclo celular; o ponto 1h corresponde à fase G2 do ciclo celular e o ponto 2h indica a progressão normal do ciclo celular. Os gráficos acima foram gerados por um equipamento cuja metodologia bioanalítica conta, examina e classifica partículas microscópicas presentes em um meio líquido, ou seja, mede as características estruturais e funcionais de partículas suspensas em uma amostra. Responda: A) Qual o método bioanalítico supracitado? B) Dê os constituintes do equipamento. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 13 Área 02 Métodos Eletroquímicos 01. O método de impedância mede a resistência dentro de um circuito elétrico. Tal circuito deve ser constituído de eletrodos, de fluído eletrolítico e de corrente elétrica. Há o fluxo de uma corrente elétrica de um eletrodo para o outro. Quando a célula, que está suspensa no fluído eletrolítico, atravessa o orifício com corrente elétrica há a interrupção do circuito, gerando a impedância (pulso). O número de pulsos detectados pelo equipamento representa o número de células existentes em determinada amostra. Mas, o que define a amplitude do pulso no gráfico gerado pelo equipamento? _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 14 Área 02 Métodos Eletroquímicos 02. Baseado na literatura indicada no plano de ensino da disciplina diferencie a amperometria da potenciometria: 03. Dê a constituição do eletrodo de trabalho (cátodo) e do eletrodo de referência (ânodo) em um sensor amperométrico para mensuração de oxigênio molecular: _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 15 Área 02 Métodos Eletroquímicos 04. O método que mede a diferença de potencial entre dois eletrodos imersos em uma célula eletroquímica onde não há fluxo de corrente elétrica é conhecido como potenciometria. O eletrodo de medida, ou seja, o eletrodo de trabalho pode ser metálico ou íon-seletivo (EIS ou ISE). A) Cite os tipos de eletrodos íon seletivos. B) Cite aplicações clínicas da potenciometria por ISE. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 16 Área 02 Métodos Eletroquímicos Utilize o caso abaixo para a realização das questões nº 05, 06 e 07. "Uma pesquisa com neonatos da Unidade de Terapia Intensiva (UTI) do hospital vinculado ao laboratório que você trabalha objetiva determinar a concentração circulante de sódio dos recém-nascidos (RNs)." 05. Para escolha do método de dosagem e de coleta de amostra, os pesquisadores solicitaram sua opinião. Atente que neonatos de UTI geralmente apresentam quadro de hipoalbuminemia. A) Para escolha do método de dosagem e de coleta de amostra, os pesquisadores solicitaram sua opinião. Atente que neonatos de UTI geralmente apresentam quadro de hipoalbuminemia. ( ) ISE Direto. ( ) ISE Indireto. B) Qual a amostra de escolha a ser coletada, considerando-se os pacientes RNs? ( ) Sangue total heparinizado. ( ) Sangue total sem anticoagulante (soro). 06. Justifique suas opções acima. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 17 Área 02 Métodos Eletroquímicos 07. Quanto à potenciometria por ISE direto vs. indireto, responda: A) Qual das metodologias bioanalíticas acima é mais exata? B) Qual das metodologias bioanalíticas acima é mais utilizada na rotina clínica? _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 18 Área 02 Métodos Eletroquímicos 08. O pHmetro de bancada constitui um potenciômetro, composto por dois eletrodos conjugados (um eletrodo indicador e outro de referência). A) Cite quais são as estruturas que constituem um potenciômetro. B) Explique o princípio do método do pHmetro. C) Cite aplicações laboratoriais do pHmetro: _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 19 Área 03/I Métodos Imunoquímicos 01. Acerca das metodologias imunoquímicas aplicadas ao laboratório clínico, qual característica podemos conferir à seguinte definição: “Capacidade de o anticorpo interagir exclusivamente com um único epítopo do componente antigênico proposto à análise. Isto ocorre devido à influência de configurações estruturais do antígeno frente à síntese dos anticorpos.” A) Afinidade. B) Especificidade. C) Sensibilidade. D) Avidez. 02. Acerca das técnicas de ELISA, como podemos classificar o seguinte ensaio: “Imunoensaio cujo analito de interesse é o anticorpo presente na amostra e requer separação entre reagentes marcados ligados e livres, ou seja, possui etapas de lavagem e, consequentemente, uma maior sensibilidade analítica.” A) ELISA direto e heterogêneo. B) ELISA direto e homogêneo. C) ELISA indireto e heterogêneo. D) ELISA indireto e homogêneo. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 20 Área 03/I Métodos Imunoquímicos 03. A figura a seguir refere-se a: A) ELISA indireto competitivo. B) ELISA indireto imunométrico. C) ELISA direto competitivo. D) ELISA direto imunométrico. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 21 Área 03/I Métodos Imunoquímicos 04. Sobre as metodologias imunoquímicas, julgue o item que se segue: “Os ensaios de ELISA permitem medidas quantitativas ou qualitativas a partir da interação Ag-Ac ou Ac-Ag mediada pela atividade enzimática sobre um substrato com a formação de um composto de cor. Esta técnica possui uma alta especificidade analítica, pois os anticorpos não podem reconhecer antígenos mal definidos.” A) Verdadeiro. B) Falso. 05. Sobre as metodologias imunoquímicas aplicadas ao laboratório clínico, como podemos denominar a situação a seguir? “Em uma amostra com níveis muito elevados do analito de interesse, após sua ligação aos anticorpos de captura e de detecção, seu excessoimpede a formação dos complexos, distorcendo o sinal analítico.” A) Anticorpos heterofílicos. B) Efeito gancho. C) Ruído analítico. D) Baixa avidez. _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 22 Área 03/I Métodos Imunoquímicos 06. Associe corretamente as lacunas abaixo, correlacionando imunoensaio, principal marcador e sinal analítico. IMUNOENSAIO A) Enzimático cromógeno. B) Radioisótopo. C) Fluorescente. D) Luminescente. PRINCIPAL MARCADOR ( ) Luminol, Ésteres de acridina, Quelato tris-bipiridil rutênio. ( ) Isotiocianato de fluoresceína, Vermelho de rodamina. ( ) I125, C14, H3. ( ) Fosfatase alcalina, Peroxidase. SINAL ANALÍTICO ( ) Fótons de luz. ( ) Absorbância (λ). ( ) Partículas α β γ (cpm). ( ) Fótons de luz (RLU). _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 23 Área 03/II Testes Rápidos e Remotos 01. A partir da visualização do teste rápido de gravidez abaixo representado, para determinação de gonadotrofina coriônica humana (hCG), responda: A)Assinale a alternativa correta em relação à interpretação dos resultados, considerando ser este um ensaio imunocromatográfico não competitivo: A) 1 – Negativo, 2 – Negativo, 3 – Inválido. B) 1 – Negativo, 2 – Inválido, 3 – Positivo. C) 1 – Inválido, 2 – Positivo, 3 – Negativo. D) 1 – Positivo, 2 – Negativo, 3 – Inválido. E) 1 – Positivo, 2 – Inválido, 3 – Negativo. B)Explique o princípio deste teste rápido: _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 24 Área 03/II Testes Rápidos e Remotos 02. A partir da visualização do teste rápido de droga de abuso abaixo representado, para determinação de tetraidrocanabinol, responda: A)Assinale a alternativa correta em relação à interpretação dos resultados, considerando ser este um ensaio imunocromatográfico competitivo: A) 1 – Negativo, 2 – Inválido. B) 1 – Negativo, 2 – Positivo. C) 1 – Positivo, 2 – Inválido. D) 1 – Positivo, 2 – Negativo. E) 1 – Positivo, 2 – Positivo. B)Explique o princípio deste teste rápido: _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 25 Área 03/II Testes Rápidos e Remotos 03. Diferencie imunocromatografia não competitiva de imunocromatografia competitiva. 04. Caracterize os sistemas Point of Care (POCT). _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ 26 Gabarito Área 01 - Métodos ópticos 01. A) Sangue total. B) IgG e IgM. C) Soro sem os analitos. 02.D. 03.C. 04. E/B/A/C/D/A. 05. A) O ruído analítico é uma resposta instrumental indesejada de característica química ou física, que constitui informação espúria que afeta a sensibilidade analítica e o limite de detecção do sistema analítico. B) O ruído químico é caracterizado por variáveis que afetam o sistema analítico. Exemplos: flutuação na umidade relativa do ar e variações de temperatura. Enquanto que o ruído instrumental está relacionado aos componentes eletrônicos do equipamento analitico. Exemplos: transdutor de entrada, transdutor de saída e fonte. 06. Metodologia: Espectrofotometria. A) Fonte de luz. B) Fenda de entrada. C) Prisma. D) Fenda de saída. E) Cubeta/Cuveta. F) Detector. G) Monocromador. 07. A) EQU, teste rápido para hemoglobina glicada, hemoglicoteste, química seca, exames de bioquímica pelo Reflotron. B) Dosagem de hormônios, marcadores tumorais, marcadores cardíacos e detecção de anticorpos em algumas doenças infecciosas. 08. C. 09. A) Quando comparados, ambos os tipos de luminômetros possuem dentre os componentes dos seus diagramas internos uma célula de amostra, um sistema de injeção de reagentes na célula de amostra e um fotomultiplicador como detector do instrumento. No entanto, há diferenças entre os dois tipos de luminômetro. Há um eletrodo que fica acoplado à célula de amostra e gera uma reação de oxidação- redução no luminômetro eletroquimioluminescente. B) Agentes quimioluminescentes: Éster de acridina, Luciferina, Luminol e Isoluminol. Agentes eletroquimioluminescentes: Quelato tris bipiridil rutênio e Tripropilamina. C) Ensaios imunológicos: sorologia, hormônios; Ensaios com ácidos nucleicos. 10.A) F - A geometria de superfície frontal – onde o posicionamento do monocromador de emissão está a 45º em relação ao monocromador de excitação – melhora a linearidade dos mesmos. B) V. C) F - Na química seca as camadas internas do microslide filtram interferentes de alto peso molecular, logo há menos interferentes neste método de reflectância em relação à leitura automatizada de tiras reativas de urinálise por reflectância. 27 11. A) Citometria de fluxo. B) Fluxo de fluído; Fonte de radiação; Detectores frontal, lateral e de fluorescência; Sistema de amplificação do sinal analítico; Computador para análise do sinal analítico. Área 02 - Métodos Eletroquímicos 01. Tamanho da célula. 02. A amperometria é um processo eletroquímico que mede a diferença de corrente elétrica, quando há variação entre os potenciais elétricos dos eletrodos de referência e de medida, enquanto que a potenciometria é um processo eletroquímico onde se mede a diferença de potencial entre dois eletrodos dentro de uma célula eletroquímica onde não há um fluxo de corrente elétrica. 03. O eletrodo de trabalho (cátodo) é constituído de platina e envolvido por um vidro isolante, enquanto que o eletrodo de referência (ânodo) é constituído por Ag/AgCl. 04. A) Eletrodo de estado sólido (fluoreto); Eletrodo de membrana de vidro; Eletrodo de base líquida ou de membrana polimérica; Eletrodo composto (Ex.: pCO2). B) pH; pCO2; Eletrólitos. 05. A) ISE Direto. B) Sangue total heparinizado. 06. A análise é feita por potenciometria direta devido a aplicabilidade dela sob aparelhos como gasômetros e potenciômetro(AVL, Easylyte) pelos quais há o mensuramento de íons/eletrólitos específicos. Além disso, não há a interferência de proteínas plasmáticas por esta técnica. Quanto à escolha da amostra, utiliza-se sangue total heparinizado, devido ao volume sanguíneo baixo de RNs, ou seja, dependendo da quantidade de sangue coletada poderíamos não ter uma boa disponibilidade (ou quantidade) de amostra que seria necessária para a realização de exames. 07. A) Potenciometria direta por ISE. B) Potenciometria indireta por ISE. 08. A) Voltímetro de alta resistência de entrada; Eletrodo de referência; Eletrodo de medida; Célula eletroquímica; Solução eletrolítica(amostra/padrão). B) O método se baseia em medir o potencial hidrogeniônico da amostra (quantidade de H+) pela diferença do potencial no eletrodo de medida (em contato com a amostra) em relação ao potencial conhecido do eletrodo de referência. C) Medições de pH em: Fluídos corporais; Controle de qualidade de água; Análises bromatológicas; Pesquisas em biotecnologia.Área 03/I - Métodos Imunoquímicos 01. B. 02. C. 03. C. 04. B. 05. B. 06. Principais marcadores: 4/3/2/1. Sinal analítico: 3/1/2/4. 28 Área 03/II - Testes Rápidos e Remotos 01. A) D. B) O hCG presente na amostra liga-se ao conjugado de anticorpo monoclonal, formando um imunocomplexo. Ocorre o arraste da amostra, do imunocomplexo formado e dos demais conjugados de anticorpo monoclonal pela área absorvente da tira reativa. Outro epítopo da molécula de hCG é reconhecido pelos anticorpos anti-hCG presentes na zona teste da tira reativa, formando uma banda colorida. Parte do conjugado de anticorpo monoclonal em arraste será reconhecida pelos anticorpos presentes na zona controle da tira reativa, formando uma segunda banda colorida. Na ausência do analito de interesse na amostra, aparecerá apenas a banda na zona controle da tira reativa, indicando um resultado negativo. 02. A) A. B) O conjugado – formado por uma droga marcada quimicamente com cor – compete com a droga presente na amostra em análise. Ocorre o arraste da amostra e do conjugado pela área absorvente da tira reativa. O conjugado e a droga presente na amostra competem pelos anticorpos anti-droga fixados na zona teste da tira reativa. A presença de banda nesta área indica ausência da droga de interesse na amostra. Parte do conjugado em arraste será reconhecida pelos anticorpos presentes na zona controle da tira reativa, formando uma segunda banda colorida. Na presença do analito de interesse na amostra, não aparecerá banda na zona teste da tira reativa, apenas na zona controle da mesma, indicando um resultado positivo. 03. Na imunocromatografia não competitiva, a presença de banda na zona teste indica um resultado positivo (quanto maior a intensidade do sinal analítico, ou seja, da banda reagente, mais analito de interesse na amostra), enquanto que na imunocromatografia competitiva a ausência de banda na zona teste indica um resultado positivo (ausência do sinal analítico, ou seja, banda reagente, indica a existência do analito de interesse na amostra). Importante ressaltar que em ambos as situações, é necessário o aparecimento de banda na zona controle para validação da tira reativa. 04. Os sistemas Point of Care (POCT), também chamados de testes remotos ou à beira de leito, são conhecidos por sua rapidez em fornecer resultados, auxiliando a tomada de decisão na rotina clínica de urgência e emergência. Geralmente, são equipamentos portáteis, que podem ser utilizados fora do ambiente laboratorial (desde que apresentem rastreabilidade aos processos laboratoriais) e que utilizam um pequeno volume de amostra para a mensuração. No entanto, são testes de screening, ou seja, rastreamento/monitoramento e cujos resultados devem ser confirmados por testes diagnósticos robustos, com uso de amostras controles e melhores parâmetros de desempenho a dos POCT (como, reprodutibilidade e exatidão). Além disso, o operador destes testes remotos deve estar bem treinado e orientado a seguir o passo a passo correto de uso dos mesmos, a fim de garantir a acurácia dos resultados. 29 Referências Bibliográficas BRACHT, Adelar; ISHII-IWAMOTO, Emy L. Métodos de laboratório em bioquímica. Barueri: Manole, 2003. 439 p. BURTIS, Carl A; ASHWOOD, Edward R; BRUNS, David E. Tietz Fundamentos de química clínica e diagnóstico molecular. 7. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2016. Livro eletrônico. ESTRIDGE, Barbara H.; REYNOLDS, Anna P. Técnicas básicas de laboratório clínico. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2011. 800 p. Tradução de: Basic clinical laboratory techniques. HENRY, John B. Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos laboratoriais. 20. ed. Barueri: Manole, 2008. 1734 p. Tradução de: Clinical diagnosis and management by laboratory methods. HOLLER, James; SKOOG, Douglas A.; CROUCH, Stanley R. Princípios de análise instrumental. 6. ed. Porto Alegre: Bookman, 2009. 1055 p. Tradução de: Principles of instrumental analysis. SOARES, José Luiz M. F. (Org.) et al. Métodos diagnósticos: consulta rápida. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2002-2012. 1171 p. VAZ, Adelaide J.; TAKEI, Kioko; BUENO, Ednéia Casagranda. Imunoensaios: fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007-2014. 372 p. XAVIER, Ricardo M; ALBUQUERQUE, Galton de C; BARROS, Elvino. Laboratório na prática clínica: consulta rápida. Porto Alegre: Artmed, 2011. 928 p. 30