Eletroforese e Cromatografia

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Técnicas de separação de Amostras 
Eletroforese 
Fornece pelo menos 2 informações importantes: 
1) O tamanho e/ou peso molecular da 
molécula, fragmento ou proteína (pela 
distancia percorrida – deslocamento) 
2) A quantidade da molécula, fragmento ou 
proteína (pelo volume da banda) 
Eletroforese 
• Técnica de separação de partículas de acordo com sua carga elétrica e peso molecular. 
 
• Permite a separação de frações de moléculas orgânicas como RNA, DNA, proteínas e 
enzimas, pela migração destas em um gel durante a aplicação de um potencial elétrico. 
 
• Na técnica, utiliza-se um cuba com dois compartimentos separados. Os eletrodos 
determinam os polos positivo e negativo em cada compartimento. 
 
• Neles, coloca-se uma solução salina que conduz eletricidade. 
 
• Entre os compartimentos, ajusta-se o gel que deve ficar submerso. 
 
• As amostras são acondicionadas em pequenos poços de um gel (feitos com um pente 
durante a sua preparação) e submetidas a uma voltagem (campo elétrico). 
 
• Moléculas de menor peso molecular (PM) terão mais facilidade de migrar pelo gel 
(percorrem uma distância maior em direção ao polo positivo; banda + próxima do polo 
positivo) do que as de  PM. 
 
• O tamanho da banda indica a quantidade do fragmento/molécula, enquanto a distância 
percorrida indica o PM da substância 
 
• Existem vários tipos de géis: os mais comuns são de poliacrilamida e gel de agarose 
 
• Em qualquer um dos géis, a eficácia da separação das moléculas será determinada pela 
concentração do polímero, intensidade da voltagem e amperagem aplicadas. 
 
• Géis/polímeros mais “frouxos”, com menor densidade e/ou concentração são usados para 
proteínas e/ou substancias com maior peso molecular; enquanto que géis mais 
densos/concentrados são usados para corrida eletroferética de segmentos de baixo peso 
molecular. 
Eletroforese 
1 - Gel 
2 - Aplicação do marcador 
3 - Aplicação das amostras 
4 - Indução de corrente elétrica 
5 - Deslocamento e separação dos fragmentos 
6-Eletroforese realizada 
http://www.biomedicinabrasil.com/2010/10/eletroforese.html 
Eletroforese em gel de agarose 
• Empregada rotineiramente para separação de ácidos nucléicos. 
 
• Agarose: polímero de elevado custo extraído de algas marinhas. Forma uma rede 
que “segura” as moléculas durante a migração. 
 
• Dependendo [agarose]: tem-se uma diferença no gradiente de separação. 
 
• Qto  [agarose]   capacidade de distinguir fragmentos (ie,  definição). 
 
• Geralmente, os géis de agarose são corados com soluções de brometo de etídio 
(EtBr), (substância intercalante) que revela os ácidos nucléicos ao fluorescer sob 
luz ultravioleta. 
Eletroforese em gel de poliacrilamida 
• Poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros: acrilamida e bisacrilamida. 
 
• Acrilamida: molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T". 
 
• Misturando essas duas moléculas, tem-se a formação de uma "rede". 
 
• Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação 
de diferentes gradientes de separação. 
 
• Preparação: misturar as 2 substâncias formadoras nas concentrações desejadas, 
colocá-las em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que atuam como 
catalizadores da polimerização. 
 
• Identificação dos produtos: pode ser feita pelo brometo de etídio, mas o + mais 
utilizado é o nitrato de prata. 
Ex.: Separação de DNA por eletroforese em gel: 
• Amostras/fitas de DNA obtidos por PCR (multiplicação /clonagem do DNA pela técnica 
do DNA recombinante) são separados por aplicação de uma voltagem. Amostras são 
acondicionadas em poços do gel e submetidas a uma voltagem (campo elétrico). 
 
• Como a carga total do DNA é negativa (pelos oxigênios do grupamento fosfato), no final 
do processo as cadeias de DNA estarão próximas ao polo positivo (vão migrar). 
 
• Amostras de DNA são preparadas e misturadas ao corante gel loading buffer (solução 
composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol. Função:  a densidade 
das amostras (impedindo que elas saiam dos poços) e dar coloração (indicador do 
progresso eletroforético)) 
 
• Amostras são colocadas com pipetas nos poços do gel 
 
• É aplicado voltagem e corrente elétrica ao sistema p/ migração das amostras 
 
• A distância percorrida é comparada com a distância que outros fragmentos de 
tamanhos conhecidos (ladders) percorreram no mesmo gel. 
• Obs.: Fragmentos ladders: são marcadores de peso molecular. São misturas de 
segmentos de DNA de tamanhos variáveis e equidistantes entre si. São aplicados em um 
poço no gel no início do processo. 
Técnicas de separação de Amostras 
 Cromatografia 
Cromatografia 
• Termo: empregado pela 1ª vez em 1906 pelo botânico Mikhail Semenovich Tswett (fez 
separação dos componentes de extratos de folhas) 
• Nesse estudo, a passagem de éter de petróleo (fase móvel) através de uma coluna de vidro 
preenchida com carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se adicionou o extrato, levou à 
separação dos componentes em faixas coloridas. 
• Motivo este pelo nome da técnica: (chrom = cor e graphie = escrita) (mas o processo não 
depende da cor) 
• Técnica praticamente ignorada até a década de 30, quando foi redescoberta. 
• Hoje: está aperfeiçoada, com grande avanço tecnológico e elevado grau de sofisticação   
aplicação em muitas áreas. 
Unidades cromatográficas utilizadas por Tswett 
para a separação de pigmentos de plantas 
Mikhail Semenovich Tswett 
Hoje: a Cromatografia é muito 
utilizada em laboratórios na 
identificação de substâncias 
orgânicas. 
Cromatografia 
• Método físico-químico de separação . 
 
• Fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura. A mistura passa por 2 
fases imiscíveis (e faz diferentes interações): a fase móvel (como um liquido ou um gás, que ajuda 
na separação da mistura) e a fase estacionária (material fixo, poroso como um filtro). 
 
• Técnica extremamente versátil e de grande aplicação (pq há uma  variedade de combinações 
entre fases móveis e estacionárias). 
 
• Os constituintes das misturas interagem com as fases através de forças intermoleculares e iônicas, 
fazendo a separação. 
 
• Pode ser utilizada para: 
 
 * Identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes 
(função analítica) 
 
 * Purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis (função: preparação/ 
separação) 
 
 * Separação dos componentes (nas partes distintas) de uma mistura (função: separação). 
 
 
(Obs.: Existem muitas variações 
e sub-tipos de cromatografia em 
coluna) 
Cromatografia 
por afinidade 
 
 
Cromatografia 
por troca iônica 
 
Adsorção é baseada em uma fase 
estacionaria solida que adsorve (prende) 
certas moléculas em seu meio, da parte 
móvel que deve ser liquida. Essa adsorção 
é devida a certas interações entre os 
constituintes da parte liquida e da solida. 
Cromatografia de partição (separação) se 
dá pela diferença de solubilidade das 
substancias que devem ser liquidas, e sua 
separação se dá com o auxilio de filtros de 
papel ou em colunas como suporte. 
Forma + comum de realizar 
separações biosseletivas. 2ª 
técnica cromatográfica mais 
usada na purificação. Os 
compostos (com afinidade 
pelo ligante) são imobilizados 
em matriz cromatográfica 
mediante ligação (química) 
seletiva reversível do ligante 
com a molécula de interesse 
.Tem alta especificidade . 
A fase móvel é um liquido. 
A fase estacionária possui 
trocadores iônicos – 
polímeros catiônicos ou 
aniônicos) e é um sólido. As 
resinas de trocas iônicas 
são polímeros contendo 
íons ativos quepermutam 
(trocam) reversivelmente 
de posição com outros íons 
do liquido “passante”. 
1) Classificação de acordo com o sistema cromatográfico 
 1.a) Em Coluna 
 * Cromatografia líquida 
 * Cromatografia gasosa 
 * Cromatografia supercrítica 
 1.b) Planar 
 * Centrífuga (Chromatotron) 
 * Cromatografia em camada delgada (CCD) 
 * Cromatografia em papel (CP) 
 
2) Classificação de acordo com a fase móvel 
 2.a) Utilização de gás 
 * Cromatografia gasosa (CG) 
 * Cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR) 
 
 2.b) Utilização de líquido 
 * Cromatografia líquida clássica (CLC) 
 * Cromatografia Lúida de alta eficiência (CLAE) 
 
 2.c) Utilização de gás pressurizado 
 * Cromatografia supercrítica (CSC) 
 
3) Classificação de acordo com a fase estacionária 
 3.a) Líquida 
 3.b) Sólida 
 3.c) Quimicamente ligadas em moléculas polares 
 
4) Classificação de acordo com o modo de separação 
 4.a) Por adsorção 
 4.b) Por partição 
 4.c) Por troca iônica 
 4.d) Por afinidade 
 
Classificação 
das técnicas 
cromatográficas 
(Obs.: Existem muitas variações 
e sub-tipos de cromatografia em 
coluna) 
Agora, estudando cada tipo com mais detalhe... 
Cromatografia 
• Pode ser classificada considerando-se diversos critérios. 
• Ex.: Classificação pela forma física do sistema cromatográfico: 
 
 1) Cromatografia em coluna (Há diversos subtipos de cromatografia em coluna. São melhor 
compreendidos quando classificados por outro critério). 
 
2) Cromatografia planar: somente 3 sub-tipos: 
 * Cromatografia em papel (CP), 
 * Cromatografia por centrifugação (Chromatotron) 
 * Cromatografia em camada delgada (CCD), 
 
Cromatografia planar 
• Cromatografia em papel (CP): 
• Técnica de partição líquido–líquido, estando um deles fixado a um suporte sólido. 
• Baseia-se na diferença de solubilidade das substâncias em questão entre duas fases 
imiscíveis, sendo geralmente a água um dos líquidos. 
• Solvente é saturado em água e a partição se dá devido à presença de água em 
celulose (papel de filtro). 
• Método, embora menos eficiente que a CCD, muito útil para a separação de 
compostos polares, sendo largamente usado em bioquímica. 
 
 
Cromatografia de papel. Separação de tinta de caneta 
Cromatografia Planar: Cromatografia de Extratos Vegetais 
Cromatografia planar 
Cromatografia em camada delgada (CCD) 
 
• Técnica de adsorção líquido–sólido. 
• Separação ocorre pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase 
estacionária. 
• Método simples, rápido, visual e econômico, a CCD é a técnica predominantemente 
escolhida para o acompanhamento de reações orgânicas, sendo também muito utilizada 
para a purificação de substâncias e para a identificação de frações coletadas em 
cromatografia líquida clássica. 
 
2. Classificação pela fase móvel empregada 
• São três os tipos de cromatografia (qto à fase móvel): 
 
2.1) Cromatografia líquida que se subdivide em: 
• Cromatografia líquida clássica (CLC): a fase móvel é 
arrastada através da coluna apenas pela força da 
gravidade 
• Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou 
HPLC): Denominada inicialmente cromatografia 
líquida de alta pressão. Utiliza fases estacionárias de 
partículas menores, sendo necessário o uso de uma 
bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel. 
Cromatografia Líquida Clássica 
2. Classificação pela fase móvel empregada 
• São três os tipos de cromatografia (qto à fase móvel): 
 
2.2) Cromatografia gasosa. Se subdivide em (diferença entre os dois tipos está na 
coluna): 
• Cromatografia gasosa (CG). Utiliza colunas de maior diâmetro empacotadas com a 
fase estacionária 
• Cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). Utiliza colunas capilares, nas quais a 
fase estacionária é um filme depositado na mesma. 
 
 
Cromatografia Gasosa 
2. Classificação pela fase móvel empregada 
• São três os tipos de cromatografia (qto à fase móvel): 
 
2.3) Cromatografia supercrítica (CSC): 
• Usa um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crítica. 
• Utilizações bem especificas 
• Tem vantagens na área compreendida entre a cromatografia gasosa e a 
cromatografia líquida 
• Torna possível, por exemplo, a separação de substâncias não voláteis em colunas 
abertas, visto que um fluído supercrítico reúne a vantagem da alta difusibilidade do 
gás e do alto poder de solvatação do líquido. 
(http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/sfc.htm) 
Cromatografia líquida de 
alta eficiência (CLAE ou HPLC) 
Cromatografia 
por afinidade 
 
 
Cromatografia 
por troca iônica 
 
Adsorção é baseada em uma fase 
estacionaria solida que adsorve (prende) 
certas moléculas em seu meio, da parte 
móvel que deve ser liquida. Essa adsorção 
é devida a certas interações entre os 
constituintes da parte liquida e da solida. 
Cromatografia de partição (separação) se 
dá pela diferença de solubilidade das 
substancias que devem ser liquidas, e sua 
separação se dá com o auxilio de filtros de 
papel ou em colunas como suporte. 
Forma + comum de realizar 
separações biosseletivas. 2ª 
técnica cromatográfica mais 
usada na purificação. Os 
compostos (com afinidade 
pelo ligante) são imobilizados 
em matriz cromatográfica 
mediante ligação (química) 
seletiva reversível do ligante 
com a molécula de interesse 
.Tem alta especificidade . 
A fase móvel é um liquido. 
A fase estacionária possui 
trocadores iônicos – 
polímeros catiônicos ou 
aniônicos) e é um sólido. As 
resinas de trocas iônicas 
são polímeros contendo 
íons ativos que permutam 
(trocam) reversivelmente 
de posição com outros íons 
do liquido “passante”. 
3. Classificação pela fase estacionária utilizada 
• Quanto à fase estacionária: 
• Fases estacionárias sólidas 
• Fases estacionárias líquidas 
• Fases estacionárias quimicamente ligadas. 
 
 4. Classificação pelo modo de separação 
• Por este critério, separações cromatográficas se 
devem à adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou 
misturas desses mecanismos. 
• Para se ter uma visão mais ampla dos diferentes 
tipos de cromatografia: fig 
• Ênfase especial: 
• Cromatografia em camada delgada (CCD) 
• Cromatografia líquida clássica e de alta eficiência 
(CLAE) 
• Cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR).