Microscopia eletrônica

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Microscopia Eletrônica
Histórico e Noções de Microscopia
• Janssens (1590) - Inventou a lente de vidro
• Antonie Van Leeuwenhoek – Desenvolveu o microscópio
• Abbe e Helmholtz (1873) – Imaginaram o microscópio eletrônico
• Knoll e Ruska (1932) – desenvolveram o primeiro microscópio 
eletrônico
• Marton (1934) – publicou a primeira elétron-micrografia de tecido 
biológico
• van Ardenne (1938) – construiu o primeiro microscópio eletrônico 
de varredura
• 1938-39 – Primeira versão de ME comercial (Siemens)
• 1941-1963 – evolução do ME, da resolução de 0,2 µm para 0,2 nm 
no MET e 10 nm no MEV
• 1958 – Primeiro ME de varredura usado para biologia
• Rohrer e Binning (1982) ME de tunelamento
Princípios da microscopia de Luz
Limite de resolução
Microscópio de Luz:
LR = k x λ / AN
LR = 0,61 x 0,55 / 1,25
LR = 0,27
Variações do microscópio de Luz
• Microscópio por transiluminação
• Microscópio por retroiluminação
• Microscópio de contraste de fase
• Microscópio de polarização
• Microscópio de fluorescência
• Microscópio confocal
Processamento de material para ML
• Fixação
• Desidratação
• Diafanização
• Impregnação
• Inclusão
• Corte
• Coloração
Microscópio Eletrônico
ME Transmissão
Resolução do MET
Limite de resolução LR = k x λ / AN
MET
MET
Câtodo (Filamento) e ânodo
Alinhamento do feixe
Astigmatismo
Processamento do material para 
MET
Coleta e Fixação do material
Fixação por imersão e por perfusão
Fixador de Karnovsky
Fixação em forno micro-ondas
•Menor tempo de fixação
•Melhor retenção de lípides
•Melhor retenção de proteínas solúveis
•Melhor preservação da reatividade antigênica
•Menor tempo para inclusão 
•Menor tempo para contrastação
Fixação em forno micro-ondas
• Não ultrapassar o tempo de 30 a 60s
• Não ultrapassar a temperatura de 50 a 
60ºC
• Fragmentos muito pequenos
• Não deixar o fragmento parado
• Colocar um recipiente de água no interior 
do forno
Fixação por congelamento
• Utilizado somente quando é necessário fixar todas as 
moléculas no local de maneira mais natural possível
• Utilizado somente com espécimes muito pequenos ou 
finos (virus, partículas subcelulares, ou no máximo 
fragmentos de até 2µm de espessura)
• Variações:
-imersão em nitrogênio líquido
-Contato com metal utra-gelado
-Jato de propano gelado
-Congelamento em alta pressão
Pós-fixação
Tetróxido de ósmio 1%
•Fixador secundário
•Reage com lípides insaturados
•Retem elétrons (contrastante)
•Solúvel em solvente polares e apolares
•Penetra 0,5mm por hora
Desidratação
• Concentração crescente de álcool
• Concentração crescente de acetona (absorve 
água da atmosfera e é mais solvente de lípides
Solvente intermediário
• Óxido de propileno
Infiltração ou impregnação
• Epon (Epon 812, araldite)
• Spurr (di-epoxido, usada para tecidos 
duros)
• LR White (resina acrílica hidrofílica usada 
para imunohistoquímica e citoquímica
Polimerização (inclusão)
Formas para inclusão
Processamento de frações celulares 
ou células em suspensão
• Centrifugar e processar o “pellet” como se fosse 
um órgão. O glutaraldeído vai estabilizar o 
“pellet”
• Centrifugar e descartar o sobrenadante. Fixar 
suspendendo o “pellet” em solução fixadora. 
Centrifugar e descartar o sobrenadante. Misturar 
com agar ou agarose (45°C) 2%. Deixar 
endurecer em tmperatura ambiente e cortar o 
agar em fragmentos. Processar como se fosse 
tecido
Processamento de células em 
cultura
• Pode ser feito a liberação das células com 
tripsina ou “scrape” e processar a suspensão 
obtida como anteriormente descrito
• Fazer todos os processos (de desidratação até 
inclusão) no frasco (não pode ser de polietileno, 
pode ser polipropileno)
• Lâminas e lamínulas podem ser processadas e 
no momento da inclusão estas são apoiadas 
sobre forma (cápsula Beem) contendo resina. 
Após polimerização retirar a lâmina
Ultramicrotomia
• Desbaste ou trimagem
• Corte semi-fino (1 µm)
• Ultramicrotomia
• Seleção de cortes
Desbaste
Corte semi-fino
Ultramicrotomia
Seleção dos cortes
Contrastação
• Contrastação positiva
-acetato de uranila 2% (reage com fosfato, 
aminas, ácidos nucléicos e algumas proteínas)
-citrato de chumbo (reage com cargas negativas 
das hidroxilas, áreas reativas a ósmio e com 
fosfato quando utilizado tampão fosfato)
-uranila e chumbo em solução alcoólica: Spurr
Artefatos de contrastação
Contrastação
• Pré-contrastação positiva
-acetato de uranila 0,5 a 2% en bloc 
(propriedades de fixação de lípides?)
• Contrastação negativa
Contrastação (coloração) negativa
Coloração negativa
Coloração negativa
“Evaporação metálica”
Réplica
Crio-fratura