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As células são pequenas e complexas, o que torna difícil ver suas estruturas, 
descobrir sua composição molecular e, mais difícil ainda, encontrar funções para seus vários 
componentes. O que podemos aprender sobre as células depende dos instrumentos que 
dispomos e dos enormes avanços na biologia celular surgidos, devido à introdução de novas 
técnicas. Entre essas, incluem-se as diversas técnicas de citoquímica, histoquímica, 
imunocitoquímica, auto-radiografia, hibridação in situ, entre outras, que permitem a 
localização ao microscópio de luz ou eletrônico, de componentes químicos específicos que 
compõe as células e tecidos. Essas técnicas baseiam-se em reações químicas 
desenvolvidas entre a substância pesquisada e o reagente utilizado, que resulta numa 
resposta colorida. 
 
1. Citoquímica 
 A citoquímica é uma área da biologia celular e estrutural dedicada aos estudos dos 
métodos de coloração dos tecidos e dos constituintes celulares ou subcelulares, 
preocupando-se não somente com os princípios químicos das reações de coloração, mas 
também com os procedimentos protocolares para obtenção de preparados a serem 
avaliados ao microscópio. Muitos são os elementos que podem ser visualizados por essas 
técnicas. Dentre eles, podemos citar, os ácidos nucléicos, os polissacarídeos, os lipídios, as 
proteínas, alguns íons e enzimas. 
 Para que essa técnica tenha sucesso são necessários que sejam cumpridos alguns 
princípios básicos: 
 
• o produto a ser pesquisado deve ser insolúvel, o que evita a sua difusão para outras 
regiões das células e dos tecidos; 
• é indispensável que o produto da reação apresente cor ou, pelo menos, apresente-se 
na forma de um precipitado insolúvel no local da reação; 
• a reação colorida desenvolvida deve ser específica, isto é, só deve ocorrer com o 
composto pesquisado; 
• a reação também deve ser sensível para detectar quantidades muito pequenas do 
produto colorido formado. 
 
Métodos de estudo da célula: Técnicas para a localização de 
componentes químicos nas células e tecidos. 
O sucesso de uma reação depende ainda dos passos anteriores à coloração. A coleta do 
material, a fixação e os fixadores usados e os agentes desidratantes são fatores que 
influenciam sobre a reação citoquímica (Figura 1). 
 Pode-se, definir as reações citoquímicas em 3 tipos diferentes, dependendo da 
natureza da reação química envolvida: (a) por ligações eletrostáticas; (b) por ligações 
covalentes; (c) por interações hidrofóbicas. 
 
 
Figura 1 – Cortes histológicos preparados com fixadores diferentes e submetidos a 
mesma reação citoquímica Método do fast green pH 8,1. (a) fixação com formalina e (b) 
fixação com etanol: ácido acético (3:1). Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel, 2001 
 
 
(a) Reações citoquímicas mediadas por ligações eletrostáticas 
 
Neste caso, um corante ionizado em uma solução reage com um substrato de carga 
iônica oposta. Assim, podemos enumerar dois fenômenos citoquímicos: acidofilia e basofilia. 
Entende-se por acidofilia como o fenômeno citoquímico no qual um substrato 
carregado positivamente, chamado de substrato catiônico, reage eletrostaticamente com um 
corante carregado negativamente, dito aniônico (Figura 2). Por ligação iônica, esses dois 
elementos reagem e formam um composto colorido, evidenciado ao microscópio de luz 
(Figura 3). Como exemplos de corantes aniônicos têm-se o xylidine ponceau, o Sirius Red, o 
Fast Green e a eosina. 
Já no fenômeno da basofilia, o substrato carregado negativamente chamado de 
substrato aniônico, reage eletrostaticamente com um corante carregado positivamente, dito 
catiônico (Figura 2). Como exemplo de corantes catiônicos pode-se citar os corantes Azul de 
Toluidina, Azul de metileno e o Azul de Alcien (Figura 4). A hematoxilina, embora não seja 
um corante, pode ser considerada um complexo de corantes que comportam-se como 
corante catiônico. Esses corantes reagem com os elementos ionizáveis nos tecidos que 
apresentam cargas negativas, os grupamentos aniônicos. 
 
 Substrato carregado positivamente 
 
 Substrato carregado negativamente 
 
Figura 2 – Fenômenos da acidofilia e basofilia em citoquímica. 
 
 
 
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 
Acidofilia 
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 
Basofilia 
 
- 
Corante negativo 
 
+ 
Corante positivo 
 
Figura 3 – Exemplo de Acidofilia. Cartilagem hialina corada pelo Xilydine Ponceau 
em pH 2,5. Na região pericondral (p) existe um acúmulo de fibras colágenas. Fonte: 
Carvalho e Recco-Pimentel, 2001. 
 
 
Figura 4 – Exemplo de Basofilia. Corte de testículo corado com azul de toluidina pH 
4,0. Observa-se núcleos imaturos (i) com maior disponibilidade de grupamentos fosfatos 
(substrato -), fortemente corados, e núcleos maduros (m) com menor disponibilidade de 
grupos fosfato, com coloração esverdeada. Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel, 2001. 
 
(b) Reações citoquímicas mediadas por ligações covalentes 
 
Nessas técnicas, a interação entre os corantes e as substâncias pesquisadas é feita 
por ligações covalentes. Embora, não se tenha ainda descrito o princípio exato dessas 
reações, essas técnicas são muito difundidas e utilizadas na histopatologia e na pesquisa 
científica na área de biologia celular e tecidual. Os exemplos mais clássicos das reações 
citoquímicas mediadas por ligações covalentes são a reação de Feulgen, para DNA e o teste 
do Ácido Periódico Schiff (PAS), para polissacarídeos neutros. Ambas as reações são 
obtidas a partir de um mesmo reagente chamado de Reativo de Schiff, que consiste num 
leucoderivado do corante Fucsina Básica. 
 
b.1 REAÇÃO DE FEULGEN PARA EVIDENCIAR DNA: 
 
A reação de Feulgen utiliza como pré-tratamento do material uma hidrólise ácida com 
ácido clorídrico (HCl). Essa hidrólise remove da molécula de DNA as bases púricas, adenina 
e guanina, processo chamado de depurinação do DNA, que consequentemente abre o anel 
liberando grupos aldeídos. No tratamento com o reativo de Schiff ocorre a reação radicais 
aldeídos-reativo de Schiff promovendo uma coloração rósea ou magenta ou bonina (Figura 
5). 
 
Figura 5 – Corte de Células do epitélio da próstata humana corados com reativo de Schiff. 
Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel, 2001. 
 
b.2 REAÇÃO DE PAS PARA EVIDENCIAR POLISSACARÍDEOS: 
 
O teste de PAS é muito utilizado para avaliações citoquímica de polissacarídeos 
neutros, como o glicogênio, o amido e a celulose. Ele utiliza como pré-tratamento do material 
o ácido periódico (HIO4). Esse ácido oxida os grupos hidroxila livres em dois átomos de 
carbono adjacentes (grupos glicólicos, chamados de vic-glicol ou amino glicol, dependendo 
do tipo de carboidrato), produzindo radicais aldeídos, ou seja, há quebra da ligação entre os 
carbonos e conversão à aldeído. Os radicais aldeídos reagem com o reativo de Schiff 
promovendo uma coloração rósea ou magenta ou bonina. 
Na técnica de PAS, como vários carboidratos respondem positivamente à reação de 
PAS, podemos utilizar reações complementares para se fazer a distinção entre eles. Por 
exemplo, a distinção entre o glicogênio e as glicoproteínas é feita, nas células animais, 
submetendo-se o material a tratamento enzimático pela amilase (enzima que digere 
glicogênio e amido). Assim, as estruturas que não se coram com PAS, após digestão prévia 
com amilase, contêm glicogênio (Figura 6a), enquanto as que se coram com PAS, após 
tratamento com amilase, contêm glicoproteínas (Figura 6b e 6c). A distinção entre 
glicoproteínas neutras e glicoproteínas ácidas e de outros glicoconjugados é feita 
associando-se à técnica PAS com a técnica de Alcien Blue (azul de Alcien). A positividade 
ao Alcien Blue é indicada pelo aparecimentode componente corado de cor azul celeste. O 
Alcien Blue, quando preparado em diferentes pHs, marca componentes celulares ditintos: no 
pH 0,5 evidencia glicoconjugados ácidos sulfatados e no pH 2,5 glicoconjugados ácidos 
sulfatados, glicoconjugados ácidos carboxilados e glicoproteínas ácidas. 
 
 Figura 6 – Preparações histológicas submetidas ao teste de PAS. (a) Corte de fígado 
mostrando os hepatócitos com glicogênio na periferia do citoplasma (seta); (b) corte do 
intestino com células caliciformes (C) com glicoproteínas PAS positivas; (c) PAS positivo na 
membrana basal do epitélio devido a grande quantidade de glicoproteínas. Fonte: Carvalho e 
Recco-Pimentel, 2001. 
Vale ressaltar que a técnica de Feulgen é semelhante à do PAS, ou seja, ambas 
utilizam o reativo de Schiff, após exposição dos radicais adeídos. A diferença é que na 
técnica do PAS usa-se o ácido periódico enquanto na de Feulgen usa-se o ácido clorídrico 
para quebrar as moléculas pesquisadas. 
 
(c) Reações citoquímicas mediadas por interações hidrofóbicas 
 
Essas reações são específicas para lipídios não polares, como, por exemplo, os 
triglicerídeos e derivados de colesterol. Essas colorações partem do princípio que os lipídios 
não polares são altamente hidrofóbicos, portanto esses corantes interagem com os lipídios 
hidrofobicamente. Dentre os corantes específicos para os lipídios, podemos citar o Sudan 
Black, o Sudan III, e o Azul de Nilo. Os métodos para evidenciar lipídios requerem fixação 
em formol ou cortes por congelamento. Apenas os fosfolipídios podem ser evidenciados em 
cortes de parafina, pois resistem ao tratamento com álcool, xilol e a própria inclusão em 
parafina. 
 
1.1 Citoquímica enzimática 
 
 Os estudos citoquímicos de enzimas baseiam-se, principalmente, na possibilidade de 
averiguar in situ a atividade das memas. Para isso, são necessários alguns pré-requesitos, 
tais como: a preservação da integridade molecular da enzima, com fixações brandas e/ou 
por meio de cortes por congelamento. Em linhas gerais, a técnica consiste em proporcionar 
um ambiente de incubação (geralmente de 37ºC), onde se coloca o fragmento de tecido ou 
corte histológico a ser estudado juntamente com o substrato da enzima que se quer 
investigar. Após a incubação, a atividade da enzima resulta em um precipitado insolúvel, de 
cor conhecida, que será observado ao microscópio (Figuras 7 e 8). Podem ser avaliadas as 
atividades de fosfatases alcalinas e ácidas, peroxidases, algumas enzimas mitocondriais 
entre outras. 
 
Figura 7 – Mecanismo de Reação da Citoquímica enzimática. A enzima hidroliza o 
substrato, formando 2 substâncias. A substância 2 reage com o composto 1 , reduzindo-o a 
uma terceira substância que combina-se com o Composto 2 formando o cromóforo. 
 
Figura 8 – Glândula salivar de larva de drosófila submetida a reação citoquímica para 
detecção de atividade de fosfatase alcalina, que se mostra altamente positiva na região da 
membrana plasmática (seta). Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel, 2001. 
 
1.2 Citoquímica ultra-estrutural 
 
 No microscópio eletrônico, a imagem não se forma por feixes luminosos e, portanto, a 
visualização dos elementos não é conseguida por cores, mas por meio de diferenças de 
contraste em preto, dito elétron-denso, e branco, dito elétron-lúcido (Figura 9). 
 Esse contraste é obtido pelo tratamento do material estudado com sais de metais 
pesados para que esses possam interagir com os elétrons, possibilitando a formação da 
imagem. A quantidade de sais impregnados nos diversos constituintes celulares é 
diretamente proporcional ao contraste. O princípio da detecção ultra-estrutural de atividade 
enzimática é o mesmo preconizado para a citoquímica enzimática em microscópio de luz. A 
diferença fundamental reside em se obter um produto de reação elétron-denso e não 
simplesmente colorido. 
 
 Figura 9 – Reações citoquímicas para avaliação seletiva de estruturas celulares e de 
atividades enzimáticas ao microscópio eletrônico. (a) Citoquímica ultra-estrutural para 
evidenciação de endomembranas. (b) Atividade da enzima fosfatase-ácida em células 
epiteliais de túbulo de Malpighi. (c) Atividade de enzima ATPase em regiões organizadoras 
do nucléolo de células epiteliais de túbulo de Malpighi. Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel, 
2001. 
 
2. Imunocitoquímica 
 
 A imunocitoquímica utiliza a especificidade dos anticorpos na localização de 
moléculas ou de regiões de moléculas nas células e tecidos. A imunocitoquímica consiste 
em uma excelente ferramenta para estudos celulares, por garantir grande especificidade, 
associado à identificação das relações estruturais entre a molécula de interesse e outros 
componentes e/ou compartimentos celulares. A visualização dos anticorpos depende do 
acoplamento desses com marcadores detectáveis que permitam a sua localização, uma vez 
que tenham se ligado ao antígeno específico. Quando o anticorpo primário que detecta o 
antígeno de interesse é marcado com um marcador qualquer, o processo é chamado de 
imunocitoquímica direta (Figura 10). 
 
 
 
 Antígeno Anticorpo 
 
Figura 10 – Esquema ilustrando o procedimento de imunocitoquímica direta. Nesta 
técnica, utilizam-se anticorpos que se ligam ao antígeno e são localizados por uma sonda 
acoplada diretamente ao anticorpo. 
 
 Entretanto, o acoplamento do marcador ao anticorpo pode ocorrer numa região da 
molécula do anticorpo que seja importante no reconhecimento do antígeno, de modo a 
reduzir o número de anticorpos disponíveis na preparação. Dessa forma, a estratégia 
comumente utilizada para contornar este problema é utilizar um segundo anticorpo 
(anticorpo secundário), este sim, acoplado a um marcador, procedimento denominado 
imunocitoquímica indireta (Figura 11). 
 
 
Figura 11 – Esquema ilustrando o procedimento de imunocitoquímica indireta. Neste 
caso, após ligação do anticorpo primário ao antígeno, utiliza-se um segundo anticorpo 
acoplado à sonda escolhida. A ligação de várias moléculas do anticorpo secundário ao 
anticorpo primário, resulta em ampliação do sinal, o que favorece a identificação de 
antígenos encontrados em baixa concentração. 
 
+ 
+ 
Antígeno Anticorpo primário 
Anticorpo secundário 
 A imunocitoquímica indireta possibilita também uma amplificação do sinal obtido, pois 
a cada anticorpo primário, podem se ligar vários anticorpos secundários. 
 Quando o composto utilizado na marcação do anticorpo é um fluorocromo, o 
procedimento recebe às vezes a designação de imunofluorescência. Além da necessidade 
da utilização de um microscópio de fluorescência para a observação das reações obtidas 
com o uso de sondas fluorescentes, o material obtido tem vida limitada, uma vez que a 
fluorescência se perde. Estas dificuldades podem ser superadas, ao menos em parte pelo 
uso de enzimas como marcadores, na localização dos anticorpos. Usualmente, utiliza-se a 
peroxidase, e o procedimento recebe, algumas vezes, a denominação imunoperoxidase. 
 Um exemplo de imunofluorescência é o ensaio TUNEL (Marcação de corte na 
extremidade com d-UTP mediada por transferase de deoxinucleotídeo terminal) baseia-se na 
ocorrência de quebras nas fitas do DNA (strand breaks) Esses eventos de quebra, 
juntamente com a fragmentação do DNA é um dos mecanismos iniciais e diagnósticos de 
morte celular programada. Na presença da enzima transferase de deoxinucleotídeo terminal 
é possível adicionar nestes cortes nucleotídeos (dNTP) ou seja nucleotídeos sem o OH livre 
na extremidade 3` o que impede que a reação de polimeração do DNA se prolongue. A 
marcação desses nucleotídeos com moléculas fluorescentes torna possível a sua detecção 
por citometria de fluxo ou por microscopia fluorescente. Os núcleos positivos para a 
reação de TUNEL são visualizados no microscópiocomo sinais verde, quando o 
fluorocromo utilizado é o FITC, fluoresceína ou Alexa Flúor, que são os mais 
utilizados nos protocolos de marcação direta (Figura 12). 
 
 
Figura 12 – Morte celular em Hordeum vulgare. Núcleos positivos para fluoresceína-
dUTP no ensaio de TUNEL (diagnóstico de morte celular programada). Barra = 20µm. 
 
 
3. Auto-radiografia 
 
A auto-radiografia é empregada quando deseja-se acompanhar fenômenos celulares. 
Fenômenos como a secreção celular, a síntese de RNA e de DNA e a síntese protéica foram 
elucidados por este método. O procedimento consiste em utilizar pequenas moléculas 
precursoras marcadas com isótopos radioativos e colocadas em contato com o material a ser 
estudado. Quando deseja-se, por exemplo, estudar o processo de síntese de DNA e RNA 
pode-se usar a H3-timidina e a H3-uridina, precursores que participam da síntese do DNA e 
do RNA respectivamente. Uma vez incorporada a radioatividade pela célula, as mesmas são 
fixadas em intervalos sucessivos e subsequentemente coradas. Os cortes são submetidos a 
uma emulsão igual a um filme fotográfico comum. A radioatividade marca essa emulsão e 
deste modo conseguimos localizar a molécula que desejamos marcar na célula (Figura 13). 
 
 
Figura 13 – Utilização de um aminoácido radioativo que é incorporado na insulina. 
Observa-se a passagem da insulina do RER para o Golgi (estruturas mais eletrodensas). 
 
4. Hibridação in situ 
 
 A hibridação in situ é uma metodologia utilizada para a localização de sequências 
definidas de ácidos nucléicos, em preparações celulares, através de hibridação de 
sequências complementares denominadas sondas. Este método foi descrito por Pardue e 
Gall (1969) e permite a detecção de sequências específicas de DNA/RNA em cromossomos 
metafásicos, bem como em núcleos interfásicos. 
 A técnica de hibridação in situ baseia-se no princípio de construir uma sonda 
(sequência curta de nucleotídeos) que seja complementar a uma região de uma molécula de 
DNA ou RNA que se deseja localizar. Essa sonda é marcada geralmente com um corante 
fluorescente e deste modo propicia a sua localização quando hibridizada à sua sequência 
complementar (Figura 14). Como exemplo, quando se deseja localizar um determinado 
gene nos cromossomos humanos, construói-se uma sonda complementar a sequência 
desse gene e marca-a com um corante fluorescente, sendo possível localizar em qual dos 23 
cromossomos humanos esse gene se localiza. 
 
Lâmina com os cromossomos humanos 
 
 
Construção de uma sonda marcada para a sequência do gene. 
 ...TAGCGACTGCAAATGCAT... 
 
A hibridação sonda/DNA permite a localização nos cromossomos do gene estudado. 
 
Figura 14 – Técnica de hibridação in situ. 
 
 Essas técnicas permitem a localização de DNA ou RNA em células eucarióticas, além 
de permitir detectar RNA ou DNA viral. 
 
...ATCGCTGACGTTTACGTA... 
Sequência do gene que se 
deseja detectar 
...ATCGCTGACGTTTACGTA... 
...TAGCGACTGCAAATGCAT
5. Fracionamento Celular 
 Todas essas técnicas em conjunto, descritas até aqui, dependem da obtenção de 
cortes histológicos, mas em alguns casos, há a necessidade de obtenção de células isoladas 
de tecidos ou mesmo da obtenção de organelas isoladas. 
O fracionamento celular consiste na homogeneização ou destruição das células por 
meio de diferentes procedimentos mecânicos ou químico, os quais rompem as membranas 
plasmáticas e separam as frações subcelulares de acordo com sua massa, superfície e peso 
específicos. Diversos métodos de fracionamento celular são utilizados, a maioria está 
baseada em um conjunto de procedimentos que inclui a separação de estruturas celulares 
por centrifugação de homogeneizados. 
 A centrifugação diferencial é o método mais empregado para separar organelas. 
Este método baseia-se nas diferenças de velocidade com que as estruturas sedimentam-se 
no fundo do tubo de centrifugação, podendo-se assim isolar, por exemplo, mitocôndrias, 
cloroplastos, ribossomos, e estudá-las separadamente (Figura 17). 
Uma outra técnica para estudar os componentes celulares separadamente é a 
microdissecção celular, que permite o isolamento de células com a utilização de um laser 
(Figura 15). A separação de células em suspensão pode ser feita pela utilização de 
aparelhos como o citômetro de fluxo (Figura 16), no qual as células fluem enfileiradas 
através de um tubo delgado. As células são selecionadas e separadas de acordo com a 
fluorescência que emitem. O fluorocromo é acoplado aos diferentes tipos celulares por 
anticorpos específicos. 
 
 
Figura 15 – Técnica de microdissecção. Tecido contendo tumor é submetido ao corte 
a laser na região do tumor. Posteriormente um segundo laser é usado, selecionando a região 
que é colocada em um tubo para centrifugação e separação dos componentes celulares. 
 
Figura 16 – Isolamento de células em suspensão. A suspensão de células com diferentes 
componentes marcados com fluorocromos é colocada no citômetro de fluxo. As células a 
suspensão passam através de um tubo delgado. Um laser detecta o sinal de cada partícula 
que passa no tubo, separando-as pelas diferentes emissões. Posteriormente cada 
componente detectado é coletado separadamente. 
 
 
Figura 17 – Etapas da técnica de centrifugação diferencial. Um fragmento de fígado é 
homogeneizado em solução de sacarose. Em seguida é submetido a uma série de 
centrifugações de força centrífuga crescente (lado esquerdo da figura): Tubo 1- 1.000G por 
20min; Tubo 2- 10.000G por 20min; Tubo 3- 105.000G por 120min; Tubo 4- 105.000G por 
20min. No lado direito, estão ilustradas as diversas sub-frações celulares. 
 
Bibliografia Consultada 
 
BROWN, R.C.; LEMMON, B.E. Methods in Plant Immunolight Microscopy. In: Methods in 
Cell Biology - Part A. (Galbraith D; Bourque, D; Bohnert, H). Vol 49.1995 
 
CARVALHO, Hernandes F.; RECCO-PIMENTEL, Shirlei M. (Ed.). A célula 2001. Barueri, SP: 
Manole. 2001, 287 p. 
 
DE ROBERTIS, Eduardo D. P.; HIB, José. De Robertis bases da biologia celular e molecular. 
3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2001, 418 p. 
 
MELO, R. C. N. Células & Microscopia: princípios básicos e práticas. Juíza de Fora: Ed 
UFJF. 2002, 144.