Métodos de Análise Cromatográfica

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INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS 
INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE 
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO 
Prof. Wendell Coltro 
CROMATOGRAFIA 
Tipos de Métodos de Separação 
1) CLÁSSICOS: precipitação, destilação e extração 
2) INSTRUMENTAIS: cromatografia e eletroforese 
- Tiveram uso intenso até a metade do século XX; 
- Técnicas úteis para amostras com poucos componentes 
(em altas concentrações) e relativamente puras; 
- Porém são pouco seletivas e apresentam baixa sensibilidade. 
- Técnicas “imbatíveis” na separação de amostras multicomponentes; 
- Apresentam alta seletividade e sensibilidade; 
- Sistema “integrado” (análise é feita de modo completo). 
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Introdução a Métodos Cromatográficos 
CROMATOGRAFIA (Definição): técnica analítica (clássica ou 
instrumental) que permite a separação de misturas por interação 
diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA 
(líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). 
A Cromatografia foi inventada (e assim denominada) no início do 
século 20 (1903) pelo botânico russo Mikhail Tswett. Ele empregou a 
técnica para separar vários pigmentos de plantas (como a clorofila e a 
xantofila) passando soluções desses componentes através de uma 
coluna de vidro empacotada com carbonato de cálcio (CaCO3). 
As espécies separadas apareciam como bandas coloridas na coluna, 
daí originando o nome da técnica: 
CROMATOGRAFIA: do grego CHROMA (COR) + GRAPHEIN (ESCREVER) 
EXPERIMENTO DE TSWETT 
PRINCÍPIO BÁSICO DE UMA 
SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA 
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CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EM COLUNA 
Classificação Geral Método Específico F.E. Tipo Equil. 
Cromatografia Líquida (CL) 
(F.M.: líquido) 
Líquido-líquido ou 
partição 
Líquido ads. sólido Partição 
Fase líquido-ligado Esp. org. ligadas sólido Partição 
Líquido-sólido ou 
adsorção 
sólido Adsorção 
Troca iônica Resina de troca iônica Troca iônica 
Exclusão por tamanho Líquido interstícios sólido 
Cromatografia Gasosa (CG) 
(F.M.: gás) 
Gás-líquido Líquido ads. sólido Partição 
Fase gás-ligado Esp. org. ligadas sólido Partição 
Gás-sólido sólido Adsorção 
Cromatografia c/ fluido 
supercrítico (CFS) 
(F.M.: fluido supercrítico) 
 
Esp. org. ligadas sólido Partição 
CARACTERÍSTICAS DE UM PICO GAUSSIANO 
- A eficiência de uma coluna (medida do alargamento da banda de 
um pico) pode ser medida quantitativamente através de duas 
grandezas: 
Quanto maior tR e menor s (ou wb ou wh ), maior será N. 
N é adimensional. 
F 
(1) NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N) 
- N mede a relação entre o tempo de retenção de um pico e a sua 
variância (σ) 
N
t
N
t
w
N
t
w
R R
b
R
h






 





 






s
2
2
2
2
2
2
16 5 54, [7] 
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PRATO TEÓRICO: equivalente a uma etapa 
de equilíbrio entre as duas fases 
PRATO TEÓRICO: equivalente a uma etapa 
de equilíbrio entre as duas fases 
IMPORTÂNCIA DO NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS 
N1 > N2 > N3 
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N=2500 N=1500 
IMPORTÂNCIA DE N NA SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA 
EXEMPLO DE CÁLCULO DE N 
- Assumindo que tR= 5 minutos e wb= 0,5 min (atenção: tR e wb devem 
estar na mesma unidade; N é adimensional!!!) 
- Substituindo-se esses valores na equação de N = ????? 
 (2) ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H): compara 
eficiência de colunas de diferentes comprimentos 
L= comprimento da coluna 
N= número de pratos teóricos da coluna 
- H nos dá o comprimento da coluna que corresponde ao valor de 
um prato. 
H
L
N
 [8] 
- No exemplo anterior de cálculo de N, se considerarmos que a 
análise foi realizada em uma coluna de 30 cm, e sabendo-se que 
N=1600, substituindo-se na equação [8], temos: 
H = 30 cm / 1600 
H = 0,01875 cm 
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INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS 
INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE 
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO 
CROMATOGRAFIA GASOSA 
CROMATOGRAFIA À GÁS (ou GASOSA): CG (“GC”) 
Fase móvel: gás 
Fase estacionária: sólido ou líquido 
X 
CROMATOGRAFIA À GÁS (CG) 
1) Cromatografia gás-sólido: F.M. é um gás; F.E. é um sólido. 
- Retenção dos analitos ocorre por adsorção física; 
- Não tem ampla aplicação (retenção irreversível de analitos); 
- Aplicada a analitos de baixo P.M. e pouco polares (isômeros). 
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CROMATOGRAFIA À GÁS (CG) 
1) Cromatografia gás-sólido: F.M. é um gás; F.E. é um sólido. 
2) Cromatografia gás-líquido: F.M. é um gás; F.E. é um líquido 
adsorvido ou quimicamente ligado a um suporte sólido. 
- Retenção dos analitos ocorre por adsorção física; 
- Não tem ampla aplicação (retenção irreversível de analitos); 
- Aplicada a analitos de baixo P.M. e pouco polares (isômeros). 
- Técnica denominada simplesmente de cromatografia gasosa; 
- Separação dos analitos baseada no fenômeno de partição; 
- Ampla aplicação em todas as áreas da ciência. 
CROMATOGRAFIA GÁS-LÍQUIDO (CGL) ou apenas (CG) 
- F.M. é um gás (não interage com analito); 
- F.E. é um líquido de alto ponto de ebulição adsorvido física ou 
quimicamente a um suporte sólido. 
suporte 
fase líquida 
Gás 
- O fenômeno físico-químico responsável pela interação do analito 
+ F.E. líquida é a ABSORÇÃO. O equilíbrio envolvido no processo 
de eluição do analito da coluna é a PARTIÇÃO do analito entre a 
F.M. (gás) e a F.E. (líquido). 
- A absorção ocorre no INTERIOR da F.E. líquida (fenômeno 
INTRAfacial). 
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1 
2 3 
4 
5 6 
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1. Pressurização da fase móvel 2. Controle de fluxo 
3. Introdução da amostra 4. Forno 
5. Coluna 6. Detector 
7. Aquisição e tratamento dos dados 
COMPONENTES DE UM SISTEMA DE CG 
Estação de gases 
Integrador 
Forno e 
Coluna 
Painel de 
controle 
Injetor 
FOTOGRAFIA DE UM SISTEMA DE CG 
Gás de arraste 
Injetor 
Forno com coluna 
Coluna capilar 
Detector FID 
Integrador 
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Gás de 
arraste 
Injetor Coluna 
Detector 
Registrador 
Tratamento 
de dados 
Aquecido para vaporizar amostra 
Aquecida 
para 
controlar tR 
Aquecido para manter limpo 
COMPONENTES AQUECIDOS EM UM 
SISTEMA DE CG 
AMOSTRAS TÍPICAS ANALISADAS POR CG 
⇒ Gases, líquidos ou sólidos (introduzidos na vapor de vapor); 
⇒ A amostra necessita ser VOLÁTIL; 
⇒ Massa molecular entre 2 e 1000 daltons; 
⇒ Compostos orgânicos ou inorgânicos. 
CROMATOGRAMA TÍPICO 
tempo de retenção 
re
s
p
o
s
ta
 
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SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA: MICROSERINGAS 
Gás arraste 
P/ coluna 
P/ coluna 
Posição de injeção 
da amostra 
Posição de envio da 
amostra para coluna amostra 
“loop” 
injeção 
SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA: 
VÁLVULAS DE INJEÇÃO 
INTRODUÇÃO DE AMOSTRA EM CG: DEVE-SE EVITAR 
INTRODUZIR AMOSTRAS NA FORMA DE “BANDAS LARGAS”!!! 
t = 0 
t = x 
Banda Estreita Banda Larga 
t=0 
t=x 
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Seringa 
Coluna 
Gás de arraste 
Septo 
Bloco aquecido 
Lã de vidro 
INJETOR TÍPICO DE UM SISTEMA DE CG 
MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: “SPLIT” (divisão da amostra) 
p/ coluna 
1 mL/min 
descarte: 100 mL/min 
descarte: 1 mL/min 
Fluxo total: 102 mL/min 
MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: “SPLITLESS” (sem divisão da amostra) 
p/ coluna 
1 mL/min 
descarte: 0 mL/min 
descarte: 1 mL/min 
Fluxo total: 2 mL/min 
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MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: “ON COLUMN” (inj. direta na coluna) 
p/ coluna 
1 mL/min 
descarte: 0 mL/min 
descarte: 0 mL/min 
Fluxo total: 1 mL/min 
MANIPULAÇÃO CORRETA DA SERINGA DE INJEÇÃO 
SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA: 
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) 
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SPME: INTRODUÇÃO DA FIBRA NO SISTEMA DE CG 
SISTEMAS DE DETECÇÃO PARA CG 
- CARACTERÍSTICAS DO DETECTOR IDEAL PARA CG: 
1. Sensibilidade adequada; 
2. Boa estabilidade e reprodutibilidade; 
3. Resposta linear por várias ordens de grandeza; 
4. Suportar altas temperaturas; 
5. Resposta rápida; 
6. Seletivo; 
7. Não destrutivo. 
Nenhum detector apresenta todas as características citadas, 
sendo que sua escolha deve basear-se na finalidade 
analítica, bem comono tipo de amostra a ser analisada. 
Análise Qualitativa usando CG 
- A CG é um excelente método para a confirmar a presença ou 
ausência de um determinado analito em uma amostra (após a 
adição do padrão do composto de interesse, nenhum novo pico 
deve aparecer no cromatograma). 
- Existem basicamente três meios de ser realizar uma análise 
qualitativa utilizando a técnica de CG: 
1. Tempo de Retenção 
2. Métodos Gráficos (Índices) 
3. Métodos Analíticos Auxiliares 
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Tempo de Retenção 
Tempo de Retenção 
Vantagens da CG 
 Elevada resolução 
 Alta velocidade de análise 
 Alta sensibilidade 
 Ótima exatidão 
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OTIMIZAÇÃO DE UMA SEPARAÇÃO POR CG 
- Comprimento da coluna; 
- Diâmetro interno da coluna; 
- Tubulação da coluna; 
- Fase líquida presente na F.E.; 
- Tamanho da amostra (quantidade injetada). 
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS 
INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE 
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (ou a LÍQUIDO) 
(CLAE OU “HPLC”) 
Fase móvel: líquido 
Fase estacionária: sólido ou líquido 
X 
CLAE: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
HPLC: High Performance Liquid Chromatography 
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EFICIÊNCIA DE UMA COLUNA DE CLAE 
Efeito do diâmetro da partícula 
3 µm 
5 µm 
10 µm 
Tamanho da partícula 
Dp (µm) 
tR 
(min) 
No pratos 
(N) 
Pressão 
(bar) 
5,0 30 25000 19 
3,0 18 42000 87 
1,5 9 83000 700 
1,0 6 125000 2300 
Eficiência como função do Dp 
Cromatograma mostrando o efeito da eficiência 
como função do Dp 
- CLAE não pode ser realizada em colunas capilares abertas : problema da 
baixa difusão do soluto na fase móvel líquida. 
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Em quais casos deve-ser usar a CLAE? 
MODOS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA 
1) CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO (LÍQUIDO-LÍQUIDO) 
2) CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (LÍQUIDO-SÓLIDO) 
3) CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA 
4) CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO (OU 
CROMATOGRAFIA EM GEL) 
APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE CLAE 
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Componentes de um sistema de CLAE 
Fotografia de uma sistema de CLAE (1) 
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Fotografia de uma sistema de CLAE (2) 
Componentes de um sistema de CLAE 
Reservatórios de F.M. 
a) Eluição com gradiente 
b) Eluição isocrática 
F.M.: 50:50 (v/v) de 
metanol/H2O durante 
toda a análise. 
F.M.: início 40:60 (v/v) de 
metanol/H2O ; aumento do 
metanol numa razão de 
8%/min. 
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Sistemas de Bombeamento 
- Requisitos para um eficiente sistema de bombeamento: 
1. Geração de pressões de até 6000 psi; 
2. Saída com ausência de pulsos; 
3. Velocidades de fluxo (vazão) variando de 0,1 a 10 mL/min; 
4. Controle e reprodutibilidade relativa de fluxo de 0,5%; 
5. Componentes resistentes a corrosão (aço inox ou teflon). 
Existem 3 tipos de bombas para CLAE: 1) bombas 
recíprocas, 2) bombas do tipo seringa e 
3) bombas pneumáticas 
Sistemas de Injeção de Amostras 
- O método mais utilizado para introdução de amostras em 
CLAE está baseado em alças (em inglês, loop) de 
amostragem que podem ser trocadas de acordo com a 
necessidade analítica (volumes de 5 a 500 µL). 
- Alças de amostragem permitem a introdução de amostras a 
pressões de até 7000 psi com excelente precisão. 
Sistema de alça de amostragem para CLAE 
Posição de Carregamento 
da Amostra (load) 
Posição de Injeção 
(Inject) 
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Colunas para CLAE 
- As colunas para CLAE geralmente são construídas em tubos 
de aço inox. Os custos variam em torno de 200 a 1000 
doláres (ou mais), dependendo do tipo de F.E. 
Coluna típica para CLAE 
Colunas analíticas usadas em CLAE 
Detectores utilizados em CLAE 
- Diferente do que ocorre em CG, em CLAE não existe um 
detector universalmente aplicável, como o FID. 
- O detector ideal em CLAE deve ter as mesmas propriedades 
listadas para os detectores de CG, com exceção do 
fornecimento de resposta em grande intervalo de temperatura. 
- Os detectores usados em CLAE são de dois tipos básicos: 
1) Detectores de propriedades universais: respondem a 
propriedades da F.M. como um todo (ex: índice de refração) 
2) Detectores de propriedades do soluto: respondem a certas 
propriedades do soluto, como absorbância no UV ou 
fluorescência. 
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Principais detectores utilizados em CLAE 
Detectores de Absorbância 
> Volume cela pequeno: 1 a 10 µL 
> L da cela: 2 a 10 mm 
> Cela em “Z”: aumento do 
caminho óptico 
Detectores de Absorbância UV 
1) UV com Filtros 
- São fotômetros, com uma lâmpada de mercúrio como fonte. A linha em 
254 nm (mais intensa) é isolada por filtros. 
- Outras linhas podem ser isoladas: 250, 313, 334 e 365 nm. 
- Esse tipo de detector é restrito a compostos que absorvem radiação 
em tais comprimentos de onda. 
- Fontes de filamento de deutério e de tungstênio com filtros 
apropriados também podem ser úteis para algumas aplicações. 
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1) UV com Monocromadores 
- A maioria dos equipamentos de CLAE vem equipados com um 
espectrofotômetro de varredura com redes ópticas, incluindo a 
radiação UV e Visível. 
- Com esses equipamentos pode-se utilizar-se de diferentes 
comprimentos de ondas (aquele apropriado para cada pico sendo 
eluído da coluna) se os compostos são suficientemente separados 
um do outro. 
- Os detectores espectrofotométricos UV mais poderosos são aqueles 
equipados com arranjo de diodos, que permitem a coleta de dados de 
um espectro inteiro em cerca de 1 segundo. 
Detector de UV com arranjo de diodos para CLAE 
Detectores de Fluorescência 
- O esquema desse tipo de detector é similar aos fluorímetros e 
espectrofluorímetros, com a fluorescencia sendo observada 
perpendicularmente ao eixo de excitação. 
- Os detectores mais simples usam uma fonte de mercúrio com um ou 
mais filtros para isolar a bande de emissão de radiação. 
- A grande vantagem dos detectores de fluorescência está na sua alta 
sensibilidade. 
- Detectores de fluorescência são utilizados em CLAE na análise de 
compostos farmacêuticos, produtos naturais e produtos do petróleo. 
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Detectores de Índice de Refração 
- Esse tipo de detector tem a vantagem de responder a quase todos os 
analitos. As desvantagens incluem sua alta sensibilidade a mudanças 
de temperatura e a sua baixa sensibilidade de detecção. 
Esquema de um detector de índice de refração diferencial 
Detectores Eletroquímicos 
- São baseados nos fenômenos de amperometria, polarografia, 
coulometria e condutometria. Sendo que o mais utilizado baseia-se 
na amperometria (simplicidade). 
Grupos funcionais detectáveis por amperometria 
Cela de um detector amperométrico para CLAE 
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MODOS DE OPERAÇÃO EM CLAE 
MODOS DE OPERAÇÃO EM CLAE 
Cromatografia de Partição 
- Pode ser subdividida em: cromatografia líquido-líquido e cromatografia 
de fase ligada. 
- Cromatografia líquido-líquido: a F.E. líquida é adsorvida fisicamente 
sobre a superfície de um suporte sólido. 
- Cromatografia fase ligada: a F.E. é quimicamente ligada sobre a 
superfície de um suporte. 
Colunas para Cromatografia de Fase Ligada 
- A grande maioria dos suportes para F.E. utilizados em CLAE são 
preparados à base de sílica. 
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- Os recobrimentos mais utilizados como fase ligada são siloxanos 
formados por reação da superfície hidrolisada da sílica com um 
organoclorossilano: 
- A cobertura por silanização está limitada a 4 µmol/m2 devido a efeitos 
estéricos. Para desativar os grupos SiOH restantes faz-se umareação 
com trimetilcloro-silano (processo chamado endcapping). 
Cromatografia de Fase Ligada: Fase Normal e Fase Reversa 
- A subdivisão da cromatografia de fase ligada em fase normal e fase 
reversa está baseada na polaridade relativa das fases móvel e 
estacionária. 
CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL 
- Nesse modo de cromatografia, a F.E. é polar e a F.M. é não-polar. 
- Em cromatografia de fase normal, a F.E.tem caráter polar 
(sintetizada a partir da sílica com grupos funcionais polares): 
Fase estacionária polar (sílica, NH2, CN) 
Fase móvel apolar 
(Hexano, diclorometano) 
Analito mais apolar Analito mais polar 
 amostra 
- Em cromatografia de fase normal, os analitos polares tem maior 
afinidade pela F.E. (polar) e, portanto, ficam mais retidos na coluna e 
são os últimos a serem eluídos da coluna: 
- A F.M. não contém água. Os solventes mais comumente utilizados 
são: hexano e diclorometano. Um solvente e característica polar 
(como metanol) pode ser usado em pequenas proporções para dar 
seletividade a F.M. na eluição de analitos mais polares. 
- A cromatografia de fase normal é mais utilizada na análise de 
compostos lipofílicos: óleos, gorduras, lípidios. 
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CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA 
- Nesse modo de cromatografia, a F.E. é não-polar e a F.M. é polar. 
- Em cromatografia de fase reversa, a F.E. tem caráter apolar 
(sintetizada a partir da sílica com grupos funcionais apolares): 
Octadecil (C18) 
Octil (C8) 
- Em cromatografia de fase reversa, os analitos apolares tem maior 
afinidade pela F.E. (apolar) e, portanto, ficam mais retidos na coluna 
e são os últimos a serem eluídos: 
Área intersticial (F.M.) Suporte da partícula Fase ligada 
(A) – analito mais polar 
(B) – analito menos polar 
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Fase estacionária apolar (C8, C18) 
Fase móvel polar 
(metanol, acetonitrila, água) 
amostra 
Analito mais apolar Analito mais polar 
- A F.M. contém água. Os solventes mais comumente utilizados são: 
metanol e acetonitrila. A força de eluição para os analitos é dada pela 
proporção do solvente orgânico. A proporção de água na F.M. é utilizada 
para controlar o processo de retenção dos analitos. 
- Fase Reversa é o modo de CLAE mais utilizado (em cerca de 75% dos 
métodos). Pode ser utilizado na separaç ão de compostos não iônicos, 
polares, até a compostos de polaridade intermediária. 
separação rápida 
separação lenta 
separação muito 
lenta 
Efeito do Solvente em Fase Reversa 
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Efeito do Tamanho do Cadeia sobre a Eficiência 
de Separação 
Fase Normal x Fase Reversa: tempos de eluição 
para uma mistura de compostos 
Desenvolvimento de Métodos em Cromatografia de 
Partição (Fase Normal e Fase Reversa) 
Seleção da Coluna 
- A polaridade da F.E. da coluna deve ser combinada de maneira próxima 
com a polaridade dos analitos a serem separados. A F.M. (de polaridade 
diferente) é usada para eluição. 
- Polaridade dos analitos: hidrocarbonetos Isso pode ser feito variando-se a proporção dos solventes 
utilizados na F.M. 
> Isso pode ser feito mudando-se a composição dos solventes 
usados na F.M. 
APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO 
- A cromatografia de partição, mais especificamente a cromatografia em 
fase reversa, aproxima-se de um sistema universal ideal para a 
cromatografia líquida devido à sua ampla aplicabilidade e facilidade de 
manipulação dos fatores k e α quando se utiliza uma fase móvel aquosa.