Relatório de Coloração de Gram (1)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECÔNCAVO DA BAHIA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS, AMBIENTAIS E BIOLÓGICAS
	
	
	
Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas
	
RELATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
(COLORAÇÃO DE GRAM)
Guilherme de Jesus Oliveira
Josef Talson Teixeira Araujo
Luana Raposo
Paula Beatriz Vieira de Souza
Tamerson Bispo
Cruz das Almas - Bahia - Brasil
2019
	UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECÔNCAVO DA BAHIA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS, AMBIENTAIS E BIOLÓGICAS
	Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas
RELATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
(COLORAÇÃO DE GRAM)
Orientador: Maria Gardenny Ribeiro Pimenta
Cruz das Almas - Bahia - Brasil
2019
INTRODUÇÃO
A maioria das observações inicias dos microrganismos é feita por meio de preparações coradas. Coloração significa simplesmente corar os microrganismos com um corante que enfatize certas estruturas. Porém, antes que os microrganismos possam ser corados, devem ser fixados (aderidos) à lamina do microscópio. 
Ao contrário das colorações simples, as colorações diferenciais reagem de modo distinto com deferentes tipos de bactérias, podendo assim ser usadas para diferenciá-las. As colorações diferenciais mais frequentemente utilizadas para bactérias são a coloração álcool-ácido resistente e a coloração de Gram – trabalhadas nesta prática –, que são um dos procedimentos de coloração de mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas. Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo distinto à coloração de Gram, pois diferenças estruturais em suas paredes celulares afetam a retenção ou a liberação de uma combinação de cristal violeta e iodo, denominada complexo cristal violeta-iodo (CV-I). 
Além disso, o corante púrpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bactéria, corando-a de violeta escuro ou púrpura. As bactérias que retêm essa cor após a tentativa de descolori-las com álcool são classificadas como gram-positivas; as bactérias que perdem a cor violeta escuro ou púrpura após a descoloração são classificadas como gram-negativas. Como as bactérias gram-negativas são incolores, após a lavagem com álcool, elas não são mais visíveis. É por isso que o corante básico safranina é aplicado – ele cora as bactérias gram-negativas de rosa. 
Enfim, o método qual aprendemos nesta quarta aula prática da disciplina de Microbiologia Geral - CCA025 é uma das mais importantes técnicas de coloração nesta área da biologia, sendo assim, é de extrema importância na aquisição dos conhecimentos procedimentais da disciplina.
OBJETIVOS
Aprender e realizar a técnica de esfregaço de bactérias e Coloração de Gram;
Identificar e diferenciar a parede celular das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas; 
Observar a morfologia individual e de agrupamentos diante a coloração da reação da célula;
MATERIAIS E MÉTODOS
Foi realizada no dia 22 de Abril de 2019, na Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, no laboratório de Microbiologia, a aula prática sobre a Coloração de Gram aplicada pela professora Gardenny Pimenta. Nessa pratica foi apresentada os diferentes tipos de coloração de Gram (simples, diferencial e especial), a composição da parede celular das células Gram-positivas e Gram-negativas, e como realizar a diferenciação entre elas através da coloração de gram. 
Os materiais ultilizados nesta prática foram:
Lâminas;
Alça de platina;
Pipeta de Pasteur; 
Suporte para lâminas;
Recipiente para descarte; 
Estante para tubo de ensaio; 
Luvas; 
Lápis; 
Água destilada;
Cultura em ágar inclinado;
Reagentes: Cristal Violeta, Lugol, Safranina ou Fucsina básica e Álcool-acetona;
Solução Salina 0,85 % estéril; 
Álcool 70%; 
Bico de Bunsen ou lâmpada de álcool; 
Óleo de imersão;
Solução de limpeza das objetivas; 
Gaze para limpeza das objetivas;
Papel toalha; 
Microscópio óptico;
A aula foi dividida em três partes, a primeira foi o preparo das lâminas, a segunda foi a coloração do material e a terceira foi a observação das laminas prontas em microscópio óptico. Inicialmente fomos orientados a preparar 02 lâminas, e todas as lâminas foram limpas com papel toalha e devidamente identificadas com os seus componentes e data de preparo antes de iniciar o procedimento.
As duas lâminas foram preparadas juntamente pelo fato de serem compostas pelo mesmo material. Com o auxílio de uma pipeta de Pasteur foram pipetadas 01 gota de solução salina em cada uma das lâminas; Em seguida a chama da lamparina foi acesa, e as bordas da placa de petri que continha o material a ser utilizado (bactérias – Serratia) foi flambada antes de ser aberta para a utilização, e a alça de inoculação também foi aquecida para esterilização; A placa de petri foi aberta e com o auxílio da alça de inoculação ainda quente, o material foi retirado e posto nas laminas. Com o material nas laminas foi realizado a técnica do esfregaço, e em seguida as laminas também foram flambadas na chama da lamparina e postas para secar sobre uma folha de papel toalha. 
A segunda parte desta prática foi a coloração de Gram, onde o esfregaço feito em cada uma das laminas foi coberto por completo com algumas gotas de cristal violeta (corante), e posto em descanso durante 01 minuto. Em seguida o excesso do corante foi retirado das laminas com pequenos jatos de água destilada; as laminas foram inclinadas sobre o papel toalha para que o excesso de água destilada escorresse e em seguida foi adicionada algumas gotas de Lugol (mordente) sobre as laminas, que descansaram novamente por 01 minuto. Feito isso, o excesso do lugol foi retirado com pequenos jatos de álcool 95%, e as laminas foram novamente inclinadas sobre o papel toalha para que o excesso de álcool escorresse. E por último, as laminas foram coradas com algumas gotas de Fucsina (contra-corante) e postas em repouso durante 30 segundos; Em seguida o excesso do corante foi retirado com pequenos jatos de água destilada, e as laminas foram postas para escorrer em papel toalha.
Depois de secas e finalizadas as laminas foram posicionadas no microscópio óptico para observação. Inicialmente as lentes objetivas foram limpas com gase e éter, e foi posto o óleo de imersão nas laminas feitas para a observação na objetiva de 100x. 
RESULTADOS
Ao realizar o procedimento de coloração de Gram foi possível observar a diferença de cores que as bactérias apresentaram por conta da diferença de propriedades químicas e físicas da parede celular. 
As bactérias Gram-positivas apresentam uma camada mais espessa de peptideoglicano em sua parede celular (90%), tornando possível a retenção do corante (cristal violeta) e apresentando a coloração roxa após a realização do procedimento.
Já as bactérias Gram-negativas apresentam uma camada mais fina de peptideoglicano em sua parede celular (10%), não podendo então reter o corante (cristal violeta) durante o processo, apresentando ao fim do procedimento a coloração rosa. 
As duas laminas preparadas pela equipe apresentaram coloração rosa ao fim da realização do procedimento, demonstrando então que a Serratia (material utilizado) é uma bactéria Gram-negativa.
 
Laminas 1 e 2 – Bactéria Serratia; Gram-negativa; Em forma de Bacilos; 
CONCLUSÃO
A coloração de Gram possibilita a diferenciação das bactérias do tipo Gram positivas das do tipo Gram negativas, através de diversidades de coloração entre as mesmas. A partir dos resultados apresentados, observou-se que a bactéria Serratia, é do tipo Gram negativa, pois apresentou coloração rosa, na prática da coloração de Gram também é possível observar a morfologia da bactéria, no caso da Serratia, sua morfologia é bacilar. A coloração não determina a espécie da bactéria.
Portanto, as técnicas de coloração tornam mais eficientes a visualização microscópica das amostras analisadas, assim como uma melhor identificação da mesma.
REFERÊNCIAS
TORTORA,G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, CL. Microbiologia. 10. ed., Porto Alegre: Artmed, 2012.
Disponível em: < https://kasvi.com.br/bacteria-gram-positiva-gram-negativa/ >
ANEXOS
4.1. Qual a importância da coloração de Gram para a Microbiologia? 
R: O método de Gram é um dos procedimentos de coloração dentro da microbiologia mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas. Além disso, a reação de Gram pode fornecer informações valiosas para o tratamento da doença. As bactérias gram-positivas tendem a ser mortas mais facilmente por penicilinas e cefalosporinas. As bactérias gram-negativas geralmente são mais resistentes porque os antibióticos não podem penetrar a camada de lipopolissacarídeo. 
4.2. Explique o procedimento e a finalidade da fixação de um esfregaço bacteriano.
R: O método do esfregaço bacteriano fixado pelo calor com os com os reagentes, ( Cristal Violeta, Lugol, Fucsina básica, Álcool + acetona), as bactérias adquirem coloração diferentes de acordo com sua classificação entre Gram positiva e Gram negativa, as bactérias que adiquirem coloração azul são as Gram positivas e as que adiquirem coloração avermelhada são as Gram Negativas.
4.3. Diferencia a parede celular de uma bactéria Gram-positiva de uma Gram-negativa.
 R: A parede celular da bactéria Gram-positiva é composta por 90% de peptildoglicano, e menos complexa, já a Gram-negativa tem aproximadamente 10% de peptildoglicano, e é constituída por outras estruturas. No processo de coloração as bactérias Gram-positivas retêm o cristal violeta devido à presença de uma espessa camada de peptideoglicano (polímero constituído por açúcares e aminoácidos que originam uma espécie de malha na região exterior à membrana celular das bactérias) em suas paredes celulares, apresentando-se na cor roxa. Já as bactérias Gram-negativas possuem uma parede de peptideoglicano mais fina que não retém o cristal violeta durante o processo de descoloração e recebem a cor vermelha no processo de coloração final.
4.4. Descreva a técnica de coloração de Gram. 
R: A coloração envolve três etapas principais:
1-  Coloração com Cristal Violeta (um corante solúvel em água, roxo);
2-  A descoloração (utilizando etanol+acetona);
3-  A contra-coloração (utilizando corante Fucsina, vermelho).
4.5. Discorra sobre os tipos de colorações.
R: Coloração simples utiliza apenas um tipo de corante e é mais utilizado para evidenciar estruturas.
Coloração diferencial é utilizada vários corantes, um jogo de corantes para diferenciar uma bactéria Gram Positiva de uma bactéria Gram Negativa.
Coloração especial, é utilizada para demarcar estruturas específicas.